污水和污泥中12種典型抗生素的同時檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種污水和污泥中12種典型抗生素的同時檢測方法，包括：對污泥進行冷凍干燥，研磨過篩取樣，加替代物，加入甲醇和Na2EDTA?McIlvaine緩沖液，混勻超聲離心提取上清液，將重復三次提取的上清液合并后用超純水定容，調節pH為3.0；抽濾水樣，用超純水稀釋并調節pH為3.0，加入替代物和Na2EDTA·2H2O，放置一個小時；固相萃取采用SAX?HLB串聯系統，用甲醇、超純水和酸性超純水活化，然后上柱、淋洗、甲醇洗脫；洗脫液氮吹復溶，用優化好的液質參數定量。本發明優化的超聲萃取、固相萃取、液質聯用技術能實現復雜基質中抗生素的有效提取和準確定量，可應用于廣泛的污水和污泥樣品的測定。
【專利說明】
污水和污泥中12種典型抗生素的同時檢測方法
技術領域
[0001] 本發明涉及抗生素的檢測分析領域，具體涉及污水和污泥中12種典型抗生素的同 時檢測方法。
【背景技術】
[0002] 抗生素作為一種新型污染物廣泛出現在地表水、地下水、土壤甚至飲用水中，盡管 濃度水平較低(通常為ng/L~yg/L或yg/kg~mg/kg)，仍可能會對敏感性生物產生急性或慢 性的毒害作用。抗生素持續排放形成的選擇性壓力，還會導致抗性細菌和抗性基因的產生， 該類基因片段一旦轉移進入致病菌，會嚴重損害抗生素類藥物對人類和動物感染的治療潛 力。污水廠是環境中抗生素的重要來源，被生物體攝入但未被吸收的抗生素會隨著排泄物 進入污水廠，因而污水和污泥中會存在一定濃度水平的抗生素。
[0003] 鑒于污水和污泥中抗生素類藥物的濃度水平較低，屬于微量有機污染物，且污水 和污泥中基質成分復雜，一般的檢測手段難以滿足要求，因此有必要建立新的具有高靈敏 度、高特異性的前處理和檢測方法，實現該類復雜基質中微量抗生素的準確定量，以供進一 步的研究分析。
[0004] 針對微量抗生素的檢測技術，常用的有液相色譜檢測技術，包括高效液相色譜-紫 外吸收檢測技術、高效液相色譜-熒光檢測技術和液相色譜串聯質譜檢測技術，酶聯免疫吸 附測定法和生物傳感器技術，其中液相色譜串聯質譜的檢測技術靈敏度高、檢出限低、穩定 性強，因此優選該技術用于分析檢測。另外，超高效液相色譜與液相色譜相比，靈敏度和分 辨率更高，分析速度更快。對水相中抗生素的富集可采用冷凍干燥法和固相萃取技術，固相 萃取技術得出的檢測限更低，方法更可靠。對吸附態抗生素的提取可采用超聲萃取和加壓 溶液萃取的方法，兩者的回收率相當，但是超聲萃取可同時處理多個樣品，因而更方便快 捷。富集后的抗生素的濃縮方法有旋轉蒸發和氮吹濃縮，相較于旋轉蒸發，氮吹濃縮耗時較 長，但目標物回收率較高且穩定。通過對各個步驟應用技術的比選可以初步制定污水和污 泥中抗生素的提取、富集、濃縮和檢測的方案，但針對不同的水質特點和目標物特性，仍要 進行具體操作條件的優化。
[0005] 目前針對污水和污泥中抗生素的檢測方法多用于污水廠進出水及好氧污泥的檢 測，而對于厭氧反應器，如厭氧消化池中污水和污泥，尚未形成成熟的抗生素檢測方法。由 于厭氧反應器中有機化合物種類較多，濃度較高，對抗生素一類微量污染物的檢測干擾較 為明顯，因此需要對厭氧反應器中的污水和污泥的抗生素檢測方法進行優化，得出可普遍 適用于污水廠各種污水和污泥的抗生素檢測方法。目前針對污水中抗生素檢測的方法一般 采用HLB小柱進行固相萃取(張金，宗棟良，常愛敏，等.水環境中典型抗生素 SPE-UPLC-MS/ MS檢測方法的建立[J].環境化學，2015,34(8) :1446-1452)，如果用于厭氧反應器中污水的 抗生素檢測，容易使較多有機干擾物截留在HLB小柱內，影響抗生素的檢測準確性，因此需 要優化萃取過程，盡可能減少有機雜質的干擾。目前針對污泥中抗生素的檢測方法一般采 用超聲萃取(Yuan XJ，Qiang ZM，Ben ffff.Rapid detection of multiple class pharmace Uticals in both municipal wastewater and sludge with ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry[J].Journal of Environmental Sciences，2014,26(9) :1949-1959),但超聲條件尚未形成統一的參數，而且提取液的成分 和用量方面還需要進一步優化。
【發明內容】
[0006] 本發明針對復雜的污水和污泥基質中微量的抗生素污染物，提出一種污水和污泥 中12種典型抗生素的同時檢測方法，該檢測方法靈敏度高、分辨率高、回收率高且可應用于 污水廠各種污水和污泥樣品的檢測分析。
[0007] 本發明提出的一種污水和污泥中12種典型抗生素的同時檢測方法，包括以下步 驟：
[0008] 步驟一、取一定量的污泥預凍后冷凍干燥24h，研磨過篩后稱取lg干污泥，將該干 污泥放入50mL的塑料離心管中，加入100yL質量體積濃度為lmg/L的 13C3-咖啡因作為替代 物；
[0009] 步驟二、向上述塑料離心管中加入7.5mL的甲醇和7.5mL且pH為4.0的Na2EDTA-Mcl 1 vaine緩沖液，混勾振蕩lmin，超聲萃取15min，4000rpm離心5min，取出上清液，備用，再 重復兩次上述操作；
[0010] 步驟三、合并步驟二獲得的上清液，并用超純水定容到500mL，然后用濃鹽酸調節 pH為3.0，獲得污泥的稀釋樣品；
[0011]步驟四、取1〇〇~500mL的污水水樣，用0.7μπι的玻璃纖維濾膜進行過濾，超純水稀 釋到1000mL，用濃鹽酸調節pH值為3.0,加入100yL質量體積濃度為lmg/L的13C3-咖啡因作為 替代物，加入〇.5g Na2EDTA · 2H20,放置一個小時，間歇振蕩以保持Na2EDTA · 2H20的溶解狀 態，完成污水水樣的前處理；
[0012] 步驟五、將步驟三獲得的污泥的稀釋樣品和經過步驟四前處理后的污水樣品分別 進行固相萃取，用SAX-HLB小柱串聯系統進行污水樣品和污泥的稀釋樣品的固相萃取，所述 固相萃取的過程是：依次用6mL甲醇、6mL超純水和6mL pH為3.0的超純水進行活化，以5mL/ min的流速上柱，拆掉SAX小柱后用5mL的超純水淋洗HLB小柱，最后用8mL的甲醇洗脫得到洗 脫液；
[0013] 步驟六、將步驟五得到的洗脫液在40°C水浴條件下，氮吹至其中的溶劑完全揮發， 加入內標物，再用lmL的10%乙腈+90%0.3%甲酸溶液復溶，得到檢測樣品；
[0014] 步驟七、分別以乙腈和0.3%甲酸溶液為流動相，利用超高效液相色譜串聯質譜儀 對檢測樣品進行12種目標抗生素的定量分析。
[0015] 進一步講，步驟二中的超聲萃取所采用的功率密度為0. lW/mL。
[0016] 步驟二中的超聲萃取是在冰浴中進行。
[0017] 步驟七中，對檢測樣品進行12種目標抗生素的定量分析中，超高效液相色譜串聯 質譜儀的工作參數如下：
[0018] 色譜參數包括:脫溶劑氣溫度為450 °C，脫溶劑氣流量為900L/Hr，錐孔氣流速為 50L/hr，柱溫為40°C ;檢測時長10min;流動相梯度如下：
[0020] 質譜參數包括：質譜掃描分三個通道，包括0-3.7min，3.7-5.5min和5.5-10min，上 述三個通道分別對應的駐留時間依次為0.019s，0.063s和0.097s。
[0021 ]與現有技術相比，本發明具有如下優點：
[0022] (1)本發明的十二種目標物分屬于四個不同的抗生素類別，結構、性質各有不同， 但在本方法中，針對高有機質濃度的厭氧污水和污泥，同時可以得到準確定量分析。
[0023] (2)污水廠實際水樣中目標物濃度波動很大，在本方法中首先采用稀釋的方法減 小復雜基質的影響（一般稀釋到溶解性化學需氧量SC0D值低于100mg/L)，并在固相萃取過 程中，采用SAX-HLB小柱串聯系統進行萃取，進一步降低萃取和檢測過程中的雜質干擾，方 法的線性范圍可達三個數量級，滿足污水廠各種污水和污泥中抗生素的定量需求。
[0024] (3)污水廠污泥中的抗生素主要是以吸附態存在，在超聲萃取過程中，既要保證充 分解吸到提取液中，又要避免抗生素發生降解，因此在處理過程中采用較小的功率密度 (0.1W/mL)，并加入冰浴;采用優化的提取液成分和用量，提高萃取效果。
【具體實施方式】
[0025]本發明污水和污泥中12種典型抗生素的同時檢測方法的基本原理是:將冷凍干燥 好的污泥與提取液充分混合，并置于超聲環境中，通過超聲過程中形成空化氣泡的機械剪 切力作用，使吸附態的抗生素從污泥表面解吸下來，溶于提取液中。這個過程受到超聲強度 和提取液極性、pH值的影響，既要保證充分解吸，又要避免抗生素發生降解，因此在處理過 程中采用較小的功率密度(0. lW/mL)，并加入冰浴；用甲醇和Na2EDTA-MCIlvaine緩沖液(pH 4.0)按1:1的比例作提取液。
[0026]采用SAX-HLB小柱串聯系統做固相萃取，強陰離子交換柱SAX，可以結合帶負電性 的腐殖酸，降低萃取和檢測過程中的雜質干擾。HLB小柱是由親脂性二乙烯苯和親水性N-乙 烯基吡咯烷酮兩種單體按一定比例聚合成的大孔聚合物，通過特殊的極性捕獲基團增加對 極性物質的保留。通過對pH值的優化，保證SAX小柱不吸附目標物，盡可能吸附腐殖酸等雜 質；對洗脫液的體積和極性進行優化，保證HLB小柱上吸附的目標物能被完全洗脫。對超高 效液相色譜串聯質譜檢測系統的優化主要是對質譜檢測參數的優化和色譜分離效果的優 化，保證達到一定的分離度和分辨率，使得儀器能在較大的范圍內保證線性和準確性。
[0027] 下面結合具體實施例對本發明技術方案作進一步詳細描述，所描述的具體實施案 例僅用于解釋本發明，并不用于限定本發明。
[0028] 試驗例，以實驗室中的厭氧消化污泥為例，厭氧消化的消化液水樣為污水水樣，利 用本發明方法進行12種典型抗生素的同時檢測，檢測儀器選用Waters ACQUITY TQD，檢測 步驟如下：
[0029] 步驟一、取某污水廠的濃縮污泥進行厭氧消化，將消化污泥放入錫箱紙中包好避 光放入-20 °C冰箱中預凍24h，完全凍實后取出放入冷凍干燥機中冷凍干燥24h，過程注意避 光。將冷凍干燥好的樣品研磨過篩，并稱取lg干污泥，放入50mL的塑料離心管中，加入100yL 質量體積濃度為lmg/L的13C3-咖啡因替代物。
[0030] 另外，為了測定本試驗例的回收率制備出加標泥樣，其制備過程是在上述步驟一 的基礎上，再加入l〇〇yL lmg/L的混合物標準液，最終制得本試驗例的加標泥樣。
[0031] 步驟二、向上述塑料離心管中加入提取液，提取液為7.5mL的甲醇和7.5mL且pH為 4.0的Na2EDTA-McIlvaine緩沖液，混勻振蕩lmin，超聲萃取15min，超聲時的功率密度約為 〇. W/mL，再在4000rpm條件下離心5min，將上清液倒入棕色容量瓶中，離心出的污泥再加提 取液重復提取兩次。
[0032] 步驟三、合并三次操作的上清液，最后用超純水稀釋到500mL，用濃鹽酸調節pH值 為3.0，從而獲得污泥的稀釋樣品。
[0033] 步驟四、由于本試驗例中控制稀釋后污水水樣的SC0D值約為100mg/L，而測定污水 水樣的SC0D值為919mg/L，因此，本試驗例中取100mL的污水水樣，將該污水水樣過0.7μπι的 玻璃纖維濾膜，玻璃纖維濾膜可以避免對目標物抗生素的吸附，再用超純水稀釋到l〇〇〇mL， 用濃鹽酸調節pH值為3.0，加入100yL質量體積濃度為lmg/L的 13C3-咖啡因作為替代物，加入 0.5g Na2EDTA · 2H20,放置一個小時，間歇振蕩以保持Na2EDTA · 2H20的溶解狀態，以保證絡 合反應的進行，至此，完成污水水樣的前處理。
[0034]另外，為了測定本試驗例的回收率制備出加標水樣，其制備過程與上述步驟四的 過程基本相同，不同僅在于，在加入替代物的同時再加入l〇〇yL質量體積濃度為lmg/L的混 合物標準液，最終制得本試驗例的加標水樣。
[0035]步驟五、將步驟三獲得的污泥的稀釋樣品和經過步驟四前處理后的污水樣品分別 進行固相萃取，用SAX-HLB小柱串聯系統進行污水樣品和污泥的稀釋樣品的固相萃取，所述 固相萃取的過程是:依次用6mL甲醇、6mL超純水和6mL pH為3.0的超純水進行活化，活化過 程中要保證柱子不能干燥，上柱的流速控制在5mL/min。拆掉SAX小柱后用5mL的超純水淋洗 HLB小柱，主要是淋洗掉鹽類，避免對檢測儀器造成損害，真空抽干30min，最后用8mL的甲醇 洗脫得到洗脫液。
[0036]步驟六、將步驟五得到的洗脫液在40°C水浴條件下，氮吹至其中的溶劑完全揮發， 加入內標物，再用lmL的10%乙腈+90%0.3%甲酸溶液復溶，得到檢測樣品；
[0037]步驟七、分別以乙腈和0.3%甲酸溶液為流動相，利用檢測儀器用對檢測樣品進行 12種目標抗生素的定量分析，其中，檢測儀器的工作參數如下：
[0038] 色譜參數包括:脫溶劑氣溫度為450 °C，脫溶劑氣流量為900L/Hr，錐孔氣流速為 50L/hr，柱溫為40°C ;檢測時長10min;流動相梯度如表1所示：
[0041 ] 質譜參數包括：質譜掃描分三個通道，包括0-3.7min，3.7-5.5min和5.5-10min，上 述三個通道分別對應的駐留時間依次為0.019s，0.063s和0.097s。
[0042] 根據目標物抗生素的特性，本試驗例中檢測儀器的質譜條件如表2所示。
[0043] 表 2
[0044]
[0046] 每次測樣之前都要重復進同一濃度水平的標準樣品，檢查重現性，包括保留時間 的重現性和峰形的重現性，并且最好每次都做一條標準曲線，保證定量準確。本試驗例的12 種抗生素的標準曲線及相關系數如表3所示。
[0047] 表 3
[0048]
[0049] 將加標水樣和加標泥樣扣除空白樣品的濃度值，求得在該基質條件下的加標回收 率，如表4所示。后續進行了多次實驗驗證，數據結果顯示回收率保持在比較穩定的水平。
[0050] 表 4
[0053] 表4中，污水加標水平為lyg/L，污泥加標水平為100yg/kg。
[0054] 根據表3得到的12種抗生素的線性方程和相關系數，本發明中的線性相關系數達 到0.99以上，線性范圍為1~1000yg/L，檢出限較低，定量結果準確，且能測定較大濃度范圍 的樣品。表4中污泥和污水中的加標回收率為32.98 %~133.38 %，能夠實現樣品中抗生素 的有效提取和檢測。因此，上述結果綜合表示本發明方法具備較優的檢測性能，可應用于廣 泛的污水和污泥樣品的測定。
[0055] 盡管上面對本發明進行了描述，但是本發明并不局限于上述的【具體實施方式】，上 述的【具體實施方式】僅僅是示意性的，而不是限制性的，本領域的普通技術人員在本發明的 啟示下，在不脫離本發明宗旨的情況下，還可以做出很多變形，這些均屬于本發明的保護之 內。
【主權項】
1. 污水和污泥中12種典型抗生素的同時檢測方法，其特征在于，包括w下步驟： 步驟一、取一定量的污泥預凍后冷凍干燥24h，研磨過篩后稱取Ig干污泥，將該干污泥 放入50mL的塑料離屯、管中，加入10化L質量體積濃度為Img/L的"C3-咖啡因作為替代物； 步驟二、向上述塑料離屯、管中加入7.5mL的甲醇和7.5mL且pH為4.0的NasEDTA- Mcllvaine緩沖液，混勻振蕩Imin，超聲萃取15min，4000巧m離屯、5min，取出上清液，備用，再 重復兩次上述操作； 步驟Ξ、合并步驟二獲得的上清液，并用超純水定容到500mL，然后用濃鹽酸調節pH為 3.0,獲得污泥的稀釋樣品； 步驟四、取100~500mL的污水水樣，用0.7皿的玻璃纖維濾膜進行過濾，超純水稀釋到 lOOOmL，用濃鹽酸調節抑值為3.0，加入10化L質量體積濃度為Img/L的1化3-咖啡因作為替代 物，加入〇.5g Na2抓TA · 2此0,放置一個小時，間歇振蕩W保持化2EDTA · 2此0的溶解狀態， 完成污水水樣的前處理； 步驟五、將步驟Ξ獲得的污泥的稀釋樣品和經過步驟四前處理后的污水樣品分別進行 固相萃取，用SAX-HLB小柱串聯系統進行污水樣品和污泥的稀釋樣品的固相萃取，所述固相 萃取的過程是:依次用6mL甲醇、6mL超純水和6mL pH為3.0的超純水進行活化，W5mL/min的 流速上柱，拆掉SAX小柱后用5mL的超純水淋洗HLB小柱，最后用8mL的甲醇洗脫得到洗脫液； 步驟六、將步驟五得到的洗脫液在40°C水浴條件下，氮吹至其中的溶劑完全揮發，加入 內標物，再化址的10%乙臘+90%0.3%甲酸溶液復溶，得到檢測樣品； 步驟屯、分別W乙臘和0.3 %甲酸溶液為流動相，利用超高效液相色譜串聯質譜儀對檢 測樣品進行12種目標抗生素的定量分析。2. 如權利要求1所述污水和污泥中12種典型抗生素的同時檢測方法，其特征在于，步驟 二中的超聲萃取所采用的功率密度為0.1 W/mL。3. 如權利要求1所述污水和污泥中12種典型抗生素的同時檢測方法，其特征在于，步驟 二中的超聲萃取是在冰浴中進行。4. 如權利要求1所述的污水和污泥中12種典型抗生素的同時檢測方法，其特征在于，步 驟屯中，對檢測樣品進行12種目標抗生素的定量分析中，超高效液相色譜串聯質譜儀的工 作參數如下： 色譜參數包括:脫溶劑氣溫度為450°C，脫溶劑氣流量為90化/Hr，錐孔氣流速為50L/ 虹，柱溫為40°C ;檢測時長lOmin;流動相梯度如下：質譜參數包括:質譜掃描分Ξ個通道，包括0-3.7min，3.7-5.5min和5.5-lOmin，上述Ξ 個通道分別對應的駐留時間依次為0.019s，0.063s和0.097s。
【文檔編號】G01N30/06GK106093220SQ201610373937
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年5月30日
【發明人】李茹瑩, 張翔宇, 周佳虹
【申請人】天津大學