一種羥基磷灰石基電化學探針構建方法和測定bace1活性以及抑制性的方法
【專利摘要】本發明公開了一種羥基磷灰石基電化學探針及其構建方法和測定BACE1活性以及抑制性的方法；羥基磷灰石基電化學探針由Aβ抗體和堿性磷酸酯酶共同修飾在羥基磷灰石基體上構成；其制備方法是將羥基磷灰石納米顆粒依次置于聚乙烯亞胺溶液中反應，置于戊二醛溶液中反應，以及置于含Aβ抗體和堿性磷酸酯酶的溶液中反應，即得；該羥基磷灰石基電化學探針用于檢測BACE1活性以及抑制性的方法，具有簡單、快速，靈敏度高、檢測范圍寬的優點，可以廣泛推廣應用。
【專利說明】
一種羥基磷灰石基電化學探針構建方法和測定BACE1活性以及抑制性的方法
技術領域
[0001]本發明涉及一種電化學探針，特別涉及一種用于測定BACEl活性以及抑制性的分子探針，具體涉及一種羥基磷灰石基電化學探針的構建方法和羥基磷灰石基電化學探針用于測定BACEl活性以及抑制性的方法，屬于生物傳感技術領域。
【背景技術】
[0002]近年來對老年癡呆的研究表明，β-淀粉樣肽(Αβ肽)在大腦中的聚集是導致老年癡呆的主要原因之一。Αβ肽在生物體內產生主要是通過β-分泌酶(例如淀粉蛋白前β位分解酶，BACEIWp γ分泌酶水解β-樣前體蛋白(APP)而產生。在生物體內，β-分泌酶的活性對Αβ肽的產生起到決定性作用。抑制分泌酶的活性可以減少Αβ肽的產生，從而緩解老年癡呆癥的形成和治療老年癡呆癥。因此，測定BACEl的活性及篩選BACEl抑制劑在生物醫學診斷以及酶靶藥物開發等領域激起了人們的興趣。
[0003]傳統測定BACEl的方法主要包括熒光能量共振轉移法，主要是基于在多肽兩端聯上兩個不同的熒光素基團，在兩個基團之間產生能量轉移。但傳統的方法任存在操作繁瑣、靈敏度較低等問題。因此，開發快速、簡便、經濟和靈敏度高的BACEl活性檢測及高通量篩選抑制劑方法是非常必要的。
【發明內容】
[0004]針對現有技術的缺陷，本發明的目的是在于提供一種由Αβ抗體和堿性磷酸酯酶同時修飾在羥基磷灰石上構成的電化學探針，適應于快速、準確、高靈敏測定BACEl活性以及抑制性。
[0005]本發明的第二個目的是在于提供一種簡單、快速、經濟構建所述羥基磷灰石基電化學探針的方法。
[0006]本發明的第三個目的是在于提供一種基于羥基磷灰石基電化學探針檢測BACEl活性以及抑制性的方法，該方法具有簡單、快速，靈敏度高、檢測范圍寬的優點，可以廣泛推廣應用。
[0007]為了實現上述技術目的，本發明提供了一種羥基磷灰石基電化學探針，該羥基磷灰石基電化學探針由Αβ抗體和堿性磷酸酯酶共同修飾在羥基磷灰石基體上構成。
[0008]本發明還提供了一種構建所述的羥基磷灰石基電化學探針的方法，該方法是將羥基磷灰石納米顆粒依次置于聚乙烯亞胺溶液中反應，置于戊二醛溶液中反應，以及置于含Aβ抗體和堿性磷酸酯酶的溶液中反應，即得。
[0009]優選的方案，包括以下步驟:
[0010]I)將羥基磷灰石納米顆粒按0.5?2mg/mL的比例分散在濃度為0.5?5%的聚乙烯亞胺溶液中，反應I?2小時后，進行離心分離I;
[0011]2)離心分離I所得顆粒產物分散在濃度為0.1?1?1%的戊二醛溶液中，反應30?60分鐘后，進行離心分離II;
[0012]3)離心分離II所得顆粒產物分散在含有Αβ抗體和堿性磷酸酯酶的溶液中，反應I?3小時后，進行離心分離III，即得羥基磷灰石基電化學探針；
[0013]所述的含Αβ抗體和堿性磷酸酯酶的溶液中Αβ抗體的濃度為0.1?lOyg/mL，堿性磷酸酯酶的濃度為I?I Oyg/mL。
[0014]本發明還提供了一種所述的羥基磷灰石基電化學探針用于測定BACEl活性的方法，該方法包括以下步驟:
[0015]a)在表面修飾有多肽的金電極的表面依次滴加BACEl溶液反應，滴加羥基磷灰石基化學探針溶液反應，滴加焦磷酸鈉溶液反應，以及滴加Na2Mo04溶液反應后，通過伏安法檢測，得到相應的峰電流值；
[0016]b)采用一系列不同濃度的BACEl溶液，重復a)步驟，得到一系列相應的峰電流值，建立峰電流值與BACEI濃度關系的標準曲線；
[0017]C)通過a)步驟檢測待測BACEl溶液，根據標準曲線確定待測BACEl溶液中的BACEl濃度。
[0018]優選的羥基磷灰石基電化學探針用于測定BACEl活性的方法，包括以下步驟:
[0019]a)在表面修飾有多肽的金電極的表面滴加濃度為OU/mL的BACEI溶液(空白溶液)，進行反應I?3h;在所述金電極表面滴加濃度為I?3mg/mL的含羥基磷灰石基化學探針的緩沖溶液，進行反應I?3h;再滴加濃度為50?200μΜ的焦磷酸鈉溶液，進行反應30?60分鐘；再滴加濃度為2?6mM的Na2MoO4溶液，進行反應20?60分鐘后，通過伏安法檢測，得到相應的峰電流值；
[0020]b)分別采用濃度為0.25U/mL、lU/mL、5U/mL、I OU/mL、50U/mL和 I OOU/mL的 BACEI 溶液，重復a)步驟，得到一系列相應的峰電流值，建立峰電流值與BACEI濃度關系的標準曲線；[0021 ] c)通過a)步驟檢測待測BACEl溶液，根據標準曲線確定待測BACEI溶液中的BACEl濃度。
[0022]較優選的方案，多肽序列為CKTEEISEVNLDAEFRHDSGY。
[0023]本發明還提供了一種所述的羥基磷灰石基電化學探針用于測定BACEl抑制性的方法，該方法包括以下步驟:
[0024]i)將BACEI抑制劑與BACEI溶液反應，得到酶反應液；
[0025]ii)在表面修飾有多肽的金電極的表面依次滴加所述酶反應液反應，滴加羥基磷灰石基化學探針溶液反應，滴加焦磷酸鈉溶液反應，以及滴加Na2MoO4溶液反應后，通過伏安法檢測，得到相應的峰電流值；
[0026]iii)采用一系列不同濃度的BACEl抑制劑重復i)和ii)步驟，得到一系列相應的峰電流值，建立峰電流值與BACEl抑制劑濃度關系的標準曲線；
[0027]iv)先通過i)步驟得到待測酶反應液，再通過ii)步驟檢待測酶反應液，根據標準曲線確定待測酶反應液中的BACEl抑制劑濃度，即得出BACEl抑制劑對BACEl的抑制能力。
[0028]優選的羥基磷灰石基電化學探針用于測定BACEl抑制性的方法，包括以下步驟:
[0029]i)將濃度為OnM的BACEl抑制劑(空白溶液)與濃度為25U/mL BACEl溶液，在25?37°〇進行反應0.5?3h，得到酶反應液；
[0030]ii)在表面修飾有多肽的金電極的表面依次滴加所述酶反應液，進行反應I?3h，沖洗所述金電極表面;在所述金電極表面滴加濃度為I?3mg/mL的含羥基磷灰石基化學探針的緩沖溶液反應，反應I?3h，再滴加濃度為50?200μΜ的焦磷酸鈉溶液，進行反應30?60分鐘，再滴加濃度為2?6mM的Na2MoO4溶液，反應20?60分鐘后，通過伏安法檢測，得到相應的峰電流值；
[0031]iii)分別采用濃度為10nM、20nM、40nM、60nM、80nM、100nM、120nM和160nM的BACEl抑制劑與濃度為25U/mL的BACEl溶液，在25?37°C溫度下反應0.5?3小時，得到一系列不同濃度的酶反應液;采用所述不同濃度的酶反應液重復ii)步驟，得到一系列相應的峰電流值，建立峰電流值與BACEl抑制劑濃度關系的標準曲線；
[0032]iv)先通過i)步驟得到待測酶反應液，再通過ii)步驟檢待測酶反應液，根據標準曲線確定待測酶反應液中的BACEl抑制劑濃度，即得出確定BACEl抑制劑對BACEl的抑制能力。
[0033]較優選的方案，多肽序列號為CKTEEISEVNLDAEFRHDSGY。
[0034]較優選的方案，BACEl抑制劑為0M99-2。
[0035]本發明的表面修飾有多肽的金電極通過如下方法制備得到:
[0036](I)處理金電極:
[0037]將直徑2mm的金電極在含有0.05μηι的AI2O3的拋光布上進行拋光，拋光后的電極用二次水沖洗，再用無水乙醇和二次水分別超聲清洗5分鐘，可將附著于電極表面的拋光粉清除干凈，之后用氮氣吹干;將處理好的金電極、Ag/AgCl參比電極和鉑絲對電極共同放入裝有5mmol.L—1的鐵氰化鉀溶液的反應池內，在-0.1?0.6V電壓下，進行循環伏安法掃描，設定掃描速度為0.1V.s—1，電位差為85mV，表明金電極表面被處理干凈；
[0038](2)多肽修飾金電極:
[0039]取度為2?ΙΟμΜ的多肽(CKTEEISEVNLDAEFRHDSGY)滴到電極表面反應6?24小時，即得。
[0040]本發明的羥基磷灰石基電化學探針用于測定BACEl抑制性的原理:基于BACEl催化水解多肽底物(如CKTEEISEVNLDAEFRHDSGY)，而多肽能與特定抗體結合，從而建立了一種電化學生物傳感器，可用來測定BACEl的活性及抑制性。羥基磷灰石基電化學探針上同時修飾了 Αβ抗體和堿性磷酸酯酶，在不存在BACEl時，探針能通過Αβ抗體和多肽之間的作用捕獲到電極表面。而在BACEl存在下，BACEl能水解多肽，使能與抗體結合的多肽片段從電極表面脫落，導致探針不能固定到電極表面。而羥基磷灰石因為含有磷酸根，能與鉬酸鈉在酸性環境中生成具有電信號的磷鉬酸鹽沉淀，而堿性磷酸酯酶也能水解底物焦磷酸鈉生成磷酸根，生成的磷酸根隨后也能和鉬酸鈉生成磷鉬酸鹽沉淀，通過雙信號放大方式實現BACEl活性靈敏檢測。
[0041]本發明的技術方案包括以下具體步驟:
[0042](I)處理金電極:將直徑2mm的金電極在含有0.05μηι的ΑΙ2Ο3的拋光布上進行拋光，拋光后的電極用二次水沖洗，再用無水乙醇和二次水分別超聲清洗5分鐘，可將附著于電極表面的拋光粉清除干凈，之后用氮氣吹干;將處理好的金電極、Ag/AgCl參比電極和鉑絲對電極共同放入裝有5mmol.L—1的鐵氰化鉀溶液的反應池內，在-0.1?0.6V電壓下，進行循環伏安法掃描，設定掃描速度為0.1V.s—1，電位差為85mV，表明金電極表面被處理干凈；
[0043](2)多肽修飾金電極:
[0044]取5yL 2?ΙΟμΜ的多肽(CKTEEISEVNLDAEFRHDSGY)滴到電極表面反應6?24小時；
[0045](3)基于羥基磷灰石的電化學探針的制備:
[0046]首先將輕基磷灰石納米顆粒按0.5?2mg/mL的比例分散在0.5?5% (m/m)的聚乙烯亞胺溶液中反應I?2小時，離心后將離心下來的納米顆粒分散在0.1?I %的戊二醛溶液中反應30?60分鐘;進一步離心后繼續將反應后的納米顆粒分散在含有0.1?10yg/mL的Αβ抗體和I?I Oyg/mL的堿性磷酸酯酶的溶液中反應I?3小時；再一次離心后將納米顆粒分散在緩沖溶液中存放在4 0C冰箱中備用。
[0047](4)測定BACEl活性:
[0048]分別取5yL BACEl濃度為O、0.25、1、5、10、50、100U/mL的溶液滴在多肽修飾的電極表面反應I?3小時，電極沖洗后再取5yL上述制備的羥基磷灰石探針溶液(濃度為I?3mg/mL)滴加在電極表面反應I?3小時；電極再次沖洗后，滴加濃度為50?200μΜ的焦磷酸鈉溶液反應30?60分鐘；最后再取7.5yL2?6mM的Na2MoO4滴加在表面，反應20?60分鐘，然后在
0.5M H2SO4溶液中掃方波伏安曲線，將峰電流大小與酶濃度做標準曲線。
[0049 ] (5)測定BACEI抑制劑0M99-2的抑制性:
[0050]取濃度分別為0、10、20、40、60、80、100、120、160nM的BACEl抑制劑0M99-2與25U/mL的BACEl溶液在25?37°C的水浴中分別反應0.5?3小時，再分別取酶反應液，50?200μΜ的焦磷酸鈉和2-6mM的Na2MoO4各5yL按上述(4)中方法滴加在多肽修飾好的金電極表面反應，然后以同樣的條件掃方波伏安曲線，測定0M99-2的半數抑制濃度IC5q約為80nM。
[0051]相對現有技術，本發明的技術方案帶來的有益技術效果:
[0052]I)本發明的技術方案首次將Αβ抗體和堿性磷酸酯酶共同修飾在羥基磷灰石表面構建成，充分利用BACEl催化水解多肽，而多肽能與特定抗體結合的原理，在不存在BACEl時，探針能通過Αβ抗體和多肽之間的作用捕獲到電極表面;而在濃度BACEl存在下，BACEl能水解多肽，使能與抗體結合的多肽片段從電極表面脫落，導致探針不能固定到電極表面;同時，羥基磷灰石因為含有磷酸根，能與鉬酸鈉在酸性環境中生成具有電信號的磷鉬酸鹽沉淀，而堿性磷酸酯酶也能水解底物焦磷酸鈉生成磷酸根，生成的磷酸根隨后也能和鉬酸鈉生成磷鉬酸鹽沉淀，通過雙信號放大方式實現BACEl活性靈敏檢測。
[0053]2)本發明的羥基磷灰石基電化學探針的制備方法無需使用精密的儀器設備，操作簡便，成本低，有利于大規模生產使用。
[0054]3)本發明的羥基磷灰石基電化學探針用于檢測BACEl活性或抑制性過程中，可以利用羥基磷灰石和堿性磷酸酯酶的雙信號放大方式，直接通過電化學信號大小來實現測定;具有操作簡單、靈敏度高、檢測范圍寬、且檢測用時短等特點，同時可推廣到其他電分析檢測。
【附圖說明】
[0055]【圖1】為本發明構建的電化學法測定BACEl活性及抑制性原理圖。
[0056]【圖2】為本發明實施例2中羥基磷灰石的透射電鏡表針圖。
[0057]【圖3】為本發明實施例2中羥基磷灰石和Na2MoO4反應圖(a)，堿性磷酸酯酶和焦磷酸鈉作用后與Na2MoO4反應圖(b)以及電化學探針和焦磷酸鈉和Na2MoO4反應圖(C)。
[0058]【圖4】為本發明實施例3中電極修飾多肽后表征圖(A)以及測BACEl活性可行性分析⑶。
[0059]【圖5】為本發明實施例4中BACEI與多肽不同反應時間對電極靈敏度影響(A)，以及探針制備過程中堿性磷酸酯酶與Αβ抗體質量比例對電極靈敏度影響(B )。
[0060]【圖6】為本發明實施例4中不同濃度的BACEl電化學響應信號圖以及標準曲線，檢測范圍為0.25U/L?100U/mL。
[0061]【圖7】為本發明實施例4中電極的選擇性，測試了電極對蛋白激酶、堿性磷酸酯酶、葡萄糖氧化酶和乙醇脫氫酶的靈敏度。
[0062 ]【圖8】為本發明實施例5中不同濃度的BACEI抑制劑0M99-2對酶活性影響的電化學響應信號圖。從下到上依次為不同濃度的0M99-2(5，10，20，40，60，80，100，120，150nM)加入到25U/L BACEl酶反應液中，再測試酶活性的電化學響應信號圖，內插圖為抑制效果圖。
【具體實施方式】
[0063]下面列舉實施方式對本
【發明內容】
進行具體描述，但本發明權利要求保護范圍不限于以下實例。
[0064]實施例1
[0065]將直徑2mm的金電極在含有0.05μηι的AI2O3的拋光布上進行拋光，拋光后的電極用二次水沖洗，再用無水乙醇和二次水分別超聲清洗5分鐘，可將附著于電極表面的拋光粉清除干凈，之后用氮氣吹干。將處理好的金電極、Ag/AgCl參比電極和鉑絲對電極共同放入裝有5mM的鐵氰化鉀溶液的反應池內，在-0.1-0.6V電壓下，進行循環伏安法掃描，設定掃描速度為0.1V.s—1，
[0066]電位差為85mV，表明金電極表面被處理干凈。取5yL濃度為4μΜ的多肽(CKTEEISEVNLDAEFRHDSGY)滴到電極表面反應12小時。
[0067]電極清洗后，取5μΙ^?度為ΙΟμΜ的多肽
[0068](CKTEEISEVNLDAEFRHDSGY)滴到電極表面反應 6 小時。
[0069]實施例2
[0070]因為羥基磷灰石包含有大量磷酸根，而堿性磷酸酯酶能水解焦磷酸鈉成磷酸根，磷酸根會與Na2MoO4在酸性環境中生成磷鉬酸鹽沉淀，產生雙重電化學信號，因此首先測試了雙信號模式。將lmg/mL的羥基磷灰石溶液滴在電極表面同6mM的Na2MoO4反應，然后以0.5M的秘04為電解液，在0.1?0.5V范圍內，15HZ的頻率掃方波伏安曲線。取ΙΟΟμΜ的焦磷酸鈉溶液滴在電極表面同Na2Mo04反應，以及將焦磷酸鈉先同堿性磷酸酯酶反應后再與Na2Mo04反應，然后同樣在0.5M H2SO4溶液中掃方波伏安曲線。最后取制備的電化學探針與Na2MoO4反應，同樣在0.5M H2SO4溶液中掃方波伏安曲線。
[0071]實施例3
[0072]將空白金電極和多肽修飾后的金電極在5mM的鐵氰化鉀溶液反應池內，在-0.Ι-Ο.6V 電壓下 ，進行循環伏安法掃描，通過電極峰電流變化表征多肽在電極表面的修飾。在兩個多肽修飾電極表面分別滴加O和2.5U/mL的BACEl溶液反應I小時，電極沖洗后再在電極表面滴加輕基磷灰石探針溶液反應I小時;然后滴加ΙΟΟμΜ的焦磷酸鈉溶液反應40分鐘；最后在電極表面滴加Na2MoO4，反應40分鐘，然后在0.5Μ H2SO4溶液中掃方波伏安曲線，通過伏安法檢測，根據得到的相應的峰電流值測試方法的可行性。
[0073]同樣，在兩個多肽修飾電極表面分別滴加O和2.5U/mL的BACEl溶液反應I小時，電極沖洗后再在電極表面滴加羥基磷灰石探針溶液反應I小時;然后滴加200μΜ的焦磷酸鈉溶液反應60分鐘；最后在電極表面滴加Na2MoO4,反應40分鐘，然后在0.5Μ H2SO4溶液中掃方波伏安曲線，通過伏安法檢測，根據得到的相應的峰電流值測試方法的可行性。
[0074]實施例4
[0075]測試BACEl同多肽反應10、30、50、60、80、90分鐘對電極靈敏度的影響。測試探針制備過程中堿性磷酸酯酶與Αβ抗體質量比例對電極靈敏度影響。在優化條件下取濃度分別為0、0.25、l、5、10、50、100U/mL的BACEl溶液與電極反應I小時，然后電極與合成的電化學探針反應I小時，與焦磷酸鈉溶液反應40分鐘，與Na2Mo04溶液反應40分鐘后，通過伏安法檢測，根據電極電流響應得出電極的線性范圍。同時測試電極對BACEl的選擇性，測試電極對其它酶，如蛋白激酶、堿性磷酸酯酶、葡萄糖氧化酶和乙醇脫氫酶的靈敏度。
[0076]在優化條件下取濃度分別為O、0.25、1、5、10、50、100U/mL的BACEI溶液與電極反應3小時，然后電極與合成的電化學探針反應I小時，與焦磷酸鈉溶液反應40分鐘，與Na2MoO4溶液反應40分鐘后，通過伏安法檢測，根據電極電流響應得出電極的線性范圍。
[0077]實施例5
[0078]取濃度分別為O、10、20、40、60、80、100、120、160nM的BACEI 抑制劑 0M99-2 與 25U/mL的BACEI溶液在37 0C的水浴中反應I小時，然后將反應后的溶液按實施例4與電極反應，測試BACEI被不同濃度抑制劑0M99-2抑制后酶的活性，繪制酶抑制曲線。
[0079]取濃度分別為0、10、20、40、60、80、100、120、160nM的BACEl抑制劑0M99-2與50U/mL的BACEI溶液在37 0C的水浴中反應I小時，然后將反應后的溶液按實施例4與電極反應，測試BACEI被不同濃度抑制劑0M99-2抑制后酶的活性，繪制酶抑制曲線。
[0080]以上顯示和描述了本發明的基本原理和主要特征以及本發明的優點。本行業的技術人員應該了解，本發明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發明的原理，在不脫離本發明精神和范圍的前提下，本發明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發明范圍內。本發明要求保護范圍由所附的權利要求書及其等效物界定。
【主權項】
1.一種羥基磷灰石基電化學探針，其特征在于:由Αβ抗體和堿性磷酸酯酶共同修飾在輕基磷灰石基體上構成。2.一種構建權利要求1所述的羥基磷灰石基電化學探針的方法，其特征在于:將羥基磷灰石納米顆粒依次置于聚乙烯亞胺溶液中反應，置于戊二醛溶液中反應，以及置于含體和堿性磷酸酯酶的溶液中反應，即得。3.根據權利要求2所述的構建羥基磷灰石基電化學探針的方法，其特征在于:包括以下步驟: 1)將羥基磷灰石納米顆粒按0.5?2mg/mL的比例分散在濃度為0.5?5%的聚乙烯亞胺溶液中，反應I?2小時后，進行離心分離I; 2)離心分離I所得顆粒產物分散在濃度為0.1?1?丨％的戊二醛溶液中，反應30?60分鐘后，進行離心分離II; 3)離心分離II所得顆粒產物分散在含有Αβ抗體和堿性磷酸酯酶的溶液中，反應I?3小時后，進行離心分離III，即得羥基磷灰石基電化學探針； 所述的含Αβ抗體和堿性磷酸酯酶的溶液中Αβ抗體的濃度為0.1?10yg/mL，堿性磷酸酯酶的濃度為I?I Oyg/ mL。4.權利要求1所述的羥基磷灰石基電化學探針用于測定BACEl活性的方法，其特征在于:包括以下步驟: a)在表面修飾有多肽的金電極的表面依次滴加BACEI溶液反應，滴加羥基磷灰石基化學探針溶液反應，滴加焦磷酸鈉溶液反應，以及滴加Na2Mo04溶液反應后，通過伏安法檢測，得到相應的峰電流值； b)采用一系列不同濃度的BACEl溶液，重復a)步驟，得到一系列相應的峰電流值，建立峰電流值與BACEI濃度關系的標準曲線； c)通過a)步驟檢測待測BACEl溶液，根據標準曲線確定待測BACEl溶液中的BACEl濃度。5.根據權利要求4所述的羥基磷灰石基電化學探針用于測定BACEl活性的方法，其特征在于:包括以下步驟: a)在表面修飾有多肽的金電極的表面滴加濃度為OU/mL的BACEI溶液，進行反應I?3h;在所述金電極表面滴加濃度為I?3mg/mL的含羥基磷灰石基化學探針的緩沖溶液，進行反應I?3h;然后滴加濃度為50?200μΜ的焦磷酸鈉溶液，進行反應30?60分鐘;再滴加濃度為2?6mM的Na2MoO4溶液，進行反應20?60分鐘后，通過伏安法檢測，得到相應的峰電流值； b)分別采用濃度為0.25U/mL、lU/mL、5U/mL、10U/mL、50U/mL 和 100U/mL 的 BACEl 溶液，重復a)步驟，得到一系列相應的峰電流值，建立峰電流值與BACEI濃度關系的標準曲線； c)通過a)步驟檢測待測BACEl溶液，根據標準曲線確定待測BACEl溶液中的BACEl濃度。6.根據權利要求5所述的羥基磷灰石基電化學探針用于測定BACEl活性的方法，其特征在于:所述的多肽序列為CKTEEISEVNLDAEFRHDSGY。7.權利要求1所述的羥基磷灰石基電化學探針用于測定BACEl抑制性的方法，其特征在于:包括以下步驟: i)將BACEI抑制劑與BACEI溶液反應，得到酶反應液； ii)在表面修飾有多肽的金電極的表面依次滴加所述酶反應液反應，滴加羥基磷灰石基化學探針溶液反應，滴加焦磷酸鈉溶液反應，以及滴加Na2Mo04溶液反應后，通過伏安法檢測，得到相應的峰電流值； iii)采用一系列不同濃度的BACEl抑制劑，重復i)和ii)步驟，得到一系列相應的峰電流值，建立峰電流值與BACEl抑制劑濃度關系的標準曲線； iv)先通過i)步驟得到待測酶反應液，再通過ii)步驟檢測待測酶反應液，根據標準曲線確定待測酶反應液中的BACEl抑制劑濃度，即得出BACEl抑制劑對BACEl的抑制能力。8.根據權利要求7所述的羥基磷灰石基電化學探針用于測定BACEl抑制性的方法，其特征在于:包括以下步驟: i)將濃度為OnM的BACEl抑制劑與濃度為25U/mLBACEl溶液，在25?37°C進行反應0.5?3h，得到酶反應液； ii)在表面修飾有多肽的金電極的表面依次滴加所述酶反應液，進行反應I?3h;在所述金電極表面滴加濃度為I?3mg/mL的含羥基磷灰石基化學探針的緩沖溶液反應，反應I?3h ；再滴加濃度為50?200μΜ的焦磷酸鈉溶液，進行反應30?60分鐘；再滴加濃度為2?6mM的Na2MoO4溶液，反應20?60分鐘后，通過伏安法檢測，得到相應的峰電流值； iii)分別采用濃度為10nM、20nM、40nM、60nM、80nM、100nM、120nM和160nM的MCEl抑制劑，重復i)和i i)步驟，得到一系列相應的峰電流值，建立峰電流值與BACEI抑制劑濃度關系的標準曲線； iv)先通過i)步驟得到待測酶反應液，再通過ii)步驟檢待測酶反應液，根據標準曲線確定待測酶反應液中的BACEl抑制劑濃度，即得出BACEl抑制劑對BACEl的抑制能力。9.根據權利要求8所述的羥基磷灰石基電化學探針用于測定BACEl抑制性的方法，其特征在于: 所述的多肽序列號為CKTEEISEVNLDAEFRHDSGY。10.根據權利要求8所述的羥基磷灰石基電化學探針用于測定BACEl抑制性的方法，其特征在于:所述的BACEl抑制劑為0M99-2。
【文檔編號】G01N27/48GK106093160SQ201610396855
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月7日 公開號201610396855.X, CN 106093160 A, CN 106093160A, CN 201610396855, CN-A-106093160, CN106093160 A, CN106093160A, CN201610396855, CN201610396855.X
【發明人】陽明輝
【申請人】中南大學