一種測定缺血修飾白蛋白的試劑盒及其制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種測定缺血修飾白蛋白的試劑盒及其制備方法，包括彼此獨立的試劑R1和試劑R2雙液體組分，包括的成分及相應含量為：試劑R1：緩沖液 10~200mmol/L、氯化鈷0.01~1.00 mmol/L、穩定劑1~10g/L，其溶劑為純化水，試劑R2：Na2HPO4 10~200mmol/L、顯色劑0.1~3.0g/L、穩定劑 1~10g/L，其溶劑為純化水，制備方法為：按照組分含量配制好試劑；將待測血清樣本與試劑R1和試劑R2混合，使其充分反應；用全自動生化分析儀測定反應后的吸光度差值；根據吸光度變化值計算出樣本中的缺血修飾白蛋白的濃度。本發明具有準確度高等優點。
【專利說明】
一種測定缺血修飾白蛋白的試劑盒及其制備方法
技術領域
[0001] 本發明涉及醫學及生物化學技術領域，具體來說是一種測定缺血修飾白蛋白的試 劑盒及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 心肌缺血時，人血清白蛋白通過缺血部位時，由于自由基等破壞了血清白蛋白的 氨基酸序列，其氨基末端被修飾，這種N-末端被損害或被銅占據的白蛋白稱為缺血修飾白 蛋白（IMA)，其特點是N-末端和鈷等過渡金屬離子的結合率下降，心肌缺血5-10min，缺血修 飾白蛋白即可在血液中檢出，l_2h達高峰，3-6h回到基礎水平。
[0003] 缺血修飾白蛋白是急性冠脈綜合征(ACS)診斷的生物標志，ACS具有發病急、變化 快、臨床表現與危險性不均一等特征，早期診斷困難，傳統的生物標志物如肌鈣蛋白（cTn)、 肌紅蛋白（Myo)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)只有在心肌發生壞死時才升高，但這時已給患者 帶來了不可逆的病理損害，因此，急需一種可以反映心肌缺血的早期敏感的生化指標用于 早期診斷，而缺血修飾白蛋白是近年來的研究熱點，為ACS早期診斷的研究開辟了新的道 路。
[0004] 缺血修飾白蛋白對ACS患者心肌缺血檢出的靈敏度是ECG的2倍、cTn的4倍，缺血修 飾白蛋白是檢測冠脈痙攣導致缺血的生化標志物。
[0005] 缺血修飾白蛋白不僅可以用于ACS患者的早期診斷，還可以用于冠脈事件即PCI術 后判斷指標。無側支循環患者的IMA值明顯高于有側支循環者，IMA值升高與病變嚴重程度 相關。
[0006] 缺血修飾白蛋白值可作為早期辨別急性腦卒中生化標志物，腦出血發作初期，其 中位數水平增加。
[0007] 目前檢測缺血修飾白蛋白的主要方法有比色法，但是比色法所用的顯色物質不穩 定，準確度不夠高，需要進行改進。
【發明內容】
[0008] 本發明所要解決的技術問題是為了克服現有技術穩定性差、準確度不高的缺陷， 而提供一種測定缺血修飾白蛋白的試劑盒及其制備方法。
[0009] 本發明解決上述技術問題提供的技術方案是:本發明公開了一種測定缺血修飾白 蛋白的試劑盒，包括彼此獨立的試劑R1和試劑R2雙液體組分，包括的成分及相應含量為： 試劑R1: 緩沖液 10~200mmol/L 氯化鈷 0.01~1.00 mmol/L 穩定劑 1~10g/L 其溶劑為純化水。
[0010] 試劑R2: Na2HP〇4 10~200mmol/L 顯色劑 0.1~3.0g/L 穩定劑 1~lOg/L 其溶劑為純化水。
[0011] 作為優選，本發明公開了 一種測定缺血修飾白蛋白的試劑盒，包括彼此獨立的試 劑R1和試劑R2雙液體組分組成，包括的成分及相應含量為： 試劑R1: 緩沖液 100mmol/L 氯化鈷 0.50 mmol/L 穩定劑 5g/L 其溶劑為純化水。
[0012] 試劑R2: Na2HP〇4 100mmol/L 顯色劑 1.5g/L 穩定劑 5g/L 其溶劑為純化水。
[0013] 作為優選，所述的試劑R1中，所述的緩沖液采用磷酸鹽緩沖液、三羥甲基氨基甲烷 緩沖液、1，4-哌嗪二乙磺酸緩沖液、4-羥乙基哌嗪丙磺酸緩沖液、4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖 液、三羥甲基甲胺基丙磺酸緩沖液、甘氨酸緩沖液、硼酸緩沖液、3-嗎啉丙磺酸緩沖液、3-(N-嗎啉基)-2-羥丙基磺酸緩沖液、2-嗎啉乙磺酸緩沖液、磷酸二氫鈉緩沖液中的一種或兩 種以上任意比例的混合。
[0014] 作為優選，所述的試劑R1中，所述的穩定劑為疊氮鈉。
[0015]作為優選，所述的試劑R2中，所述的顯色劑為二硫蘇糖醇。
[0016]作為優選，所述的試劑R2中，所述的穩定劑為疊氮鈉。
[0017]作為優選，所述的試劑R1中，所述的緩沖液的pH值為6~9。
[0018] 作為優選，本發明還公開了上述測定缺血修飾白蛋白的試劑盒的制備方法和使用 方法，包括以下步驟： (a)按照下列組分含量配制好試劑： 試劑R1: 緩沖液 10~200mmol/L 氯化鈷 0.01~1.00 mmol/L 穩定劑 1~10g/L 其溶劑為純化水。
[0019] 試劑R2: Na2HP〇4 10~200mmol/L 顯色劑 0.1~3.0g/L 穩定劑 1~10g/L 其溶劑為純化水。
[0020] (b)將待測血清樣本與試劑R1和試劑R2混合，使其充分反應； (c)用全自動生化分析儀測定反應后的吸光度差值； (d )根據吸光度變化值計算出樣本中的缺血修飾白蛋白的濃度。
[0021] 本發明的檢測原理是:血清中HAS與Co2+結合后剩余的游離鈷Co2+與有機顯色物反 應生成紅褐色產物，在505nm的波長下閉塞，其吸光度與Co 2+濃度成正比，從而計算求的血清 樣本中IMA的濃度。
式中：△ AT以空白管吸光度作對照的樣品管吸光度值 Δ As以空白管吸光度作對照的校準管吸光度值 Cs 校準液中IMA的濃度 與現有技術相比，本發明具有以下有益優點:本發明所述的測定缺血修飾白蛋白的試 劑盒通過添加穩定劑，可以促使整個試劑盒的穩定性的提高，也就利于整個試劑盒的測定 準確度以及精密度的提高，另外通過使用二硫蘇糖醇作為顯色劑，使得游離鈷Co 2+與有機顯 色物產生的有色物質顯色更明顯，測定更靈敏，存在更穩定，測定的準確度也就更高。
【具體實施方式】 [0023] 實施例1 本發明的試劑盒包括彼此獨立的試劑R1和試劑R2雙液體組分，其中 試劑R1: 三羥甲基氨基甲烷緩沖液 100mm〇l/L 氯化鈷 0.50 mmol/L 疊氮鈉 5g/L 其溶劑為純化水。
[0024] 試劑 R2: Na2HP〇4 100mmol/L 二硫蘇糖醇 1.5g/L 疊氮鈉 5g/L 其溶劑為純化水。
[0025] 實施例2 本發明的試劑盒包括彼此獨立的試劑R1和試劑R2雙液體組分，其中 試劑R1: 4-羥乙基哌嗪丙磺酸緩沖液 200mmol/L 氯化鈷 1.00 mmol/L 疊氮鈉 lg/L 其溶劑為純化水。
[0026] 試劑R2: Na2HP〇4 10mmol/L 二硫蘇糖醇 3.0g/L 疊氮鈉 l〇g/L 其溶劑為純化水。
[0027] 實施例3 試劑盒的制備和使用方法 1、按照下列組分含量配制好試劑： 試劑R1: 三羥甲基氨基甲烷緩沖液 100mm〇l/L 氯化鈷 0.50 mmol/L 疊氮鈉 5g/L 其溶劑為純化水。
[0028]試劑 R2: Na2HP〇4 100mmol/L 二硫蘇糖醇 1.5g/L 疊氮鈉 5g/L 其溶劑為純化水。
[0029] 2、全自動生化分析儀參數設置 (a) 檢測溫度:37°C; (b) 檢測波長：主波長505nm、副波長700nm; (c) 反應時間：10min，其中，孵育時間5min，加入試劑R2后立即測定讀取吸光度 Al，5min后讀取吸光度A2,計算吸光度變化ΔΑ = A2-A1 ; (d) 反應方向：正反應。
[0030] 3、檢測步驟 (a) 取225ul試劑R1與30ul待測血清樣本混勻； (b) 將混勻后的溶液在37°C的條件下孵育5min; (c) 加入75ul試劑R2,立即測定讀取吸光度Al，5min后讀取吸光度A2,計算吸光度變化 ΔΑ = A2-A1 ； ⑷
根據 樣本中IMA濃度 計算出樣本中的缺血修飾 白蛋白的濃度。
[0031] 實施例4 試劑盒的制備和使用方法 1、按照下列組分含量配制好試劑： 試劑R1: 4-羥乙基哌嗪丙磺酸緩沖液 200mmol/L 氯化鈷 1.00 mmol/L 疊氮鈉 lg/L 其溶劑為純化水。
[0032] 試劑R2: Na2HP〇4 10mmol/L 二硫蘇糖醇 3.0g/L 疊氮鈉 l〇g/L 其溶劑為純化水。
[0033] 2、全自動生化分析儀參數設置 (a) 檢測溫度:37°C; (b) 檢測波長：主波長505nm、副波長700nm; (c) 反應時間：10min，其中，孵育時間5min，加入試劑R2后立即測定讀取吸光度 Al，5min后讀取吸光度A2,計算吸光度變化ΔΑ = A2-A1 ; (d) 反應方向：正反應。
[0034] 3、檢測步驟 (a) 取225ul試劑R1與30ul待測血清樣本混勻； (b) 將混勻后的溶液在37°C的條件下孵育5min; (c) 加入75ul試劑R2,立即測定讀取吸光度Al，5min后讀取吸光度A2,計算吸光度變化 ΔΑ = A2-A1 ；
⑷ 根據樣本中IMA濃度 計算出樣本中的缺血 修飾白蛋白的濃度。
[0035] 表1為實施例1所制得的測定缺血修飾白蛋白的試劑盒以及實施例2所制得的測定 缺血修飾白蛋白的試劑盒分別對質控品1進行測定的結果，其中質控品1中的缺血修飾白蛋 白的濃度為56U/mL，測定結果見表1:
由表1可知，本發明所制得的測定缺血修飾白蛋白的試劑盒對質控品1的測定結果偏差 較小，因此測定準確度高，而且實施例1為最優的選擇。
[0036] 表2為實施例1所制得的測定缺血修飾白蛋白的試劑盒以及實施例2所制得的測定缺血 修飾白蛋白的試劑盒分別對質控品2進行測定的結果，其中質控品2中的缺血修飾白蛋白的 濃度為78U/mL，測定結果見表2: 表2 由表2可知，本發明所制得的測定缺血修飾白蛋白的試劑盒對質控品2的測定結果偏差 較小，因此測定準確度高，而且實施例1為最優的選擇。
[0037]表3為實施例3所制得的測定缺血修飾白蛋白的試劑盒對同一待測樣本進行的多 次反復測定以及實施例4所制得的測定缺血修飾白蛋白的試劑盒對同一待測樣本進行的多 次反復測定，對所得的結果進行SD和CV的計算，結果如下： 表3
由表3可知本發明所制得的測定缺血修飾白蛋白的試劑盒的精密度比較好，而且由表3 可知，實施例3為最優的選擇。
[0038]上述實施例僅例示性說明本發明的原理及其功效，而非用于限制本發明。任何熟 悉此技術的人士皆可在不違背本發明的精神及范疇下，對上述實施例進行修飾或改變。因 此，舉凡所屬技術領域中具有通常知識者在未脫離本發明所揭示的精神與技術思想下所完 成的一切等效修飾或改變，仍應由本發明的權利要求所涵蓋。
【主權項】
1. 一種測定缺血修飾白蛋白的試劑盒，其特征在于:包括彼此獨立的試劑R1和試劑R2 雙液體組分，包括的成分及相應含量為： 試劑R1: 緩沖液 10~200mmol/L 氯化鈷 0.01~1.00 mmol/L 穩定劑 1~10g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: Na2HP〇4 10~200mmol/L 顯色劑 0.1~3.0g/L 穩定劑 1~10g/L 其溶劑為純化水。2. 根據權利要求1所述的一種測定缺血修飾白蛋白的試劑盒，其特征在于:包括彼此獨 立的試劑R1和試劑R2雙液體組分組成，包括的成分及相應含量為： 試劑R1: 緩沖液 100mmol/L 氯化鈷 0.50 mmol/L 穩定劑 5g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: Na2HP〇4 100mmol/L 顯色劑 1.5g/L 穩定劑 5g/L 其溶劑為純化水。3. 根據權利要求1或2所述的一種測定缺血修飾白蛋白的試劑盒，其特征在于:所述的 試劑R1中，所述的緩沖液采用磷酸鹽緩沖液、三羥甲基氨基甲烷緩沖液、1，4_哌嗪二乙磺酸 緩沖液、4-羥乙基哌嗪丙磺酸緩沖液、4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液、三羥甲基甲胺基丙磺酸 緩沖液、甘氨酸緩沖液、硼酸緩沖液、3-嗎啉丙磺酸緩沖液、3-(N-嗎啉基)-2-羥丙基磺酸緩 沖液、2-嗎啉乙磺酸緩沖液、磷酸二氫鈉緩沖液中的一種或兩種以上任意比例的混合。4. 根據權利要求1或2所述的一種測定缺血修飾白蛋白的試劑盒，其特征在于:所述的 試劑R1中，所述的穩定劑為疊氮鈉。5. 根據權利要求1或2所述的一種測定缺血修飾白蛋白的試劑盒，其特征在于:所述的 試劑R2中，所述的顯色劑為二硫蘇糖醇。6. 根據權利要求1或2所述的一種測定缺血修飾白蛋白的試劑盒，其特征在于:所述的 試劑R2中，所述的穩定劑為疊氮鈉。7. 根據權利要求1或2所述的一種測定缺血修飾白蛋白的試劑盒，其特征在于:所述的 試劑R1中，所述的緩沖液的pH值為6~9。8. 根據權利要求1或2所述的一種測定缺血修飾白蛋白的試劑盒的制備方法和使用方 法，其特征在于:包括以下步驟： (a) 按照下列組分含量配制好試劑： 試劑R1: 緩沖液 10~200mmol/L 氯化鈷 0.01~1.00 mmol/L 穩定劑 1~10g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: Na2HP〇4 10~200mmol/L 顯色劑 0.1~3.0g/L 穩定劑 1~10g/L 其溶劑為純化水 (b) 將待測血清樣本與試劑R1和試劑R2混合，使其充分反應； (c) 用全自動生化分析儀測定反應后的吸光度差值； (d )根據吸光度變化值計算出樣本中的缺血修飾白蛋白的濃度。
【文檔編號】G01N21/31GK106093017SQ201610273287
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年4月28日 公開號201610273287.4, CN 106093017 A, CN 106093017A, CN 201610273287, CN-A-106093017, CN106093017 A, CN106093017A, CN201610273287, CN201610273287.4
【發明人】蔡曉輝, 莊慶華, 吳錚, 徐運
【申請人】安徽伊普諾康生物技術股份有限公司