一種大功率led的微陣列芯片熒光檢測方法

一種大功率led的微陣列芯片熒光檢測方法
【專利摘要】本發明涉及一種大功率LED的微陣列芯片熒光檢測方法，包括自上而下依次設置的冷卻型CCD相機、窄帶鍍膜熒光濾波片、成像微距鏡頭、LED照明陣列以及被測熒光微陣列生物芯片；冷卻型CCD相機連接至計算機系統；LED照明陣列中的LED燈經驅動電路連接至計算機系統；通過計算機系統，經驅動電路輸出預設驅動電流，以驅動LED照明陣列發光；被測熒光微陣列生物芯片上已經標記熒光染料的微點陣受激產生熒光分子，通過冷卻型CCD相機對熒光分子進行多像素并行積分的方式曝光成像，并將采集到的圖像傳送到計算機系統中進行儲存以及去噪處理，最終獲取被測熒光微陣列生物芯片的熒光圖像。本發明所提出的方法，掃描速度快，裝置結構簡單。
【專利說明】
一種大功率LED的微陣列芯片熒光檢測方法
技術領域
[0001 ]本發明涉及一種大功率LED的微陣列芯片熒光檢測方法。
【背景技術】
[0002] 專利（申請號:CN200410009044.7)提出一種具有光強實時檢測的生物芯片檢測方 法以及檢測系統，使得生物芯片檢測系統在檢測過程中出現光源光強變動情況時，能夠及 時被檢測出并處理使得檢測數據準確。專利（公開號:CN03112771.1)提出一種低密度生物 芯片檢測系統，結合激發光系統、熒光信號收集系統和信號檢測系統，主要關鍵技術是用光 導纖維束將芯片上產生的熒光信號收集到光電倍增管表面并轉化成電信號，得出一種成本 低、適用于檢測低密度生物芯片熒光信號的方法。專利（申請號:CN201110398112.3)提出一 種生物芯片檢測裝置及生物芯片檢測方法，藉由判斷辨識信息來確定生物芯片是否可進行 檢測，并透過控制器自動調整檢測模塊的設定減少錯誤。
[0003] 目前廣泛應用的激光共聚焦掃描的生物芯片檢測儀具有很高的靈敏度和分辨率， 但由于激光聚焦到幾微米級別并對芯片的探針陣列進行逐點逐線掃描，檢測速度較慢，耗 時較多。使用冷卻型CCD成像技術，并結合均勻的面照明激發光系統，由于多像素并行采集， 大大提高了檢測速度。冷卻型CCD的生物芯片掃描儀需要一般采用高壓汞燈或氙燈作為芯 片的激發光源。由于高壓汞燈和氙燈工作啟停時間長，發熱量大，工作壽命短，存在較大的 缺陷。

【發明內容】

[0004] 本發明的目的在于提供一種大功率LED的微陣列芯片熒光檢測方法，以克服現有 技術中存在的缺陷。
[0005] 為實現上述目的，本發明的技術方案是:一種大功率LED的微陣列芯片熒光檢測方 法，包括自上而下依次設置的冷卻型CCD相機、窄帶鍍膜熒光濾波片、成像微距鏡頭、LED照 明陣列以及被測熒光微陣列生物芯片;所述冷卻型CCD相機連接至一計算機系統;所述LED 照明陣列中的LED燈經驅動電路連接至所述計算機系統;通過所述計算機系統，經所述驅動 電路輸出預設驅動電流，以驅動所述LED照明陣列發光;所述被測熒光微陣列生物芯片上已 經標記熒光染料的微點陣受激產生熒光分子，通過所述冷卻型CCD相機對所述熒光分子進 行多像素并行積分的方式曝光成像，并將采集到的圖像傳送到所述計算機系統中進行儲存 以及去噪處理，最終獲取所述被測熒光微陣列生物芯片的熒光圖像。
[0006] 在本發明一實施例中，所述LED照明陣列為一環形陣列，且包括設置于同一水平面 上的一內圓環LED陣列以及一外圓環LED陣列;所述內圓環LED陣列以及所述外圓環LED陣列 上均勻分布有若干個在發光面上設置有濾光片的LED燈。
[0007] 在本發明一實施例中，通過Tracepro軟件分別構建所述內圓環LED陣列以及所述 外圓環LED陣列的面光源模型，獲取LED的總輻射通量和有效照明通量，并確定所述內圓環 LED陣列以及所述外圓環LED陣列的位置;所述面光源模型參數通過如下方式獲取：
[0008]設LED燈分布在xy平面上，則坐標系中待觀測的一點P(x，y，z)處的照度為：
[0010] 式中，（XQ，yQ)為LED在xy平面上的坐標，Ιο為LED發光面法線上的光照強度，m為LED 光輻射模式，z為LED照明陣列至照明目標面的距離；
[0011] 對于LED照明陣列的環形陣列排列，由上式可得照明目標面任意點的線性疊加的 照度，N彡3:
[0013] 其中，N為內圓環LED陣列或外圓環LED陣列上的LED燈的總數，η為內圓環LED陣列 或外圓環LED陣列不同位置上的LED燈的序列號，P為內圓環LED陣列或外圓環LED陣列的半 徑；
[0014]對該式進行求二次導，并依據斯派羅法則最大平坦條件，在x = 0，y = 0處令 得到： *
[0016] 根據預設的LED光輻射模式m，N以及P，進而獲取z。
[0017] 在本發明一實施例中，所述內圓環LED陣列上的LED燈采用綠色單芯大功率LED PT54-G，所述外圓環LED陣列上的LED燈采用紅色單芯大功率LED PT54-R。
[0018] 在本發明一實施例中，計算所述LED照明光源對熒光染料激發所產生的熒光分子 數，再結合所述冷卻型CCD相機探測到的最小的熒光光強系數，計算檢測靈敏度值，并通過 對所述冷卻型CCD相機的拍攝曝光時間進行預設置，進而獲取已經標記熒光染料的微點陣 圖像。
[0019] 在本發明一實施例中，記照射到所述被測熒光微陣列生物芯片表面的激發光功率 密度為，則每個熒光分子的激發速率為：
[0021] 式中，hv為吸收光子的能量，σ為熒光染料截面，σ與消光系數ε的關系式：
[0022] σ = 3·8Χ10-21e(cm2);
[0023] 記τ為熒光壽命，1Λ為熒光分子由激發態迀躍回基態的弛豫速率，記No為探針表 面激發光照明的熒光分子總數，他為受激發的熒光分子數，則熒光染料在受激照射并穩定 發射熒光時，存在以下的激發速率和消激速率的平衡：
[0025]可得熒光染料激發比率：
[0027]記Φ為的量子效率，受激產生的熒光速率為：
[0029] 對應所述冷卻型(XD相機中CCD傳感器的每個像素，生物芯片上面積為As熒光染料 受激產生的熒光光子數Φ*為：
[0030] qem=Pf · As · Cs · ts
[0031 ]式中，ts為所述(XD傳感器的積分時間，Cs為焚光染料濃度；
[0032]熒光光子通過所述成像微距鏡頭成像光路到達所述CCD傳感器所形成響應電子數 Qs為：
[0034] 式中，為所述CCD傳感器的量子效率，Kem為成像鏡片和熒光窄帶濾光片的總透 光率，NA為物鏡的數值孔徑。
[0035] 在本發明一實施例中，所述熒光染料包括Cy3以及Cy5。
[0036] 相較于現有技術，本發明具有以下有益效果:本發明所提出的一種大功率LED的微 陣列芯片熒光檢測方法，通過使用大功率LED陣列與科研級冷卻型CCD采集對生物芯片進行 檢測，可以使得檢測的靈敏度優于〇· If lour Aim2，單通道掃描22mm*22mm的檢測時間不超過 10秒，相比于主流應用的激光共聚焦掃描檢測方式來說結構簡單，掃描速度快。該產品可以 廣泛應用于疾病診斷、藥物篩選、預防醫學等方面，能夠達到傳統檢測方式所做不到的效 果。
【附圖說明】
[0037] 圖1為本發明中的大功率LED的微陣列芯片熒光檢測裝置的結構示意圖。
[0038] 圖2為本發明中的面光源模型的模型圖。
[0039] 圖3為本發明中的內圓環LED陣列與外圓環LED陣列的位置示意圖。
[0040] 圖4為本發明中的面光源模型的仿真數據圖。
[0041] 圖5為本發明中大功率紅色LED PT54-R環形陣列輻射照度分布圖。
[0042]圖6為本發明中大功率綠色LED PT54-G環形陣列輻射照度分布圖。
[0043]圖7為本發明中的大功率LED陣列與CCD采集的生物芯片檢測方法的工作流程圖。 [0044]圖8為本發明中的內圓環LED陣列與外圓環LED陣列的驅動參數圖。
【具體實施方式】
[0045]下面結合附圖，對本發明的技術方案進行具體說明。
[0046]本發明提出一種大功率LED的微陣列芯片熒光檢測方法，如圖1所示，包括自上而 下依次設置的冷卻型CCD相機、窄帶鍍膜熒光濾波片、成像微距鏡頭、LED照明陣列以及被測 熒光微陣列生物芯片;所述冷卻型CCD相機連接至一計算機系統;所述LED照明陣列中的LED 燈經驅動電路連接至所述計算機系統;通過所述計算機系統，經所述驅動電路輸出預設驅 動電流，以驅動所述LED照明陣列發光;所述被測熒光微陣列生物芯片上已經標記熒光染料 的微點陣受激產生熒光分子，其中，熒光染料包括Cy3以及Cy5，通過所述冷卻型CCD相機對 所述熒光分子進行多像素并行積分的方式曝光成像，并將采集到的圖像傳送到所述計算機 系統中進行儲存以及去噪處理，最終獲取所述被測熒光微陣列生物芯片的熒光圖像。進而 解決了由于高壓汞燈和氙燈工作啟停時間長、發熱量大、工作壽命短的缺陷。
[0047] 在本實施例中，由于在芯片的熒光采集上信號是非常微弱的，而且相機本身的暗 電流噪聲也是會造成整個采集的信號信噪比不高的原因，因此降低溫度可以大大減少相機 的暗電流噪聲，所以選用冷卻型的CCD相機是十分必要的。
[0048] 為了保障照明系統的出射光通量和光照均勻度，提高生物熒光微陣列芯片測量區 域內的標記染料的受激熒光響應的強度和一致性，最有效的方法就是采用大功率LED陣列 進行疊加照明。
[0049] 在本實施例中，采用LED環形陣列來實現該檢測裝置的激發光源對熒光微陣列芯 片的整個視場的光照達到均勻，使得熒光的激發響應達到一致。LED環形陣列具有聚光作 用，并且均勻照明時其圓環上的LED個數與半徑無關，這對于采用單芯大功率LED芯片是十 分有利的，環形陣列既保證照明中心的強度，又可以減少LED芯片及其激發光濾光片的數 量。由于LED所發出的激發光光譜寬度比較大，因此必須在LED的發光面上加上相對應的濾 光片，使得它的激發光波段更靠近熒光染料的激發波段。
[0050] 進一步的，所述LED照明陣列為一環形陣列，且包括設置于同一水平面上的一內圓 環LED陣列以及一外圓環LED陣列;所述內圓環LED陣列以及所述外圓環LED陣列上均勻分布 有若干個在發光面上設置有濾光片的LED燈。所述內圓環LED陣列上的LED燈采用綠色單芯 大功率LED PT54-G，所述外圓環LED陣列上的LED燈采用紅色單芯大功率LED PT54-R。該 PT54-G以及PT54-R為采用先進的PhlatLight技術生產的單芯大功率LED芯片，光強分布成 近朗伯型，發散角較大。
[0051]進一步的，在本實施例中，通過Tracepro軟件分別構建所述內圓環LED陣列以及所 述外圓環LED陣列的面光源模型，獲取LED的總輻射通量和有效照明通量，并確定所述內圓 環LED陣列以及所述外圓環LED陣列的位置;所述面光源模型參數通過如下方式獲取：
[0052]設LED燈分布在xy平面上，則坐標系中待觀測的一點P(x，y，z)處的照度為：
[0054] 式中，（XQ，yQ)為LED在xy平面上的坐標，1〇為LED發光面法線上的光照強度，m為LED 光輻射模式，z為LED照明陣列至照明目標面的距離;根據PT54數據手冊，輻射場角分布曲線 接近余弦函數，半發光角度θ 1/2約為60度，也即發光強度值為軸向強度值一半時的發光角 度。根據111 = -1112/111((3〇8 91/2)，可得紅色?154-1?的111~1.0，綠色?154-6的111~3。
[0055]對于LED照明陣列的環形陣列排列，接受面上某一點的光照度為單個LED照度的線 性疊加，即由圓環上多個LED共同作用的結果，由于LED光強分布為發光角余弦多次方的函 數的類朗伯，如圖2所示，由上式可得照明目標面P點的線性疊加的照度，N多3:
[0057] 其中，N為內圓環LED陣列或外圓環LED陣列上的LED燈的總數，η為內圓環LED陣列 或外圓環LED陣列不同位置上的LED燈的序列號，P為內圓環LED陣列或外圓環LED陣列的半 徑；
[0058] 對該式進行求二次導：
[0060] 并依據斯派羅法則最大平坦條件，在x = 0，y = 0處令
得到：
[0062]根據預設的LED光輻射模式m，N以及P，進而獲取z。
[0063] 進一步的，在本實施例中，設計環形陣列的圓環上各有4顆PT54-R和4顆PT54-G大 功率LED，如圖2以及3所示排布，PT54是美國Lumlnus Devices公司的單色大功率單芯LED芯 片，發光面積5.4mm2，可產生4.1W光輻射輸出，輸出光通量超過750流明，這使得采用大功率 LED的照明設計大為簡單。DNA芯片常用CY3和CY5作為熒光染料，用以標記對照組mRNA和樣 品組mRNA。熒光激發照明系統設計采用4片綠色PT54-G作為CY3照明光源，采用4片紅色 PT54-R作為CY5照明光源。
[0064] 按機械尺寸設計取紅色LED芯片PT54-R的半徑PiSSOmm，在圖2所示的陣列設計， 當N = 4，m = 1，由上式可得z為36.74mm。對綠色照明通道，z取值36.74mm，由N = 4，m = 3,由 MATLAB工具求解上式可得p2為23.24mm，即PT54-G綠色大功率LED的圓環半徑為23.24mm。
[0065] 根據數據手冊，使用Tracepro軟件分別構建PT54-R和PT54-G的面光源模型，并按 圖3的陣列結構排布LED，對紅綠照明通道分別追跡2X10 6條光線，仿真數據分析見圖4。使 用Tracepro軟件，對該環形陣列模型的紅色LEDPT54-R的照明陣列進行仿真，在座標中心位 置30mmX30mm區域內，照明均勻度大于94%，其輻射照度分布如下圖5;對綠色LEDPT54-G的 照明陣列進行仿真，在座標中心位置30mmX30mm區域內，照明均勻度大于92%。其輻射照度 分布如下圖6所示。照明陣列的4片紅色PT54-R采用串聯供電，設置恒流供電電流10A，對應 供電電壓9.6V; 4片綠色色PT54-R也采用串聯恒流供電，設計電流8.1A，電壓17.6V。
[0066] 進一步的，在本實施例中，由于DNA掃描儀采用分時檢測CY3和CY5的熒光出射強 度，所以紅綠通道的LED電源通過使用與計算機系統匹配的STM32中的2路GPI0通道分時切 換供電繼電器，執行PT54-R和PT54-G陣列的單獨照明。
[0067] 進一步的，在本實施例中，在熒光分子采集方面，采集系統由微距鏡頭、窄帶鍍膜 濾光片還有冷卻型CCD相機構成，計算所述LED照明光源對熒光染料激發所產生的熒光分子 數，再結合所述冷卻型CCD相機探測到的最小的熒光光強系數，計算檢測靈敏度值，并通過 對所述冷卻型CCD相機的拍攝曝光時間進行預設置，進而獲取已經標記熒光染料的微點陣 圖像。
[0068]進一步的，在本實施例中，冷卻型CCD的量子效率遠高于光電倍增管PMT，得益于檢 測面成像的優勢，其并行多像素同時檢測，大大提高采集系統的工作速度。如圖1所示，基于 CCD的生物芯片掃描儀的熒光采集系統包括冷卻型CCD相機、光學成像鏡頭、熒光濾光片切 換系統和照明系統。記照射到所述被測熒光微陣列生物芯片表面的激發光功率密度為1_， 則每個熒光分子的激發速率為：
[0070] 式中，hv為吸收光子的能量，σ為熒光染料截面，σ與消光系數ε的關系式：
[0071] σ = 3·8Χ10-21e(cm2);
[0072] 記τ為熒光壽命，1Λ為熒光分子由激發態迀躍回基態的弛豫速率，記No為探針表 面激發光照明的熒光分子總數，他為受激發的熒光分子數，則熒光染料在受激照射并穩定 發射熒光時，存在以下的激發速率和消激速率的平衡：
[0078] 在本實施例中，CCD傳感器SONY ICX694AL，像素單元4.5411111\4.54咖，有效像素 2750 X 2200，設計光學掃描的物理分辨率As為10umX 10um，則成像鏡頭倍率為1/2.2，一次 掃描生物芯片面積22mmX 22mm。對應所述冷卻型CCD相機中CCD傳感器的每個像素，生物芯 片上面積為As熒光染料受激產生的熒光光子數 qe?為：
[0079] qem=Pf · As · Cs · ts
[0080] 式中，ts為所述(XD傳感器的積分時間，Cs為熒光染料濃度；
[0081] 熒光光子通過所述成像微距鏡頭成像光路到達所述CCD傳感器所形成響應電子數 Qs為：
[0083] 式中，Φ。^為所述CCD傳感器的量子效率，Kem為成像鏡片和熒光窄帶濾光片的總透 光率，NA為物鏡的數值孔徑。CCD的響應電子數q s與生物芯片的熒光染料濃度Cs的關系是檢 測裝置的設計基礎。
[0084] 進一步的，為了讓本領域技術人員進一步了解本發明所提出的技術方案，下面結 合具體實例進行說明。大功率LED陣列與CCD采集的生物芯片檢測方法的分析儀的工作流程 圖如圖7所示。放置好待檢測的生物芯片后，控制大功率LED陣列進行照明，根據圖8所示的 驅動控制參數，利用預先設定的驅動電流值對LED進行驅動，以滿足所需參數值標準;LED照 明開始時，同時打開CCD相機的快門進行曝光積分，采集到圖像后立即將數據傳送到計算機 中進行儲存，然后到計算機系統中進行圖像的去噪處理最終獲取生物熒光微陣列芯片的熒 光圖像。
[0085]以上是本發明的較佳實施例，凡依本發明技術方案所作的改變，所產生的功能作 用未超出本發明技術方案的范圍時，均屬于本發明的保護范圍。
【主權項】
1. 一種大功率Lm)的微陣列忍片巧光檢測方法，其特征在于，包括自上而下依次設置的 冷卻型CCD相機、窄帶鍛膜巧光濾波片、成像微距鏡頭、Lm)照明陣列W及被測巧光微陣列生 物忍片;所述冷卻型CCD相機連接至一計算機系統;所述LED照明陣列中的L邸燈經驅動電路 連接至所述計算機系統;通過所述計算機系統，經所述驅動電路輸出預設驅動電流，W驅動 所述Lm)照明陣列發光;所述被測巧光微陣列生物忍片上已經標記巧光染料的微點陣受激 產生巧光分子，通過所述冷卻型CCD相機對所述巧光分子進行多像素并行積分的方式曝光 成像，并將采集到的圖像傳送到所述計算機系統中進行儲存W及去噪處理，最終獲取所述 被測巧光微陣列生物忍片的巧光圖像。2. 根據權利要求1所述的一種大功率Lm)的微陣列忍片巧光檢測方法，其特征在于，所 述Lm)照明陣列為一環形陣列，且包括設置于同一水平面上的一內圓環Lm)陣列W及一外圓 環Lm)陣列;所述內圓環Lm)陣列W及所述外圓環Lm)陣列上均勻分布有若干個在發光面上 設置有濾光片的LED燈。3. 根據權利要求2所述的一種大功率Lm)的微陣列忍片巧光檢測方法，其特征在于，通 過化acepro軟件分別構建所述內圓環L抓陣列W及所述外圓環L抓陣列的面光源模型，獲取 L抓的總福射通量和有效照明通量，并確定所述內圓環L抓陣列W及所述外圓環Lm)陣列的 位置;所述面光源模型參數通過如下方式獲取： 設L邸燈分布在xy平面上，則坐標系中待觀測的一點P(x，y，z)處的照度為：式中，（x〇，y〇)為L邸在xy平面上的坐標，I日為Lm)發光面法線上的光照強度，m為Lm)光福 射模式，Z為L邸照明陣列至照明目標面的距離； 對于Lm)照明陣列的環形陣列排列，由上式可得照明目標面任意點的線性疊加的照度， 修3:其中，N為內圓環L抓陣列或外圓環L抓陣列上的L抓燈的總數，η為內圓環L抓陣列或外 圓環LED陣列不同位置上的LED燈的序列號，Ρ為內圓環LED陣列或外圓環LED陣列的半徑； 對該式進行求二次導，并依據斯派羅法則最大平坦條件，在x = 〇，y = 〇處令得到：根據預設的L邸光福射模式m，NW及P，進而獲取Z。4. 根據權利要求3所述的一種大功率Lm)的微陣列忍片巧光檢測方法，其特征在于，所 述內圓環L邸陣列上的L邸燈采用綠色單忍大功率LED PT54-G，所述外圓環L邸陣列上的LED 燈采用紅色單忍大功率LED PT54-R。5. 根據權利要求1所述的一種大功率Lm)的微陣列忍片巧光檢測方法，其特征在于，計 算所述L邸照明光源對巧光染料激發所產生的巧光分子數，再結合所述冷卻型CCD相機探測 到的最小的巧光光強系數，計算檢測靈敏度值，并通過對所述冷卻型CCD相機的拍攝曝光時 間進行預設置，進而獲取已經標記巧光染料的微點陣圖像。6. 根據權利要求5所述的一種大功率Lm)的微陣列忍片巧光檢測方法，其特征在于，記 照射到所述被測巧光微陣列生物忍片表面的激發光功率密度為lex。，則每個巧光分子的激 發速率為：式中，hv為吸收光子的能量，0為巧光染料截面，0與消光系數ε的關系式： 〇 = 3.8Xl〇-2iKcm2); 記τ為巧光壽命，1/τ為巧光分子由激發態遷躍回基態的弛豫速率，記No為探針表面激發 光照明的巧光分子總數，化為受激發的巧光分子數，則巧光染料在受激照射并穩定發射巧 光時，存在W下的激發速率和消激速率的平衡：對應所述冷卻型CCD相機中CCD傳感器的每個像素，生物忍片上面積為As巧光染料受激 產生的巧光光子數qem為： qem=Pf · As · Cs · ts 式中，ts為所述CCD傳感器的積分時間，Cs為巧光染料濃度； 巧光光子通過所述成像微距鏡頭成像光路到達所述CCD傳感器所形成響應電子數qs為：式中，Oeed為所述CCD傳感器的量子效率，Kem為成像鏡片和巧光窄帶濾光片的總透光 率，NA為物鏡的數值孔徑。7. 根據權利要求1所述的一種大功率Lm)的微陣列忍片巧光檢測方法，其特征在于，所 述巧光染料包括Cy 3 W及Cy 5。
【文檔編號】G01N21/64GK106092994SQ201610597471
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年7月27日 公開號201610597471.4, CN 106092994 A, CN 106092994A, CN 201610597471, CN-A-106092994, CN106092994 A, CN106092994A, CN201610597471, CN201610597471.4
【發明人】杜民, 甘振華, 高躍明, 柯棟忠, 楊丕胤
【申請人】福州大學