一種利用dapi熒光染料對活細胞內活性氧含量的檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種利用DAPI熒光染料對活細胞內活性氧含量的檢測方法，該方法能夠得到不同濃度下暴露污染物對應的單個活細胞的DCF熒光信號值。本發明對細胞內活性氧含量的檢測方法檢測結果精確，克服了由于污染物暴露導致細胞數量變化從而使最終熒光強度測量不準確的問題，本發明檢測方法能夠真實反映在某個濃度下對應的單個細胞熒光信號值，從而能夠真實準確反映污染物暴露對細胞的損傷，為體外細胞模型在污染物毒性評價中的應用打下了更為扎實的基礎。
【專利說明】
一種利用DAP I熒光染料對活細胞內活性氧含量的檢測方法
技術領域
[0001]本發明涉及一種利用DAPI熒光染料對活細胞內活性氧含量的檢測方法，屬于生物活性細胞檢測領域。【背景技術】
[0002]體外細胞模型是一種在離體狀態下模擬生物體生長環境，檢測外界刺激對細胞影響的技術。采用細胞作為試驗對象，具有敏感性高、能夠大大縮短試驗周期、作用機制易于探明等優勢，不僅提高了毒理學檢測的效率還減少了動物的使用，是生物學評價體系中重要的平臺。氧化損傷機制是多種污染物的重要致毒機制。在采用體外細胞模型評價污染物毒性的過程中，常常需要檢測細胞內的活性氧(R0S)含量以表征機體受到的氧化損傷。傳統的細胞內R0S檢測方法通過選擇合適的熒光探針對細胞進行孵育，然后通過記錄細胞所發射的熒光信號值強弱確定細胞內R0S含量。儀器記錄的熒光信號值是由每個細胞所發出的熒光強度和總的細胞數所決定的。但在現有的技術中，常常忽略細胞數量變化所導致的最終熒光強度的改變，從而導致檢測結果不準確。在污染物暴露過程中，由于污染物的影響可能會導致處理組和對照組之間活細胞數目的差異，因此有必要對各孔剩余的活細胞數量進行定量以補償細胞數量不同所造成的熒光信號值的差異。
【發明內容】
[0003]本發明所要解決的技術問題是提供一種利用DAPI熒光染料對活細胞內活性氧含量的檢測方法，該方法能夠得到不同濃度下暴露污染物對應的單個活細胞的DCF熒光信號值。
[0004]為解決上述技術問題，本發明所采用的技術方案如下:
[0005]—種利用DAPI熒光染料對活細胞內活性氧含量的檢測方法，包括如下步驟:
[0006]步驟1，選擇人肝癌細胞株HepG2作為試驗用細胞株，并對試驗用細胞株進行消化吹打處理形成細胞懸液；
[0007]步驟2,用血球計數板測定細胞懸液中的細胞密度，以每孔10000個細胞的密度將細胞種入96孔板中；
[0008]步驟3,種板24h后，對細胞進行染毒暴露，將不同濃度的暴露污染物分別加入不同的孔板中；
[0009]步驟4,染毒24h后，將每個孔板中原有培養基采用50yL DCF孵育液替換，于37°C下孵育25min，孵育后用PBS緩沖液清洗，采用酶標儀檢測各孔板內細胞的DCF熒光信號值；
[0010]步驟5,再向每個孔板加入lOOyL DAPI孵育液，于37°C下孵育20min，孵育后用ros 緩沖液洗滌，采用酶標儀檢測各孔板內細胞的DAPI熒光信號值，得到每個孔板中活細胞的數量；
[0011]步驟6，將步驟4得到的每個孔板中的DCF熒光信號值除以對應孔板中細胞的DAP I 熒光信號值，得到不同暴露污染物濃度下對應單個活細胞的DCF熒光信號值。
[0012]其中，步驟1中，先將試驗用細胞株用PBS緩沖液清洗;清洗后用胰蛋白酶-EDTA溶液消化細胞;細胞消化后用含血清的培養基終止消化;最后將得到的細胞懸液吹勻即可。
[0013]其中，步驟3中，所述暴露污染物為砷。[〇〇14]其中，步驟4中，所述DCF孵育液的濃度為10yM。[〇〇15]其中，步驟4中，所述DCF孵育液對應的DCFH-DA熒光染料的激發波長為485nm，發射波長為530nm〇[〇〇16] 其中，步驟5中，所述DAPI孵育液的濃度為2.5yg/ml。[〇〇17]其中，步驟5中，所述DAPI孵育液對應的DAPI熒光染料的激發波長為350nm，發射波長為460nm。
[0018]與現有檢測方法相比，本發明利用DAPI熒光染料對活細胞內活性氧含量的檢測方法具有的有益效果為:
[0019]本發明對細胞內活性氧含量的檢測方法檢測結果精確，克服了由于污染物暴露導致細胞數量變化從而使最終熒光強度測量不準確的問題，本發明檢測方法能夠真實反映在某個濃度下對應的單個細胞熒光信號值，從而能夠真實準確反映污染物暴露對細胞的損傷，為體外細胞模型在污染物毒性評價中的應用打下了更為扎實的基礎。【附圖說明】
[0020]圖1為不同濃度的As暴露后各孔板內活細胞的數量變化圖；[0021 ]圖2為不同濃度的As暴露后各孔板內細胞DCF熒光信號值變化圖；[〇〇22]圖3為對比實施例的檢測方法得到的不同濃度As暴露下各孔板內細胞DCF熒光信號值變化圖。【具體實施方式】[〇〇23]下面結合附圖對本發明技術方案作進一步說明。[〇〇24] 實施例1
[0025]—種利用DAPI熒光染料對活細胞內活性氧含量的檢測方法，包括如下步驟:[〇〇26]步驟1，選擇人肝癌細胞株HepG2作為試驗用細胞株，在顯微鏡下觀察其生長狀態， 去除原有培養基，用PBS緩沖液清洗細胞1?2次，往培養皿中加入lmL胰蛋白酶-EDTA溶液， 對細胞進行消化;待細胞消化結束，加入10mL含血清的新鮮培養基終止消化，將得到的細胞懸液吹勻；
[0027]步驟2,用血球計數板測定細胞懸液中的細胞密度，以每孔10000個細胞的密度將細胞種入96孔板中；
[0028]步驟3,種板24h后，對細胞進行染毒暴露，將不同濃度的暴露污染物砷分別加入不同的孔板中；
[0029]步驟4，利用DCFH-DA探針檢測砷暴露誘導下細胞內活性氧自由基(R0S)的含量，染毒24h后，將每個孔板中原有培養基采用50yL終濃度為10yM的DCF孵育液替換，于37°C下孵育25min，孵育后用PBS緩沖液清洗2次，采用酶標儀檢測各孔板內細胞的DCF熒光信號值；
[0030]步驟5，再向每個孔板中加入1 OOyL終濃度為2.5y g/ml的DAP I孵育液，于3 7 °C下孵育20min，孵育后用PBS緩沖液洗滌2次，采用酶標儀檢測各孔板內細胞的DAPI熒光信號值，得到每個孔板中活細胞的數量；
[0031]步驟6，將步驟4得到的每個孔板中的DCF熒光信號值除以對應孔板中細胞的DAP I 熒光信號值，得到不同暴露污染物濃度下對應每個活細胞的熒光信號值。[〇〇32] DCFH-DA熒光染料的激發波長為485nm，發射波長為530nm;DAPI熒光染料的激發波長為350nm，發射波長為460nm。
[0033]如圖1所示，通過DAPI熒光信號值可以看出，隨著暴露污染物砷(As)濃度的增加， 各孔板中活細胞數量出現顯著性減少；圖2為經過DAPI熒光信號值標準化后各孔板的DCF信號值，從圖2可以看出，從暴露污染物砷(As)濃度為5yM起，暴露污染物砷(As)濃度的增大顯著提高了細胞內的R0S含量，并呈現明顯的劑量-效應關系。[〇〇34]對比實施例
[0035]—種對細胞內活性氧含量的檢測方法，包括如下步驟:[〇〇36]步驟1，選擇人肝癌細胞株HepG2作為試驗用細胞株，在顯微鏡下觀察其生長狀態， 去除原有培養基，用PBS緩沖液清洗細胞1?2次，往培養皿中加入lmL胰蛋白酶-EDTA溶液， 對細胞進行消化;待細胞消化結束，加入10mL含血清的新鮮培養基終止消化，將得到的細胞懸液吹勻；
[0037]步驟2,用血球計數板測定細胞懸液中的細胞密度，以每孔10000個細胞的密度將細胞種入96孔板中；
[0038]步驟3,種板24h后，對細胞進行染毒暴露，將不同濃度的暴露污染物砷分別加入不同的孔板中；[〇〇39]步驟4,染毒24h后，將每個孔板中原有培養基采用50yL終濃度為10yM的DCF孵育液替換，于37°C下孵育25min，孵育后用PBS緩沖液清洗2次;采用酶標儀檢測各孔板內細胞的 DCF熒光信號值。
[0040] DCFH-DA熒光染料的激發波長為485nm，發射波長為530nm。[OO41 ] 如圖2?3所不，未經DAPI焚光信號值標準化的DCF焚光信號和標準化后的呈現很大不同:首先，本應存在顯著性差異的暴露污染物砷(As)濃度為5yM時處理組未表現出顯著性差異，其原因在于細胞數量的減少使得總的DCF熒光信號值變化不明顯;其次，圖3的實驗結果沒有明顯的劑量效應關系，其原因同樣是忽略了細胞數量變化所導致的。
【主權項】
1.一種利用DAPI熒光染料對活細胞內活性氧含量的檢測方法，其特征在于:包括如下 步驟:步驟1，選擇人肝癌細胞株HepG2作為試驗用細胞株，并對試驗用細胞株進行消化吹打 處理形成細胞懸液；步驟2，用血球計數板測定細胞懸液中的細胞密度，以每孔10000個細胞的密度將細胞 種入96孔板中；步驟3,種板24h后，對細胞進行染毒暴露，將不同濃度的暴露污染物分別加入不同的孔 板中；步驟4，染毒24h后，將每個孔板中原有培養基采用50yL DCF孵育液替換，于37°C下孵育 25min，孵育后用PBS緩沖液清洗，采用酶標儀檢測各孔板內細胞的DCF熒光信號值；步驟5,再向每個孔板加入lOOyL DAPI孵育液，于37°C下孵育20min，孵育后用ros緩沖 液洗滌，采用酶標儀檢測各孔板內細胞的DAPI熒光信號值，得到每個孔板中活細胞的數量；步驟6,將步驟4得到的每個孔板中的DCF熒光信號值除以對應孔板中細胞的DAPI熒光 信號值，得到不同暴露污染物濃度下對應單個活細胞的DCF熒光信號值。2.根據權利要求1所述的利用DAPI熒光染料對活細胞內活性氧含量的檢測方法，其特 征在于:步驟1中，先將試驗用細胞株用PBS緩沖液清洗;清洗后用胰蛋白酶-EDTA溶液消化 細胞;細胞消化后用含血清的培養基終止消化;最后將得到的細胞懸液吹勻即可。3.根據權利要求1所述的利用DAPI熒光染料對活細胞內活性氧含量的檢測方法，其特 征在于:步驟3中，所述暴露污染物為砷。4.根據權利要求1所述的利用DAPI熒光染料對活細胞內活性氧含量的檢測方法，其特 征在于:步驟4中，所述DCF孵育液的濃度為10yM。5.根據權利要求1所述的利用DAPI熒光染料對活細胞內活性氧含量的檢測方法，其特 征在于:步驟4中，所述DCF孵育液對應的DCFH-DA熒光染料的激發波長為485nm，發射波長為 530nm〇6.根據權利要求1所述的利用DAPI熒光染料對活細胞內活性氧含量的檢測方法，其特 征在于:步驟5中，所述DAPI孵育液的濃度為2.5yg/ml。7.根據權利要求1所述的利用DAPI熒光染料對活細胞內活性氧含量的檢測方法，其特 征在于:步驟5中，所述DAPI孵育液對應的DAPI熒光染料的激發波長為350nm，發射波長為 460nm〇
【文檔編號】G01N1/28GK106092991SQ201610503947
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月29日
【發明人】吳兵, 劉蘇, 張徐祥
【申請人】南京大學