癌細胞及細胞表面多糖檢測熒光/比色雙模式紙芯片的制備
【專利摘要】本發明公開了一種癌細胞及細胞表面多糖檢測熒光/比色雙模式紙芯片的制備的方法。利用蠟打印技術制備紙芯片，在熒光層工作區域生長金納米棒和多孔銀及適配體，進而進行癌細胞的捕獲，利用多枝鏈雜交技術實現信號分子的放大，從而實現癌細胞的精確測量，將制備好的紙芯片折疊，在反應區域滴加顯色溶液，從而實現癌細胞的可視化的預測定。隨后加入多糖抑制劑，從而實現細胞表面多糖的動態表征。
【專利說明】
癌細胞及細胞表面多糖檢測熒光/比色雙模式紙芯片的制備
技術領域
[0001]本發明涉及低成本、易于攜帶、可視化的癌細胞及細胞表面多糖分析檢測技術領域，更具體的說是一種能夠檢測癌細胞及細胞表面多糖的熒光/比色雙模式傳感器制備，本發明還涉及采用了多枝雜交鏈信號放大技術。【背景技術】
[0002]近年來，癌癥已經成了人類的頭號殺手，極大地威脅著人類健康，癌細胞的轉移和擴散是癌癥致命的重要原因，因此及早檢測和及時治療是克服癌癥的根本方法。多糖是細胞表面的重要結構，多糖通過與蛋白或脂質共價作用高密度的分布在細胞膜表面和內部。 細胞表面糖蛋白的動態變化與細胞的轉移、分化密切相關，因此對細胞表面多糖的檢測具有重要意義。目前，很多方法(如高效液相色譜、質譜、核磁共振等)被應用于多糖的分析，但是這些方法的破壞性很強，使活細胞表面多糖表達的動態表征不可行。此外，這些方法費時，需要復雜的樣品前處理和昂貴的儀器。而微流控紙基分析設備可視化的比色檢測與熒光檢測的聯合實現了低成本、易于攜帶、可視化的初檢及精確測定的完美結合。
[0003]為了提高癌細胞及多糖檢測的靈敏度，我們采用了多枝雜交鏈反應，與傳統的雜交鏈反應不同，多枝雜交鏈反應可以產生多支臂的長的產物，它可以吸附更多的信號分子從而實現有效的信號放大。同時為了提高癌細胞及多糖比色檢測的靈敏度，采用貴金屬復合納米材料作為模擬酶，因其比表面積大、生物相容性好，催化性能高等優點，在科學技術領域引起了巨大的關注。生長有這種貴金屬復合納米材料的紙芯片，不僅增加了紙芯片的比表面積，而且有效降低了紙的背景熒光。更由于不同組分之間的協同和電子效應使其催化性能大大的提高，因而廣泛應用于各種類型的生物傳感器中。采用量子點作為熒光生物探針，由于其獨特的物理和化學性質，如生物相容性好，易制備，寬的激發光譜，抗光漂白， 窄的、對稱的、可調的發射光譜，使得量子點用于標記生物材料，比使用有機熒光染料具有更好的熒光特性。用量子點補充或部分取代有機熒光標記材料，將可以開創超靈敏、高穩定的以及長發光壽命的生物分析檢測技術。鑒于以上優點，量子點必將成為最有前途的熒光標記物，因而量子點替代熒光染料作為熒光標記物大大提高了活細胞表面多糖的檢測的可行性。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供一種長有金納米棒和多孔銀的紙芯片及鉑銅納米鏈和氧化石墨烯量子點修飾的多枝雜交鏈信號放大技術實現熒光/比色雙模式傳感器的制備方法， 用于癌細胞及癌細胞表面多糖的快速、靈敏檢測。
[0005]為了解決上述技術問題，本發明是通過一種長有金納米棒和多孔銀的紙芯片及鉑銅納米鏈和氧化石墨烯量子點修飾的多枝雜交鏈信號放大技術來實現的，其特征是包括以下步驟:(1)設計紙芯片熒光層和比色層的疏水蠟打印區域和親水工作區域(附圖1);(2)在a熒光層的工作區域生長金納米棒和多孔銀層；(3)將適配體鏈固定在步驟(2)所得的紙芯片的工作區域，隨后采用牛血清白蛋白封閉活性位點，最后適配體鏈捕獲癌細胞；(4)將鉬銅(PtCu)納米鏈和石墨稀量子點(GQDs)修飾的多枝雜交鏈固定在步驟(3)所得的紙芯片的工作區域；(5)如附圖2所示，將步驟(4)所得的紙芯片折疊，在13比色層的工作區域滴加顯色底物、 pH為4?6的緩沖溶液和過氧化氫，進行比色預測定；(6)精確熒光測定:將步驟(4)所得的紙芯片放入熒光設備中，在激發波長360 nm和發射波長460 nm下進行焚光測定；(7)在步驟(4)所得的紙芯片工作區域滴加10~30 yL多糖抑制劑衣霉素；(8)將步驟(7)所得的紙芯片用于細胞表面糖基的測定，重復步驟(5)和步驟(6)。[00〇6] 本發明所設計焚光/比色雙模式紙芯片圖案用Adobe illustrator CS4軟件設計紙芯片的疏水蠟打印圖案，所用紙芯片的紙為色譜紙。
[0007]本發明所述熒光層的工作區域生長金納米棒和多孔銀層的步驟為:(1)合成金種子:量取160 mL的二次水置于三口燒瓶中，加熱到90 °C，隨后加入1.6 mL氯金酸，水浴加熱到96 °C，反應1 min，立即加入5.6 mL 1%梓檬酸鈉，并攪拌15 min至溶液變為酒紅色;取20 yL的金種子滴加到熒光層的工作區域，在室溫下放置45 min;(2)合成金納米棒和多孔銀層:取20.0 yL的1%氯金酸和新鮮制備的200 mM鹽酸羥胺滴加到已經有金種子的工作區域，室溫下生長10 min;隨后將新鮮制備的20.0 yL 24 mM硝酸銀和200 mM抗壞血酸滴加到上述已長有金納米棒的紙上，室溫下生長10 min;最后，用水徹底清洗，室溫下干燥30 min，制得紙芯片上金納米棒和多孔銀層。
[0008]本發明所述的將適配體鏈固定在步驟(2)所得的紙芯片的工作區域，隨后采用牛血清白蛋白封閉活性位點，最后適配體鏈捕獲癌細胞的步驟為:將20 yL適配體固定在金納米棒和多孔銀修飾過的紙芯片工作區域上，隨后加入20 y L牛血清白蛋白以封閉活性位點，最后加入20 yL不同濃度的癌細胞。
[0009]本發明所述的將PtCu納米鏈和GQDs修飾的多枝雜交鏈固定在步驟(3)所得的紙芯片的工作區域，步驟為:(1) 合成PtCu納米鏈:將1 mL磷酸三丁脂、18 mg六水氯化鎳及22 mL二次水加入到 100 mL三口燒瓶中，搖勻后超聲15 min，在氮氣保護下，邊強烈攪拌邊滴加5 mL新鮮制備的2 mg ml/1硼氫化鈉，隨后立即加入10 mL 6 mM六氯鉑酸鉀和氯化銅的混合液，將上述溶液超聲30 min，之后在60 °C水浴鍋中水浴加熱2 h，最后用乙醇和水洗，干燥即可得PtCu 納米鏈；(2)合成GQDs:稱取2 g檸檬酸放于5 mL燒杯中，加熱到180 °C，溶液顏色變為橙色，調節pH到中性，即可得到GQDs;(3)PtCu納米鏈和GQDs修飾的多枝雜交鏈:1-伴刀豆球蛋白(1-Con A)和Hl-GQDs用琥珀酰亞胺耦合的方法得到；將1-Con A、Hl-GQDs和H2用PTC-200加熱到95 °C保持10 min，并在30 s 內冷卻到4 〇C，隨后，100 yL 1-Con A 加到 1 mL Hl-GQDs 和 H2 (1:1) 中，37 °C反應過夜;最后，向上述溶液中加入1 mL PtCu納米鏈，反應15 min，離心，將得到的產物分散在緩沖溶液中；(4)固定PtCu納米鏈和GQDs修飾的多枝雜交鏈:將20 yL PtCu納米鏈和GQDs修飾的多枝雜交鏈固定在修飾過的紙芯片工作區域。[0〇1〇]本發明所述的顯色底物為3，_3,5，_5-四甲基聯苯胺，鄰苯二胺，2,2-連氮基-雙-(3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽。
[0011]本發明所述的pH為4?6的緩沖溶液為醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，磷酸鹽緩沖溶液， Tris鹽酸緩沖溶液。[〇〇12]本發明所述細胞表面糖基比色預測定步驟，分別滴加顯色底物、pH為4?6的緩沖溶液和過氧化氫，進行樣品的測定，繪制灰度與癌細胞濃度的標準曲線，實現癌細胞的可視化預檢，隨后固定細胞濃度不變，改變衣霉素的濃度，繪制灰度與糖基抑制劑衣霉素濃度的關系，實現癌細胞表面多糖的可視化預檢。
[0013]本發明所述細胞表面糖基熒光測定步驟，將紙芯片放入熒光皿中，進行樣品的測定，繪制熒光強度與癌細胞濃度的標準曲線，實現癌細胞的精確檢測，隨后固定細胞濃度不變，改變衣霉素的濃度，繪制熒光強度與糖基抑制劑衣霉素濃度的關系，實現癌細胞表面多糖的精確檢測。
[0014]本發明的有益效果(1)金納米棒和多孔銀層的使用，增大了比表面積及有效減少紙的背景熒光，提高了檢測的靈敏度。
[0015](2)多枝雜交鏈的采用，有效實現了熒光和比色信號的放大，使信號得到了大幅度的提尚。
[0016](3)用量子點代替熒光染料，比使用有機熒光分子具有更好的熒光特性，并開創超靈敏、高穩定的以及長發光壽命的生物分析檢測技術。
[0017](4)通過比色/熒光雙模式生物傳感器的聯用，實現了癌細胞及細胞表面多糖的可視化的比色初檢及進行精確的熒光測量。【附圖說明】
[0018]圖1:紙芯片a熒光層和比色層的疏水蠟打印圖案；圖2:紙芯片的尺寸及各層功能;紙芯片的折疊方式。【具體實施方式】
[0019]實施例1熒光/比色雙模式紙芯片在MCF-7細胞中的應用:(1)在計算機上設計紙芯片熒光層和比色層的疏水蠟打印區域和親水工作區域，將圖案打印在A4尺寸色譜紙；(2)在步驟(1)所得紙芯片熒光層的工作區域生長金納米棒和多孔銀層:量取160 mL的二次水置于三口燒瓶中，加熱到90 °C，隨后加入1.6 mL氯金酸，水浴加熱到96 °C，反應1 min，立即加入5.6 mL 1%梓檬酸鈉，并攪拌15 min至溶液變為酒紅色;取20 yL的金種子滴加到熒光層的工作區域，在室溫下放置45 min;取20.0 yL的1%氯金酸和新鮮制備的200 mM鹽酸羥胺滴加到已經有金種子的紙上，在室溫下生長10 min;隨后將新鮮制備的20.0 yL 24 mM硝酸銀和200 mM抗壞血酸滴加到上述已長有金納米棒的紙孔中，在室溫下生長10 min;最后，用水徹底清洗，并在室溫下干燥 30 min；(3)將適配體固定在步驟(2)所得的紙芯片的工作區域，將20 yL適配體固定在金納米棒和多孔銀層修飾過的紙芯片工作區域上，隨后加入20 yL牛血清白蛋白以封閉活性位點，最后加入20 yL—系列不同濃度的MCF-7細胞；(4)PtCu納米鏈和GQDs修飾的多枝雜交鏈固定在步驟(3)所得的紙芯片的工作區域，合成PtCu納米鏈:將1 mL磷酸三丁脂、18 mg六水氯化鎳及22 mL二次水加入到100 mL三口燒瓶中，搖勾后超聲15 min，在氮氣保護下，邊強烈攪拌邊滴加5 mL新鮮制備的2 mg ml/1 硼氫化鈉，隨后立即加入10 mL 6 mM六氯鉑酸鉀和氯化銅的混合液，將上述溶液超聲30 min，之后在60 °C水浴鍋中水浴加熱2 h，最后用乙醇和水洗，干燥即可得PtCu納米鏈；合成GQDs:稱取2 g檸檬酸放于5 mL燒杯中，加熱到180 °C，溶液顏色變為橙色，調節pH 到中性，即可得至IjGQDs;PtCu納米鏈和GQDs修飾的多枝雜交鏈:1-Con A和Hl-GQDs用琥珀酰亞胺耦合的方法得到；將1-Con A、Hl-GQDs和H2用PTC-200加熱到95 〇C保持10 min，并在30 s內冷卻至丨J4 °C，隨后，100 yL 1-Con A加到1 mL Hl-GQDs和H2 (1:1)中，37 °C反應過夜;最后， 向上述溶液中加入1 mL PtCu納米鏈，反應15 min，離心，將得到的產物分散在磷酸鹽緩沖溶液中；固定PtCu納米鏈和GQDs修飾的多枝雜交鏈:將20 yL PtCu納米鏈和GQDs修飾的多枝雜交鏈固定在修飾過的紙芯片工作區域；(5)將紙芯片放入熒光皿中，進行樣品的測定，繪制熒光強度與癌細胞濃度的標準曲線，實現MCF-7細胞的精確檢測，將紙芯片折疊，分別滴加30 yL 3，_3，5，_5-四甲基聯苯胺、pH 為4醋酸-醋酸鈉緩沖液和過氧化氫，進行樣品的測定，繪制灰度與癌細胞濃度的標準曲線， 實現MCF-7細胞的可視化預檢。
[0020] 實施例2熒光/比色雙模式紙芯片在MCF-7細胞表面多糖檢測中的應用:(1)在計算機上設計紙芯片熒光層和比色層的疏水蠟打印區域和親水工作區域，將圖案打印在A4尺寸色譜紙；(2)在步驟(1)所得紙芯片熒光層的工作區域生長金納米棒和多孔銀層:量取160 mL的二次水置于三口燒瓶中，加熱到90 °C，隨后加入1.6 mL氯金酸，水浴加熱到96 °C，反應1 min，立即加入5.6 mL 1%梓檬酸鈉，并攪拌15 min至溶液變為酒紅色;取20 yL的金種子滴加到熒光層的工作區域，在室溫下放置45 min;取20.0 yL的1%氯金酸和新鮮制備的200 mM鹽酸羥胺滴加到已經有金種子的紙上，在室溫下生長10 min;隨后將新鮮制備的20.0 yL 24 mM硝酸銀和200 mM抗壞血酸滴加到上述已長有金納米棒的紙孔中，在室溫下生長10 min;最后，用水徹底清洗，并在室溫下干燥 30 min；(3)將適配體固定在步驟(2)所得的紙芯片的工作區域，將20 yL適配體固定在經金納米棒和多孔銀層修飾過的紙芯片工作區域上，隨后加入20 yL牛血清白蛋白以封閉活性位點，最后加入20 yL固定濃度(106 cells/mL)的MCF-7細胞；(4)PtCu納米鏈和GQDs修飾的多枝雜交鏈固定在步驟(3)所得的紙芯片的工作區域，合成PtCu納米鏈:將1 mL磷酸三丁脂、18 mg六水氯化鎳及22 mL二次水加入到100 mL三口燒瓶中，搖勾后超聲15 min，在氮氣保護下，邊強烈攪拌邊滴加5 mL新鮮制備的2 mg ml/1 硼氫化鈉，隨后立即加入10 mL 6 mM六氯鉑酸鉀和氯化銅的混合液，將上述溶液超聲30 min，之后在60 °C水浴鍋中水浴加熱2 h，最后用乙醇和水洗，干燥即可得PtCu納米鏈；合成GQDs:稱取2 g檸檬酸放于5 mL燒杯中，加熱到180 °C，溶液顏色變為橙色，調節pH 到中性，即可得至IjGQDs;PtCu納米鏈和GQDs修飾的多枝雜交鏈:1-Con A和Hl-GQDs用琥珀酰亞胺耦合的方法得到；將1-Con A、Hl-GQDs和H2用PTC-200加熱到95 〇C保持10 min，并在30 s內冷卻至丨J4 °C，隨后，100 yL 1-Con A加到1 mL Hl-GQDs和H2 (1:1)中，37 °C反應過夜;最后， 向上述溶液中加入1 mL PtCu納米鏈，反應15 min，離心，將得到的產物分散在磷酸鹽緩沖溶液中；固定PtCu納米鏈和GQDs修飾的多枝雜交鏈:將20 yL PtCu納米鏈和GQDs修飾的多枝雜交鏈固定在修飾過的紙芯片工作區域；(5)滴加不同濃度的20 yL糖鏈抑制劑衣霉素；(6)將紙芯片放入熒光皿中，進行樣品的測定，繪制熒光強度與糖鏈抑制劑衣霉素濃度的關系，實現MCF-7細胞表面多糖的精確檢測，將紙芯片折疊，分別滴加30 yL 3，_3，5，_5-四甲基聯苯胺、pH為4醋酸-醋酸鈉緩沖液和過氧化氫，進行樣品的測定，繪制灰度與糖基抑制劑衣霉素濃度的關系，實現MCF-7細胞表面多糖的可視化預檢。
【主權項】
1.癌細胞及細胞表面多糖檢測熒光/比色雙模式紙芯片的制備，其特征是包括以下步 驟:1.1設計紙芯片熒光層和比色層的疏水蠟打印區域和親水工作區域；1.2在a熒光層的工作區域生長金納米棒和多孔銀層；1.3將適配體鏈固定在步驟1.2所得的紙芯片的工作區域，隨后采用牛血清白蛋白封閉 活性位點，最后適配體鏈捕獲癌細胞；1.4將鉑銅(PtCu)納米鏈和石墨烯量子點(GQDs)修飾的多枝雜交鏈固定在步驟1.3所 得的紙芯片的工作區域；1.5如附圖2所示，將步驟1.4所得的紙芯片折疊，在13比色層的工作區域分別滴加顯色 底物、pH為4?6的緩沖溶液和過氧化氫，進行比色預測定；1.6精確熒光測定:再將步驟1.4所得的紙芯片放入熒光設備中，在激發波長360 nm和 發射波長460 nm下進行焚光測定；1.7在步驟1.4所得的紙芯片工作區域滴加10~30 yL多糖抑制劑衣霉素；1.8將步驟1.7所得的紙芯片用于細胞表面糖基的測定，重復步驟1.5和步驟1.6。2.根據權利要求書1所述癌細胞及細胞表面多糖檢測熒光/比色雙模式紙芯片的制備， 其特征在于，用Adobe illustrator CS4軟件來設計紙芯片的疏水錯打印圖案和親水工作 區域圖案，所用紙芯片的紙為色譜紙。3.根據權利要求書1所述癌細胞及細胞表面多糖檢測熒光/比色雙模式紙芯片的制備， 其特征在于，在a熒光層的工作區域生長金納米棒和多孔銀層，具體步驟如下:首先合成金種子:量取160 mL的二次水置于三口燒瓶中，加熱到90 〇C，隨后加入1.6 mL氯金酸，水浴加熱到96 °C，反應1 min，立即加入5.6 mL 1%梓檬酸鈉，并攪拌15 min至 溶液變為酒紅色;取20 yL的金種子滴加到熒光層的工作區域，在室溫下放置45 min;合成金納米棒和多孔銀層:取20.0 yL的1%氯金酸和新鮮制備的200 mM鹽酸羥胺滴 加到已經有金種子的紙上，在室溫下生長10 min;隨后將新鮮制備的20.0 yL 24 mM硝酸銀 和200 mM抗壞血酸滴加到上述已長有金納米棒的紙孔中，在室溫下生長10 min;最后，用水 徹底清洗，并在室溫下干燥30 min。4.根據權利要求書1所述癌細胞及細胞表面多糖檢測熒光/比色雙模式紙芯片的制備， 其特征在于，所述的將適配體固定在步驟1.2所得的紙芯片的工作區域，隨后采用牛血清白 蛋白封閉活性位點，最后適配體鏈捕獲癌細胞，具體制備步驟如下:將20 yL適配體固定在金納米棒和多孔銀修飾過的紙芯片工作區域上，隨后加入20 yL 牛血清白蛋白以封閉活性位點，最后加入20 y L不同濃度的癌細胞。5.根據權利要求書1所述癌細胞及細胞表面多糖檢測熒光/比色雙模式紙芯片的制備， 其特征在于，所述的將PtCu納米鏈和GQDs修飾的多枝雜交鏈固定在步驟1.3所得的紙芯片 的工作區域，具體制備工藝如下:首先合成PtCu納米鏈:將1 mL磷酸三丁脂、18 mg六水氯化鎳及22 mL二次水加入到 100 mL三口燒瓶中，搖勻后超聲15 min，在氮氣保護下，邊強烈攪拌邊滴加5 mL新鮮制備 的2 mg ml/1硼氫化鈉，隨后立即加入10 mL 6 mM六氯鉑酸鉀和氯化銅的混合液，將上述溶 液超聲30 min，之后在60 °C水浴鍋中水浴加熱2 h，最后用乙醇和水洗，干燥即可得PtCu 納米鏈；合成GQDs:稱取2 g檸檬酸放于5 mL燒杯中，加熱到180 °C，溶液顏色變為橙色，調節pH 到中性，即可得至IjGQDs;PtCu納米鏈和GQDs修飾的多枝雜交鏈:1-伴刀豆球蛋白(Con A)和Hl-GQDs用琥珀酰 亞胺耦合的方法得到;將1-Con A、Hl-GQDs和H2用PTC-200加熱到95 °C保持10 min， 并在30 s 內冷卻到4 〇C，隨后，100 yL 1-Con A 加到 1 mL Hl-GQDs 和 H2 (1:1)中，37 0 C反應過夜;最后，向上述溶液中加入1 mL PtCu納米鏈，反應15 min，離心，將得到的產物 分散在緩沖溶液中；固定PtCu納米鏈和GQDs修飾的多枝雜交鏈:將20 yL PtCu納米鏈和GQDs修飾的多枝 雜交鏈固定在修飾過的紙芯片工作區域。6.根據權利要求書1所述癌細胞及細胞表面多糖檢測熒光/比色雙模式紙芯片的制備， 其特征在于，所述的顯色底物為3，_3，5，_5-四甲基聯苯胺，鄰苯二胺，2，2-連氮基-雙-(3-乙 基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽。7.根據權利要求書1所述癌細胞及細胞表面多糖檢測熒光/比色雙模式紙芯片的制備， 其特征在于，pH為4?6的緩沖溶液為醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，磷酸鹽緩沖溶液，Tri s鹽酸緩沖 溶液。8.根據權利要求書1所述癌細胞及細胞表面多糖檢測熒光/比色雙模式紙芯片的制備， 其特征在于，樣品的比色預測定步驟，分別滴加顯色底物、pH為4?6的緩沖溶液和過氧化氫， 進行樣品的測定，繪制灰度與癌細胞濃度的標準曲線，實現癌細胞的可視化預檢，隨后固定 細胞濃度不變，改變衣霉素的濃度，繪制灰度與糖鏈抑制劑衣霉素濃度的關系，實現癌細胞 表面多糖的可視化預檢。9.根據權利要求書1所述癌細胞及細胞表面多糖檢測熒光/比色雙模式紙芯片的制備， 其特征在于，樣品的熒光測定步驟，將紙芯片放入熒光皿中，進行樣品的測定，繪制熒光強 度與癌細胞濃度的標準曲線，實現癌細胞的精確檢測，隨后固定細胞濃度不變，改變衣霉素 的濃度，繪制熒光強度與糖鏈抑制劑衣霉素濃度的關系，實現癌細胞表面多糖的精確檢測。
【文檔編號】G01N21/64GK106092982SQ201610384836
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月2日 公開號201610384836.5, CN 106092982 A, CN 106092982A, CN 201610384836, CN-A-106092982, CN106092982 A, CN106092982A, CN201610384836, CN201610384836.5
【發明人】葛慎光, 梁琳琳, 于京華, 李麗, 蘭飛飛, 任娜, 劉海云, 張彥, 顏梅
【申請人】濟南大學