一種檢測玉米赤霉烯酮的熒光免疫層析試紙的制作方法

一種檢測玉米赤霉烯酮的熒光免疫層析試紙的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種檢測玉米赤霉烯酮的熒光免疫層析試紙，包括支撐體和固定在支撐體上的吸附層，吸附層從測試端開始依次為吸附纖維層、熒光抗體纖維層、纖維素膜層及吸水材料層，所述的纖維素膜層上設有用偶聯ZEN的載體蛋白溶液印制的隱形檢測印跡和用羊抗小鼠IgG、兔抗小鼠IgG或羊抗兔IgG抗體溶液印制的隱形對照印跡；所述的熒光抗體纖維層采用吸附熒光抗體的玻璃纖維棉制成，熒光抗體為氧化石墨烯熒光納米材料、NaYF4:Yb,Tm納米顆粒或NaGd(WO4)2：Eu3+納米顆粒標記的ZEN單克隆抗體或者多克隆抗體。本發明的試紙條具有特異性強、靈敏度高、穩定性高、安全性好、簡便、快速的特點，在便攜式熒光讀數儀下可實現現場定量檢測，能滿足不同層次人員的需要。
【專利說明】
-種檢測玉米赤霉稀酬的黃光免疫層析試紙
技術領域
[0001] 本發明設及一種免疫層析試紙，特別是設及一種檢測玉米赤霉締酬的巧光免疫層 析試紙。
【背景技術】
[0002] 玉米赤霉締酬(Zearalenone，稱ZEN)又稱F-2毒素，主要是由粉紅鑲刀菌及禾谷鑲 刀菌產生的一種非醬體霉菌毒素。廣泛存在于霉變的玉米、高梁、小麥、燕麥、大麥等谷類作 物W及奶中，是世界上污染范圍最廣的一種鑲刀菌毒素，全國的飼料原料及飼料中ZEN檢出 率高達100% dZEN是一種特殊毒性的生物毒素，具有類雌激素樣作用，能引起動物流產、死 胎、返情等生殖機能異常，還可W導致生長下降、免疫抑制、不育、崎形等，ZEN還可通過食物 鏈在人體中造成蓄積，進而每年給食品工業、飼料產業和畜牧業帶來巨大的經濟損失，也給 人類健康造成極大的危害，因此針對ZEN開展有效的快速檢測很有意義。我國國家標準GB 13078規定，在飼料及玉米中ZEN最高殘留限量《50化g/kg，目前用于ZEN的檢測方法主要有 生物鑒定法、化學分析法、儀器分析法和免疫分析法4大類。生物鑒定法的優點是待檢樣品 不需很純，缺點是靈敏度低、實驗周期較長。化學分析法的有點是經濟實用，但不能準確定 量，且分析結果的可重復性和再現性差。儀器分析法具有高分離、高檢測效能及快速分析能 力等優勢，但對樣品的前處理要求高，對操作人員技術要求高，且儀器設備價格昂貴，不適 于快速檢測。免疫分析法操作簡單，成本低，而且具有較好的準確性和靈敏性，同時能進行 定性和半定量或一定定量的檢測，適合于對大量樣品的篩查，是目前優先發展的檢測技術。
[0003] 未修飾的氧化石墨締表現出很弱的巧光，在紫外光照射下用肉眼基本上觀察不到 巧光。運是由于氧化石墨締納米片表面有很多含氧基團，例如納米片表面上的環氧鍵和徑 基，納米片側面的簇基，運些基團通常能誘導電子-空穴對的非福射復合，從而導致氧化石 墨締的巧光很弱。經過正下胺修飾W后，氧化石墨締納米片表面的環氧鍵和簇基都被反應 掉，運將極大地降低其非福射復合能力。因此修飾后，氧化石墨締表現出很強的巧光可作為 新型標記物在生物檢測領域應用。雖然膠體金試紙在此方面應用較廣，但其不能做到定量 檢測，作為更敏感、穩定、靈活、安全的氧化石墨締巧光層析試紙的研究，是膠體金免疫檢測 技術的有力補充。
[0004] 上轉換巧光納米顆粒經過表面修飾與活化后，作為新型標記物在生物檢測等領域 進行應用。因其獨特的物理結構和光學特性，使上轉換巧光免疫試紙法與理化檢測與微生 物檢測技術相比，具有靈敏度高，操作過程簡單，成本低及能進行大批量現場檢測的特點； 與膠體金試紙相比，具備定量檢測的特色，作為更敏感、穩定、靈活、安全的UPT-LF的研究， 是膠體金免疫檢測技術的有力補充。但是目前上轉換巧光材料的制備和試紙的研究仍存在 發光效率不夠，巧光材料種類少等缺陷，丞待加強該方面的研究和探討。
[0005] 下轉換巧光納米顆粒具有高靈敏度，是一種完全惰性的無機發光材料，具有獨特 物理結構和光學特性，可作為新型標記物應用在生物檢測領域。將其與生物學、免疫學、材 料學相結合而開發的用于ZEN快速檢測的下轉換巧光納米顆粒標記免疫層析方法，在靈敏、 穩定、靈活方面顯示了優異的特性，是膠體金免疫檢測技術的有利補充。

【發明內容】

[0006] 本發明所要解決的技術問題是提供一種檢測玉米赤霉締酬的巧光免疫層析試紙， 該試紙具有特異、靈敏、快速、簡便等特點，能定量檢測食品、飼料、中草藥中的玉米赤霉締 酬。
[0007] 為了實現上述目的，本發明所采用的技術方案是：
[0008] 一種檢測玉米赤霉締酬的巧光免疫層析試紙，包括支撐體和固定在支撐體上的吸 附層，吸附層從測試端開始依次為吸附纖維層、巧光抗體纖維層、纖維素膜層及吸水材料 層，所述的纖維素膜層上設有用偶聯ZEN的載體蛋白溶液印制的隱形檢測印跡和用羊抗小 鼠 IgG、兔抗小鼠 IgG或羊抗兔IgG抗體溶液印制的隱形對照印跡;所述的巧光抗體纖維層采 用吸附巧光抗體的玻璃纖維棉制成，巧光抗體為氧化石墨締巧光納米材料、化YF4:化，Tm納 米顆粒或NaGd(W〇4)2:Eu3+納米顆粒標記的ZEN單克隆抗體或者多克隆抗體。
[0009] 所述的支撐體包括設置在吸附層底面的底層和設置在吸附層頂面的面層。
[0010] 所述的支撐體包括透明的中空管體，吸附層填充在中空管體內部，吸附層從測試 端開始依次為吸附纖維層、巧光抗體纖維層、纖維素膜層及吸水材料層。
[0011] 所述的中空管體的上端裝有連接頭，連接頭上端設置有輔助吸附裝置，所述的輔 助吸附裝置包括與所述連接頭呈密封連接的連接套和設置在所述連接套上部的氣囊，氣囊 的出氣口依次經連接套上部的進氣通道、連接頭的內腔與中空管體的上口部相連通，進氣 通道所在的連接套側壁上設置有只能向外排氣無法向內吸氣的單向出氣裝置。
[0012] 所述的單向出氣裝置包括設置在進氣通道所在的連接套側壁的換氣腔，換氣腔內 設置有圓球形的密封球，換氣腔的底面上開有與密封球相對應的第一出氣口，第一出氣口 經出氣通道與進氣通道相連通，換氣腔側面設置有與外界大氣相連通的第二出氣口，構成 只能向外排氣、無法向進氣通道吸氣的單向出氣結構。
[0013] 所述的第一出氣口為圓形，其直徑小于密封球的直徑。
[0014] 所述的連接頭為上下開口的中空結構，其下端與中空管體的上端呈密封連接，連 接頭上部的外壁上設置有外螺紋，連接套的下部設置有與連接頭相對應的盲孔，盲孔內壁 上設置有與外螺紋相對應的內螺紋，連接頭通過外螺紋和內螺紋旋裝在連接套下部的盲孔 內，連接頭的頂部與盲孔頂部之間在連接套上設置有防止漏氣的密封圈。
[0015] 所述的隱形檢測印跡和隱形對照印跡呈相間設置在纖維素膜層的表面，間距為6- 10mm〇
[0016] 所述的中空管體的內腔為長方形。
[0017] 所述的氧化石墨締巧光納米材料是一種W氧化石墨締為基質通過酷氯化反應和 烷基胺來修飾后，用銀納米顆粒進行表征后得到的巧光納米材料。
[0018] 所述的氧化石墨締巧光納米材料標記的ZEN單克隆抗體或者多克隆抗體的制備方 法，包括W下步驟：
[0019] (1)氧化石墨締巧光材料修飾：
[0020] 取20mg氧化石墨磨碎，加入到5血DMF中，超聲混勻后，加入20mL二氯亞諷，80°C下 加熱回流48h后離屯、，得到中間體酷氯化氧化石墨締，用四氨巧喃洗涂兩次后，干燥;再在抽 真空氮氣保護的條件下，將酷氯化氧化石墨締和ImL正下胺混合，60°C反應72h，冷卻至室 溫，得到烷基胺修飾的氧化石墨締，分散于20mL雙蒸水中，80(K)r/min離屯、，除去未反應的正 下胺，將剩余的反應液通過旋轉蒸發儀蒸干，蒸干后的干物質重新分散在雙蒸水中，配制成 濃度為Img/mL的修飾的氧化石墨締巧光材料水溶液；
[0021 ] (2)表面標記ZEN抗體銀納米顆粒溶液的制備：
[0022] (a)將lOOmg硝酸銀溶解于250mL超純水中，加熱沸騰，加入lOmL質量分數1%的巧 樣酸鋼溶液，80°C加熱回流比后攬拌0.化，4°C條件下過夜;取ImL過夜后的溶液，加入ImM的 琉基乙酸10化，攬拌2地后離屯、，除去未反應的琉基乙酸，超純水洗涂3次，用旋轉蒸發儀蒸 干，加超純水配制成濃度為Img/mL琉基乙酸包覆的銀納米顆粒溶液；
[0023] (b)取O.lmM的邸C 10化和O.lmM的畑S 1化L，逐步加入到ImL琉基乙酸包覆的銀納 米顆粒溶液中，反應化，得到簇基活化的銀納米顆粒溶液；
[0024] (C)取O.lmM的ZEN單克隆抗體或多克隆抗體12化，加入到簇基活化的銀納米顆粒 溶液中，4°C反應過夜，得到表面標記ZEN抗體銀納米顆粒溶液；
[0025] (3)氧化石墨締巧光納米材料ZEN抗體的標記：
[00%]取修飾的氧化石墨締巧光材料水溶液5mL，加入2mL戊二醒，室溫反應化，離屯、，除 去未反應的戊二醒，將剩余的反應液分散在0.01mol/L、pH7.4的PBS緩沖溶液中，加入表面 標記ZEN抗體銀納米顆粒溶液，4°C反應化，經離屯、，收集氧化石墨締巧光納米材料標記的 ZEN單克隆抗體或者多克隆抗體，0.01mol/L、pH7.4的PBS緩沖液洗涂，保存備用。
[0027] 所述船￥。4:￥6，時1納米顆粒是^化￥&為基質、￥護為敏化劑，由化和時1共滲雜形成 的直徑為60~80nm的發藍色巧光的納米顆粒。
[00%]所述的化YF4:化，Tm納米顆粒標記的ZEN單克隆抗體或者多克隆抗體的制備方法， 包括W下步驟：
[0029] (1)采用水熱合成法制備NaYF4: Yb，Tm納米顆粒：
[0030] 分別取濃度均為0.5mo 1 /L的 Y ( N03 ) 3溶液5.5mL、化(N03 ) 3溶液0.5mL和Tm ( N03 ) 3溶 液0.5mL，混合均勻，再加入0.4mol/L的巧樣酸鋼溶液2mL，25 °C條件下避光充分反應化；加 入1.5mo 1/L NH4F溶液7血，25 °C條件下避光攬拌0.化，用HN03調節抑值至7.4，靜置0.化，加 雙蒸水稀釋至30ιΛ;再在220°C下反應2地，冷卻到室溫，經過濾、雙蒸水洗涂、干燥，得到發 藍色光的NaYF4:孔，化巧光納米顆粒；
[0031] (2)巧光納米顆粒的表面娃化：
[0032] 將化YF4: Yb，Tm巧光納米顆粒加入0.01mol/L、pH7.4的PBS緩沖液中，配制成濃度 為Img/血的化YF4: Yb，化巧光納米顆粒溶液，再將5mL濃氨水滴入5mL NaYF4: Yb，化巧光納米 顆粒溶液中，充分攬拌反應20min，再加入2.5mL正娃酸四乙醋，4°C避光條件下反應4h; 60(K)r/min離屯、lOmin，得到表面娃化的巧光納米顆粒，用乙醇洗涂4次，分散在甲醇中，配制 成濃度為lOmg/mL的巧光納米顆粒甲醇溶液；
[0033] (3)巧光納米顆粒的表面氨基化：
[0034] 取3mL巧光納米顆粒甲醇溶液，加入5mL的丙酬，密封后磁力攬拌20min，再用超聲 波均勻分散，加入化L的APTSA，密封后在40 °C反應30min，再在70 °C水浴反應化，600化/min 離屯、5min，得到表面氨基化的巧光納米顆粒，用乙醇反復洗涂4次，真空干燥后，4°C密封保 存；
[0035] (4)ZEN抗體的標記：
[0036] 用0.01mol/L、pH7.4的PBS緩沖溶液將表面氨基化的巧光納米顆粒溶解，配制成濃 度為lOmg/mL的表面氨基化的巧光納米顆粒溶液;取lOmL表面氨基化的巧光納米顆粒溶液 與5.6mg NHS和15mg EDC混合，室溫避光反應化，6000r/min離屯、5min，取上清液；將Img/mL 的ZEN單克隆抗體或者多克隆抗體加入上清液中，ZEN單克隆抗體或者多克隆抗體和上清液 的體積比為1:1〇〇,4°(：避光反應地，離屯、，雙蒸水洗涂后分散在?85緩沖溶液中，4°(：條件下 透析3d，離屯、，收集沉淀，得到rfeYF*: Yb，Tm納米顆粒標記的ZEN單克隆抗體或多克隆抗體， 置于PBS緩沖溶液中，4°C保存。
[0037] 所述的化Gd(W〇4)2:Eu3+納米顆粒是W氧化禮(Gd2〇3)、鶴酸鋼(化2W〇4 · 2此0)為基 質，館離子化U3+)為敏化劑，在條件反應下形成100~200nm的納米顆粒。
[0038] 所述的化Gd(W〇4)2:Eu3+納米顆粒標記的ZEN單克隆抗體或者多克隆抗體的制備方 法，包括W下步驟：
[0039] (1)采用水熱合成法制備NaGd(W〇4)2 :Eu3+納米顆粒
[0040] 稱取7g Gcb化和7g化2〇3,分別加入至50血的HN03中，加熱至80°C，保溫濃縮至全部 結晶，制得Gd(N〇3)3和Eu(N〇3)3 ;將化2W〇4 · 2此0溶于去離子水中，配制成濃度為0.2mol/L的 化2W〇4溶液;將制得的Gd(N〇3)3和Eu(N〇3)3用去離子水溶解，分別制備質量分數為80 %的Gd (N03)3溶液和質量分數為15 %的Eu(N03)3溶液，吸取配制的5mL Gd(N03)3溶液、1 OmL化2WO4 溶液和5mL Eu(N〇3)3溶液，加入到反應蓋中，用稀硝酸、氨氧化鋼調節抑=5,攬拌均勻，封閉 反應蓋，200°C恒溫加熱24h后，自然降至室溫;將反應蓋中溶液倒出靜置，待溶液中粉體沉 淀后，去除上清液，用蒸饋水洗涂粉體3次，每次靜置化;將洗好的粉體加熱至8(TC干燥12h， 得到NaGd(W〇4)2 :Eu3+納米顆粒；
[0041] (2)ZEN抗體的標記
[0042] 將ZEN單克隆抗體或多克隆抗體溶液1000化/min離屯、30min，除去雜質；用去離子 水溶解NaGd(W〇4)2:Eu3+納米顆粒，配制成濃度為0.1 mg/mL的NaGd(W〇4)2:Eu3+納米顆粒溶液， 然后用O.lmol/L K2CO3溶液調節NaGd(W〇4)2:Eu3+納米顆粒溶液至抑8.2;
[0043] 取lOmL化Gd(W〇4)2:Eu3+納米顆粒溶液，在攬拌狀態下，加入ZEN單克隆抗體或多 克隆抗體溶液10化1，ZEN單克隆抗體或多克隆抗體溶液濃度Img/mL，混勻，室溫溫育30min， 4°C、lOOOOr/min離屯、30min，棄上清，將沉淀用0.02mol/L化2B4O7溶液稀釋至10血，lOOOOr/ min離屯、30min，沉淀用0.02mol/L Na2B4〇7溶液稀釋至lmL，4°C保存備用。
[0044] 所述的吸附纖維層由玻璃纖維棉、尼龍膜、聚偏二氣乙締膜或聚醋膜制成。
[0045] 所述的吸水材料層由吸水濾紙制成。
[0046] 所述的纖維素膜層由硝酸纖維素膜、純纖維素膜或簇化纖維素膜制成。
[0047] 所述的偶聯ZEN的載體蛋白為牛血清白蛋白、雞卵清蛋白或血藍蛋白。
[004引所述隱形檢測印跡和隱形對照印跡還可W為"十十"字型排列印跡、"π"字型排 列印跡、《丄丄"字型排列印跡、"hi·"字型排列印跡或叫?，，字型排列印跡。
[0049] 所述的面層覆蓋在吸附纖維層、巧光抗體纖維層及吸水材料層上，在吸附纖維層 與巧光抗體纖維層交界處對應的面層上印制有樣品標記線，該樣品標記線偏向吸附纖維層 一偵帕.3~0.7畑1。
[0050] 本發明的試紙條具有特異性強、靈敏度高、穩定性高、安全性好、簡便、快速、結果 顯示形象、直觀、適用范圍廣、攜帶方便的特點。在便攜式巧光讀數儀下可實現現場定量檢 巧。。能滿足不同層次人員的需要，包括專業化驗、海關檢疫、衛生檢疫、質量監測、畜產品加 工、養殖戶W及消費者個人等。本發明在保障食品安全、保護消費者健康方面具有極其重要 的意義，將具有明顯的經濟效益和社會效益。
【附圖說明】
[0051] 圖1為實施例4的試紙的主視圖，圖中，2為吸附纖維層，3為巧光抗體纖維層，4為纖 維素膜層，7為吸水材料層，14為面層，15為底層。
[0052] 圖2為實施例4的試紙的俯視圖，圖中，4為纖維素膜層，5為隱形檢測印跡，6為隱形 對照印跡，14為面層，15為底層，16為樣品標記線。
[0053] 圖3為實施例5的試紙的主視圖，圖中，1為中空管體，2為吸附纖維層，3為巧光抗體 纖維層，4為纖維素膜層，5為隱形檢測印跡，6為隱形對照印跡，7為吸水材料層，8為連接頭， 9為連接頭的內腔，10為密封圈，11為單向出氣裝置，12為氣囊，13為連接套。
[0054] 圖4為圖3的A-A向剖視圖，圖中，1為中空管體，4為纖維素膜層，6為隱形對照印跡。
[0055] 圖5為圖3中的連接頭的主視圖，圖中，1為中空管體，8為連接頭。
[0056] 圖6為圖3中的連接頭的俯視圖，圖中，8為連接頭，9為連接頭的內腔。
[0057] 圖7為圖3中的連接套的剖視圖，圖中，10為密封圈，12為氣囊，13為連接套，111為 換氣腔，112為第二出氣口，113為密封球，114為第一出氣口，115為出氣通道，131為盲孔， 132為進氣通道。
【具體實施方式】
[0058] W下結合實施例對本發明的【具體實施方式】作進一步詳細說明。
[0化9]實施例1
[0060]檢測玉米赤霉締酬的巧光免疫層析試紙的制備，主要包括:ZEN人工抗原的制備、 ZEN單克隆抗體或多克隆抗體的制備、氧化石墨締巧光納米材料標記ZEN抗體的制備、纖維 素膜層的制備W及免疫層析試紙的組裝等步驟。
[0061 ] 1、偶聯ZEN載體蛋白的制備
[0062] 將ZEN與載體蛋白進行偶聯，制備人工合成抗原。
[0063] 稱取lOmg的ZEN溶于5mL化晚，避光攬拌反應12h，將所得溶液用氮氣吹干，加入5mL 雙蒸水，用等體積乙酸乙醋萃取3次，棄去水相，用氮氣吹干，得到油狀物A。稱取N-徑基班巧 酷亞胺（NHS)2.3mg、二環己基碳二亞胺(DCC)4. Img與3.18mg A充分混合后室溫過夜，產生 白色沉淀，離屯、后棄去沉淀，取上清得到B溶液。稱取BSA 5mg，溶于ImL的碳酸鹽緩沖液(pH 為9.6)中得C溶液，將B溶于緩慢加入C溶液中，避光室溫攬拌反應過夜。反應產物在4 °C攬拌 下用PBS透析3d，每天換液3~6次，透析后得到純化的ZEN-BSA。
[0064] 2、抗ZEN抗體的制備
[0065] (1)單克隆抗體的制備
[0066] 動物免疫：用制備的ZEN載體蛋白偶聯物W30yg~50yg/只的用量免疫6~8周齡 Ba化/C小鼠3~4次，每次免疫間隔時間3~5周，確定抗體效價符合要求后進行超強免疫，并 在融合之前檢測其抑制價。
[0067] 細胞融合:超強免疫后3~4天，將免疫小鼠眶下竇采血，分離陽性血清;脫頸致死， 用75%的酒精浸泡小鼠5~lOmin消毒體表，無菌取其脾臟，將脾臟剪碎并研磨，經120目尼 龍紗布過濾，l〇(K)r/min離屯、lOmin，收集脾細胞。將1X108的脾細胞與N&)骨髓瘤細胞按10:1 的比例混合，100化/min離屯、lOmin棄上清，將細胞沉淀物于37 °C水浴中緩緩加入0.7~ 1.0血的50 %陽G4000，Imin內加完，前30s加0.1~0.3mL，中間15s加0.2~0.4mL，最后15s加 完;然后緩緩加入無血清1640培養基15mL，W終止陽G的作用，37°C水浴5~10min，1000r/ min離屯、lOmin棄上清，將細胞沉淀物重懸于HAT選擇培養基中，并加入96孔細胞培養板中（8 ~10塊），！00化~200μLν孔，置于37°C、5%的C〇2培養箱中培養。
[0068] 單克隆抗體的篩選:培養10~14天，用間接化ISA法進行陽性孔篩選，選擇強陽性、 抑制率高、細胞生長旺盛的孔進行3~6次有限稀釋克隆化(直到細胞克隆為單克隆，檢測各 個克隆孔效價、抑制價基本一致），而后擴大培養，建立雜交瘤細胞株。所制備的雜交瘤細胞 分泌的單克隆抗體可特異地與ZEN反應，親和力常數達到l〇w~1〇12,輕鏈亞型為K或λ，重鏈 亞型為1肖61、1肖623、1肖626、1肖63，針對26卿寺異抗原決定簇的單克隆抗體，用于制備氧化石墨 締巧光納米材料標記抗體的玻璃纖維棉。
[0069] (2)多克隆抗體的制備
[0070] 用ΖΕΝ載體蛋白偶聯物免疫新西蘭白兔，免疫劑量為20化g~50化g/次，背部皮下 分4~6點注射。首免，用無菌PBS溶解制備的ZEN載體蛋白偶聯物，與等量弗氏完全佐劑 (FCA)混合，充分乳化;加強免疫，用無菌PBS溶解ZEN載體蛋白偶聯物，與等量弗氏不完全佐 劑(FIA)混合，充分乳化，首免后2~3周進行，連續免疫4~5次，每次間隔2~3周，最后一次 免疫后10~15天，W化ISA法測其定效價達到105W上時，采血并分離收集高免血清。
[0071] W飽和硫酸錠鹽析法提取IgG抗體，即取1份高免血清加2份PBS(抑7.2)混勻，加等 體積飽和硫酸錠溶液混勻，置4°C冰箱12h，4°C、250化/min離屯、15min，棄上清，再W適量PBS (PH7.2)溶解沉淀，加飽和硫酸錠溶液至終濃度33%，置4°C冰箱化，4°C、2500r/min離屯、 15min，棄上清，W適量PBS (抑7.2)溶解沉淀，置4 °C冰箱內用PBS (pH7.2)透析48~72h，中間 換液數次，4°C、12000r/min離屯、15min，收集上清，得純化的抗ZEN多克隆抗體，-20°C凍存， 用于制備氧化石墨締巧光納米材料標記抗體玻璃纖維棉。
[0072] 3、氧化石墨締巧光納米材料標記的ZEN單克隆抗體或者多克隆抗體的制備
[0073] (1)氧化石墨締巧光材料修飾：
[0074] 取20mg氧化石墨磨碎，加入到5mL二甲基甲酯胺(DMF)中，超聲混勻后，加入20血二 氯亞諷，80°C下加熱回流4她后離屯、，得到中間體酷氯化氧化石墨締，用四氨巧喃洗涂兩次 后，干燥;再在抽真空氮氣保護的條件下，將酷氯化氧化石墨締和ImL正下胺混合，60°C反應 72h，冷卻至室溫，得到烷基胺修飾的氧化石墨締，分散于20血雙蒸水中，800化/min離屯、，除 去未反應的正下胺，將剩余的反應液通過旋轉蒸發儀蒸干，蒸干后的干物質重新分散在雙 蒸水中，配制成濃度為Img/mL的修飾的氧化石墨締巧光材料水溶液；
[0075] (2)表面標記ZEN抗體銀納米顆粒溶液的制備：
[0076] (a)將lOOmg硝酸銀溶解于250mL超純水中，加熱沸騰，加入lOmL質量分數1%的巧 樣酸鋼溶液，80°C加熱回流比后攬拌0.化，4°C條件下過夜;取ImL過夜后的溶液，加入ImM的 琉基乙酸10化，攬拌2地后離屯、，除去未反應的琉基乙酸，超純水洗涂3次，用旋轉蒸發儀蒸 干，加超純水配制成濃度為Img/mL琉基乙酸包覆的銀納米顆粒溶液；
[0077] (b)取O.lmM的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺化0〇10化和O.lmM的N服10μ L，逐步加入到1 mL琉基乙酸包覆的銀納米顆粒溶液中，反應化，得到簇基活化的銀納米顆粒 溶液；
[0078] (C)取O.lmM的ZEN單克隆抗體或多克隆抗體12化，加入到簇基活化的銀納米顆粒 溶液中，4°C反應過夜，得到表面標記ZEN抗體銀納米顆粒溶液；
[0079] (3)氧化石墨締巧光納米材料ZEN抗體的標記：
[0080] 取修飾的氧化石墨締巧光材料水溶液5mL，加入2mL戊二醒，室溫反應化，離屯、，除 去未反應的戊二醒，將剩余的反應液分散在0.01mol/L、pH7.4的PBS緩沖溶液中，加入表面 標記ZEN抗體銀納米顆粒溶液，4°C反應化，經離屯、，收集氧化石墨締巧光納米材料標記的 ZEN單克隆抗體或者多克隆抗體，0.01mol/L、pH7.4的PBS緩沖液洗涂，保存備用。
[0081] 4、巧光抗體纖維層的制備
[0082] 將1:100~1:500稀釋的氧化石墨締巧光納米材料標記的ZEN抗體吸附于精制玻璃 纖維棉中，4Γ低溫真空干燥，制備氧化石墨締巧光納米材料標記抗體的玻璃纖維棉。
[0083] 5、吸附纖維素膜層的制備：
[0084] 纖維素膜層由硝酸纖維素制成，用點樣儀在纖維素膜層的不同位置分別噴點ZEN 人工抗原檢測印跡和兔抗鼠 IgG抗體(或羊抗鼠 IgG抗體、羊抗兔IgG抗體)對照印跡，于37Γ 烘干備用。
[0085] 6、免疫層析試紙的組裝
[0086] 將吸附纖維層、巧光抗體纖維層、纖維素膜層、吸水材料層從測試端開始依次貼在 帶有粘合劑的底層上，再在覆蓋上面層，并切成3-4cm寬的試紙即可。
[0087] 7、檢測反應原理
[0088] 當試紙測試端插入待測樣品溶液后，在虹吸作用帶動下，待測溶液中ZEN和巧光抗 體纖維層中的巧光抗體一起向纖維素膜層擴散，直至到吸水材料層。
[0089] 在擴散過程中，待測ZEN可與吸附在氧化石墨締上的ZEN抗體-銀納米顆粒相結合， 因抗原-抗體作用和靜電吸引作用，導致ZEN抗體-銀納米顆粒從氧化石墨締上剝離出來，進 而釋放氧化石墨締所散發的巧光，并和偶聯ZEN的載體蛋白結合。而羊抗鼠抗體則能與ZEN 抗原結合，在35化m紫外線激發下隱形檢測印跡線(T線）和隱形對照印跡線(C線)都會出現 吸收峰，通過巧光讀條儀讀取T線峰值定量檢測待測樣品中ZEN中的含量。反之，樣品中無 ZEN時，則T線和C線不會出現紫外吸收峰。
[0090] 實施例2
[0091] 實施例2中免疫層析試紙的制備和實施例1基本相同，主要不同之處在于：巧光抗 體為NaYF4:孔，化納米顆粒標記的ZEN單克隆抗體或者多克隆抗體。
[0092] 所述的化YF4:化，Tm納米顆粒標記的ZEN單克隆抗體或者多克隆抗體的制備方法， 包括W下步驟：
[0093] (1)采用水熱合成法制備NaYF4: Yb，Tm納米顆粒：
[0094] 分別取濃度均為 0.5mol/L 的 Y(N03)3 溶液 5.5mL、Yb(N〇3)3 溶液 0.5mL 和 Tm(N〇3)3 溶 液0.5mL，混合均勻，再緩慢加入0.4mol/L的巧樣酸鋼溶液2mL，25°C條件下避光充分反應 化;加入1.5mol/L NH4F溶液7mL，同條件下攬拌0.5h，用HN03調節抑值至7.4，靜置0.5h，加雙 蒸水稀釋至30ιΛ;再在220°C下反應2地，冷卻到室溫，經過濾、雙蒸水洗涂、干燥，得到發藍 色光的NaYF4:孔，化巧光納米顆粒；
[00M] (2)巧光納米顆粒的表面娃化：
[0096] 將化YF4: Yb，Tm巧光納米顆粒加入0.01mol/L、pH7.4的PBS緩沖液中，配制成濃度 為Img/血的化YF4: Yb，化巧光納米顆粒溶液，再將5mL濃氨水滴入5mL NaYF4: Yb，化巧光納米 顆粒溶液中，充分攬拌反應20min，再加入2.5mL正娃酸四乙醋，4°C避光條件下反應4h; 60(K)r/min離屯、lOmin，得到表面娃化的巧光納米顆粒，用乙醇洗涂4次，分散在甲醇中，配制 成濃度為lOmg/mL的巧光納米顆粒甲醇溶液；
[0097] (3)巧光納米顆粒的表面氨基化：
[009引取3mL巧光納米顆粒甲醇溶液，加入5mL的丙酬，密封后磁力攬拌20min，再用超聲 波均勻分散，加入化L的N-(2-氨乙基)-3-氨丙基Ξ甲氧基硅烷(APTSA)，密封后在40°C反應 30min，再在70 °C水浴反應化，600化/min離屯、5min，得到表面氨基化的巧光納米顆粒，用乙 醇反復洗涂4次，真空干燥后，4 °C密封保存；
[0099] (4)ZEN抗體的標記：
[0100] 用〇.〇lmol/L、pH7.4的PBS緩沖溶液將表面氨基化的巧光納米顆粒溶解，配制成濃 度為lOmg/mL的表面氨基化的巧光納米顆粒溶液;取lOmL表面氨基化的巧光納米顆粒溶液 與5.6mg NHS和15mg EDC混合，室溫避光反應化，6000r/min離屯、5min，取上清液；將Img/mL 的ZEN單克隆抗體或者多克隆抗體加入上清液中，ZEN單克隆抗體或者多克隆抗體和上清液 的體積比為1:1〇〇,4°(：避光反應地，離屯、，雙蒸水洗涂后分散在?85緩沖溶液中，4°(：條件下 透析3d，離屯、，收集沉淀，得到rfeYF*: Yb，Tm納米顆粒標記的ZEN單克隆抗體或多克隆抗體， 置于PBS緩沖溶液中，4°C保存。
[0101] 檢測反應原理
[0102] 當試紙測試端插入待測樣品溶液后，在虹吸作用帶動下，待測溶液中ZEN和巧光抗 體纖維層中的巧光抗體一起向纖維素膜層擴散，直至到吸水材料層。
[0103] 在擴散過程中，待測ZEN可與巧光抗體相結合，進而封閉巧光抗體上ZEN的抗原結 合點，阻止巧光抗體與纖維素膜上的ZEN人工抗原的檢測印跡結合，不能顯示檢測印跡，而 羊或兔抗小鼠 IgG(或羊抗兔IgG)抗體則可與巧光抗體結合，在紅外線激發下通過巧光讀條 儀T線處就不會出現吸收峰，C線處會出現吸收峰。反之樣品溶液中無 ZEN時，則不能阻止巧 光抗體與纖維素膜上偶聯ZEN載體蛋白的檢測印跡結合，通過巧光讀條儀T線處就會出現吸 收峰，同樣羊抗或兔抗小鼠 IgG(或羊抗兔IgG)抗體也能與巧光標記抗體結合，通過巧光讀 條儀C線處也會出現吸收峰。如果纖維素膜上沒有T線和C線吸收峰，則表明試紙條已失效。 實施例3
[0104] 實施例3中免疫層析試紙的制備和實施例1基本相同，主要不同之處在于：巧光抗 體為NaGd(W〇4)2:Eu3+納米顆粒標記的ZEN單克隆抗體或者多克隆抗體。
[0105] 所述的化Gd(W〇4)2:化納米顆粒標記的ZEN單克隆抗體或者多克隆抗體的制備方 法，包括W下步驟：
[0106] (1)采用水熱合成法制備NaGd(W〇4)2: Eu3+納米顆粒
[0107] 稱取7g Gcb化和7g化2〇3,分別加入至50血的HN03中，加熱至80°C，保溫濃縮至全部 結晶，制得Gd(N〇3)3和Eu(N〇3)3 ;將化2W〇4 · 2此0溶于去離子水中，配制成濃度為0.2mol/L的 化2W〇4溶液;將制得的Gd(N〇3)3和Eu(N〇3)3用去離子水溶解，分別制備質量分數為80 %的Gd (N03)3溶液和質量分數為15 %的Eu(N03)3溶液，吸取配制的5mL Gd(N03)3溶液、1 OmL化2W〇4 溶液和5mL Eu(N〇3)3溶液，加入到反應蓋中，用稀硝酸、氨氧化鋼調節抑=5,攬拌均勻，封閉 反應蓋，200°C恒溫加熱24h后，自然降至室溫;將反應蓋中溶液倒出靜置，待溶液中粉體沉 淀后，去除上清液，用蒸饋水洗涂粉體3次，每次靜置化;將洗好的粉體加熱至8(TC干燥12h， 得到NaGd(W〇4)2 :Eu3+納米顆粒；
[010引（2)ZEN抗體的標記
[0109] 將ZEN單克隆抗體或多克隆抗體溶液1000化/min離屯、30min，除去雜質；用去離子 水溶解NaGd(W〇4)2:Eu3+納米顆粒，配制成濃度為0.1 mg/mL的NaGd(W〇4)2:Eu3+納米顆粒溶液， 然后用O.lmol/L K2CO3溶液調節NaGd(W〇4)2:Eu3+納米顆粒溶液至抑8.2;
[0110] 取lOmL化Gd(W化)2:Eu3+納米顆粒溶液，在攬拌狀態下，加入ZEN單克隆抗體或多 克隆抗體溶液10化1，ZEN單克隆抗體或多克隆抗體溶液濃度Img/mL，混勻，室溫溫育30min， 4°C、lOOOOr/min離屯、30min，棄上清，將沉淀用0.02mol/L化2B4O7溶液稀釋至10血，lOOOOr/ min離屯、30min，沉淀用0.02mol/L Na2B4〇7溶液稀釋至lmL，4°C保存備用。
[011。 檢測反應原理
[0112] 當試紙測試端插入待測樣品溶液后，待測溶液通過虹吸作用帶動待測ZEN及巧光 納米顆粒標記抗體玻璃纖維棉中的下轉換巧光納米顆粒化Gd(W化)2: Eu3+標記抗體一起向 纖維素膜層擴散，并最終滲入手柄端的吸水材料層。在擴散過程中，待測ZEN可與巧光納米 顆粒標記抗體纖維層中的下轉換巧光納米顆粒標記抗體相結合，進而封閉下轉換巧光納米 顆粒標記抗體上ZEN的抗原結合點，阻止下轉換巧光納米顆粒標記抗體與纖維素膜上偶聯 ZEN載體蛋白的檢測印跡結合，試紙上無法顯示檢測印跡，而羊或兔抗小鼠 IgG(或羊抗兔 IgG)抗體則可與下轉換巧光納米顆粒標記抗體結合，在紅外線激發下通過巧光讀條儀T線 處就不會出現吸收峰，C線處會出現吸收峰。反之樣品溶液中若無 ZEN，則不能阻止下轉換巧 光納米顆粒標記抗體與纖維素膜上偶聯ZEN載體蛋白的檢測印跡結合，通過巧光讀條儀T線 處就會出現吸收峰，同樣羊抗或兔抗小鼠 IgG(或羊抗兔IgG)抗體也能與下轉換巧光納米顆 粒標記抗體結合，通過巧光讀條儀C線處也會出現吸收峰。如果纖維素膜上沒有T線和C線吸 收峰，則表明試紙條已失效。
[0113] W下結合其他實施例具體說明免疫層析試紙的結構和檢測方法
[0114] 實施例4
[0115] 本實施例的檢測玉米赤霉締酬的巧光免疫層析試紙，參照圖1-2,包括支撐體和固 定在支撐體上的吸附層，吸附層從測試端開始依次為吸附纖維層2、巧光抗體纖維層3、纖維 素膜層4及吸水材料層7,所述的纖維素膜層上設有用偶聯ZEN的載體蛋白溶液印制的隱形 檢測印跡5和用羊抗小鼠 IgG、兔抗小鼠 IgG或羊抗兔IgG抗體溶液印制的隱形對照印跡6;所 述的巧光抗體纖維層采用吸附巧光抗體的玻璃纖維棉制成，巧光抗體為氧化石墨締巧光納 米材料標記的ZEN單克隆抗體或者多克隆抗體。
[0116] 所述的支撐體包括設置在吸附層底面的底層15和設置在吸附層頂面的面層14。
[0117] 所述的面層覆蓋在吸附纖維層、巧光抗體纖維層及吸水材料層上，在吸附纖維層 與巧光抗體纖維層交界處對應的面層上印制有樣品標記線16,該樣品標記線偏向吸附纖維 層一偵 1|0.3 ~0.7cm。
[0118] 為了更好的技術效果，所述的隱形檢測印跡5和隱形對照印跡6呈相間設置在纖維 素膜層4的表面，即兩條印跡帶平行排列成V/"，間距為6~10mm。
[0119] 覆蓋在吸附纖維層和巧光抗體纖維層上面的面層為白色，覆蓋在吸水材料層上面 的面層為其它顏色(如黃色），測試樣品標記線位于吸附纖維層與巧光抗體纖維層交界處對 應的白色面層偏向吸附纖維層一側約0.5cm處，在標記線右側面層上印有箭頭及max字樣。
[0120] (1)待測樣品的制備及檢測步驟：
[0121] 檢測玉米樣:將樣品粉碎，用無水乙醇稀釋制成l:10(m/v)的樣品懸液。
[0122] 操作方法:將ZEN試紙測試端插入待測樣品中，插入深度不超過標記線，約10~20 秒鐘取出試紙，5min后放入巧光讀條儀直接讀值。
[0123] 結果判定：
[0124] (a)陽性判定:通過巧光讀條儀T線和C線處都出現吸收峰，表示檢測結果為陽性， 說明在待測樣品中含有ZEN;
[0125] (b)陰性判定：通過巧光讀條儀T線和C線處都不出現吸收峰，表示檢測結果為陰 性，說明在待測樣品中不含ZEN;
[0126] (C)失效判定:通過巧光讀條儀T線不出現吸收峰，C線處出現吸收峰，或T線處出現 吸收峰，C線處不出現吸收峰，則表明試紙已失效。
[0127] (2)本實施例免疫層析試紙的靈敏性、特異性檢測
[01%]靈敏性的檢測：用憐酸鹽緩沖液PBS(抑7.4)或雙蒸水分別配制濃度為1、2、3、4、 5、10、20、30、50ng/mL的ZEN標準品，在本實施例的免疫層析試紙上上樣80~1 OOyL，反應 5min后，通過讀條儀讀取T線掃描面積光密度的相對光密度值（relative optical (161131*7，1?00)。^不同濃度標準品與空白標準品相對光密度值的百分率為縱坐標，^不同 標準品濃度的常用對數值為橫坐標，繪制標準曲線，進行相關回歸分析，計算該試紙對ZEN 的ICso和最低檢測限。經測定，該試紙ZEN對的曲線回歸方程為:y = -0.3164X+0.984，相關系 數為R2 = 0.996，根據回歸方程計算出該試紙對ZEN的IC50為33.86ng/mL，該試紙的最低檢測 限為4.87ng/mL，表明免疫層析試紙對ZEN具有較高的靈敏度。
[0129] 特異性的檢測其他真菌毒素作為競爭物，配制上述標準品不同濃度，用免疫層 析試紙檢測其抑制率，W該試紙對ZEN的與IC50各競爭物IC50的百分比作為其交叉反應率。 測定結果見表1。由表1可看出，該免疫層析試紙的特異性較好，與其他真菌毒素均無交叉反 應。
[0130] 表1免疫層析試紙與其他真菌毒素的交叉反應
[0131]
[0132]
[0133] 本實施例的試紙條具有W下優點：
[0134] (1)特異性強，靈敏度高。本實施例的試紙條W氧化石墨締巧光納米材料標記的 ZEN抗體為基礎制成，由于經修飾過的氧化石墨締巧光材料具有非凡光學特性和良好的生 物相容性，同時氧化石墨締電子傳遞效率高，使得運種新型免疫方法靈敏度高，檢測極限 低，最低僅為4.87ng/mL。
[0135] (2)穩定性高，安全性好。本實施例的試紙條氧化石墨締巧光納米材料標記的ZEN 抗體為基礎制成，納米銀顆粒表面與蛋白質帶有相反的電荷基團，因靜電吸附而牢固結合； 石墨締比表面積大，能與多種蛋白質生物分子通過化學反應結合，而對其生物活性影響很 小，穩定性高，靈活性好。
[0136] (3)本實施例的氧化石墨締巧光免疫層析試紙可對玉米、DDGS、飼料等進行檢測。 通過銀納米和氧化石墨締共同作用，檢測信號增強，降低抗體用量，節省抗體成本。
[0137] 實施例5
[0138] 本實施例的檢測玉米赤霉締酬的巧光免疫層析試紙，參照圖3-7,包括支撐體和固 定在支撐體上的吸附層，所述的支撐體包括透明的中空管體1，吸附層填充在中空管體內 部，吸附層從測試端開始依次為吸附纖維層2、巧光抗體纖維層3、纖維素膜層4及吸水材料 層7,所述的纖維素膜層上設有用偶聯ZEN的載體蛋白溶液印制的隱形檢測印跡5和用羊抗 小鼠 IgG、兔抗小鼠 IgG或羊抗兔IgG抗體溶液印制的隱形對照印跡6;所述的巧光抗體纖維 層采用吸附巧光抗體的玻璃纖維棉制成，巧光抗體為化YF4:化，Tm納米顆粒標記的ZEN單克 隆抗體或者多克隆抗體。
[0139] 所述的中空管體1的上端裝有連接頭8,連接頭8上端設置有輔助吸附裝置，所述的 輔助吸附裝置包括與所述連接頭呈密封連接的連接套13和設置在所述連接套上部的氣囊 12,氣囊12的出氣口依次經連接套13上部的進氣通道132、連接頭8的內腔9與中空管體1的 上口部相連通，進氣通道所在的連接套側壁上設置有只能向外排氣無法向內吸氣的單向出 氣裝置11。
[0140] 所述的單向出氣裝置包括設置在進氣通道所在的連接套側壁的換氣腔111，換氣 腔111內設置有圓球形的密封球113，換氣腔111的底面上開有與密封球相對應的第一出氣 口 114,第一出氣口經出氣通道115與進氣通道132相連通，換氣腔111側面設置有與外界大 氣相連通的第二出氣口 112,構成只能向外排氣、無法向進氣通道吸氣的單向出氣結構。
[0141] 為了更好的技術效果，所述的第一出氣口 114為圓形，其直徑小于密封球的直徑。 運樣的設置能夠使第一出氣口與圓球形的密封球更加緊密的結合，保證空間的密封性。
[0142] 所述的連接頭8為上下開口的中空結構，其下端與中空管體1的上端呈密封連接， 連接頭上部的外壁上設置有外螺紋，連接套13的下部設置有與連接頭相對應得盲孔131，盲 孔131內壁上設置有與外螺紋相對應的內螺紋，連接頭通過外螺紋和內螺紋旋裝在連接套 下部的盲孔131內，連接頭的頂部與盲孔頂部之間在連接套上設置有防止漏氣的密封圈10。
[0143] 所述的隱形檢測印跡5和隱形對照印跡6呈相間設置在纖維素膜層4的表面，間距 為6~10mm。
[0144] 所述的中空管體1的內腔為長方形。
[0145] 測試樣品標記線位于吸附纖維層與巧光抗體纖維層交界處對應的透明中空管體 上偏向吸附纖維層一側約0.5cm處，在標記線右側的透明中空管體上印有箭頭及max字樣。
[0146] 使用時，將連接套和連接頭通過內外螺紋連接在一起，輕輕擠壓氣囊，氣囊中的氣 體通過進氣通道、連接頭的內腔和連接套側壁的換氣腔向外排出，此時換氣腔內的圓球形 密封球被從氣囊中擠壓出的氣體抬起，氣囊中的氣體通過第一出氣口順利向外排出；將試 紙插入待測樣品溶液中，然后松開氣囊，此時，中空管體的內腔、連接頭的內腔和進氣通道 內產生負壓，在負壓的吸引下，密封球緊緊吸附在換氣腔的底面上的第一出氣口上，將其封 閉，從而幫助樣品溶液更加快速的浸潤試紙，從而減少樣品溶液浸潤試紙條的時間，提高檢 測效率。
[0147] 由上述情況可W清楚的看出，本實施例結構新穎獨特，簡單合理，通過將支撐體整 體修改為密閉結構，同時在支撐體的頂部增加氣囊，使吸收更加迅速，從而有效提高檢測的 速度和準確度，同時氣囊部分和支撐體部分為密封拆裝式連接，檢測完畢后只需更換支撐 體部分即可，拆裝方便，易操作，使用效果好，是檢測試紙上的創新。
[0148] (1)待測樣品的制備及檢測步驟：
[0149] 檢測DDGS樣:將樣品粉碎，用無水乙醇稀釋制成l:10(m/v)的樣品懸液。
[0150] 操作方法:擠壓氣囊，將氣囊內的氣體排出，將ZEN試紙測試端插入待測樣品中，插 入深度不超過標記線，松開氣囊，約3-5秒鐘取出試紙，4min后放入巧光讀條儀直接讀值。
[0151] 結果判定：
[0152] (a)陽性判定:通過巧光讀條儀T線處不出現吸收峰，C線處出現吸收峰，表示檢測 結果為陽性，說明在待測樣品中含有玉米赤霉締酬；
[0153] (b)陰性判定:通過巧光讀條儀T線和C線處都出現吸收峰，表示檢測結果為陰性， 說明在待測樣品中不含玉米赤霉締酬；
[0154] (C)失效判定:通過巧光讀條儀T線和C線處都不出現吸收峰，則表明試紙已失效。
[0155] (2)本實施例免疫層析試紙的靈敏性、特異性檢測
[0156] 用憐酸鹽緩沖液PBS(pH 7.4)或雙蒸水分別配制濃度為1、2、3、4、5、10、20、30、 50ng/mL的ZEN標準品，在本實施例的免疫層析試紙上上樣80~10化L，反應4min后，通過讀 條儀讀取T線掃描面積光密度的相對光密度值(relative optical density, ROD)。W不同 濃度標準品與空白標準品相對光密度值的百分率為縱坐標，W不同標準品濃度的常用對數 值為橫坐標，繪制標準曲線，進行相關回歸分析，計算該試紙對ZEN的IC50和最低檢測限。經 測定，該試紙ZEN對的曲線回歸方程為:y = -0.4134X+0.8893，相關系數為R2 = 0.996，根據 回歸方程計算出該試紙對ZEN的IC50為44.86ng/mL，該試紙的最低檢測限為5.78ng/mL，表明 免疫層析試紙對ZEN具有較高的靈敏度。
[0157] 特異性的檢測其他真菌毒素作為競爭物，配制上述標準品不同濃度，用免疫層 析試紙檢測其抑制率，W該試紙對ZEN的與IC50各競爭物IC50的百分比作為其交叉反應率。 測定結果見表2。由表2可看出，該免疫層析試紙的特異性較好，與其他真菌毒素均無交叉反 應。
[0158] 表2免疫層析試紙與其他真菌毒素的交叉反應
[0159] _
[0160] 本實施例的試紙條具有W下優點:
' '
[0161] (1)特異性強，靈敏度高。本實施例上轉換巧光免疫層析試紙W發藍色光譜的上轉 換巧光納米材料化YF4: Yb，化標記的ZEN抗體為基礎制成，由于NaYF4: Yb，Tm納米顆粒發光效 率高，能有效消除樣品檢測背景光，靈敏度大幅提高。
[0162] (2)穩定性高，安全性好。本實施例的試紙中上轉換巧光納米材料化YF4:化，Tm能 有效發射藍色光譜，完全避免了其他條件引起的發光澤滅。NaYF4:Yb，Tm材料具有無機惰 性、紅外光激發、可見光發射的特點，使用該試紙進行檢測對于周圍人員與環境無任何危 害。
[0163] (3)簡便、快速。利用巧光讀條儀，該試紙可直接讀值，實現現場快速定量檢測。只 要將試紙插入被檢樣品3~5秒鐘，4分鐘后即可讀取結果，在T線處無吸收峰表示被檢樣品 中含有ZEN;反之，不含ZEN。結果直觀、準確，簡單明了，最大限度的避免了人為誤判。
[0164] (4)本實施例的試紙制備時，巧光抗體采用化YF4:Yb，Tm納米顆粒標記的ZEN單克 隆抗體或多克隆抗體，即將氨基化的化YF4:化，Tm納米顆粒直接與抗體相連，標記過程簡 單，偶聯率高，從而有效提高基于NaYF4:孔，Tm材料的免疫試紙的靈敏度。
[01化]實施例6
[0166] 本實施例的檢測玉米赤霉締酬的巧光免疫層析試紙的結構同實施例4,不同之處 在，本實施例的巧光抗體為化Gd(W化)2:Eu3+納米顆粒標記的ZEN單克隆抗體或者多克隆抗 體。
[0167] (1)待測樣品的制備及檢測步驟：
[016引檢測孤GS樣:將樣品粉碎，用無水乙醇稀釋制成l:10(m/v)的樣品懸液。
[0169] 操作方法:擠壓氣囊，將氣囊內的氣體排出，將ZEN試紙測試端插入待測樣品中，插 入深度不超過標記線，松開氣囊，約3-5秒鐘取出試紙，4min后放入巧光讀條儀直接讀值。
[0170] 結果判定：
[0171] (a)陽性判定:通過巧光讀條儀T線處不出現吸收峰，C線處出現吸收峰，表示檢測 結果為陽性，說明在待測樣品中含有玉米赤霉締酬；
[0172] (b)陰性判定:通過巧光讀條儀T線和C線處都出現吸收峰，表示檢測結果為陰性， 說明在待測樣品中不含玉米赤霉締酬；
[0173] (C)失效判定:通過巧光讀條儀T線和C線處都不出現吸收峰，則表明試紙已失效。
[0174] (2)本實施例免疫層析試紙的靈敏性、特異性檢測
[01巧]用憐酸鹽緩沖液PBS(pH 7.4)或雙蒸水分別配制濃度為1、2、3、4、5、10、20、30、 50ng/mL的ZEN標準品，在本實施例的免疫層析試紙上上樣80~10化L，反應4min后，通過讀 條儀讀取τ線掃描面積光密度的相對光密度值(relative optical density, ROD)。w不同 濃度標準品與空白標準品相對光密度值的百分率為縱坐標，W不同標準品濃度的常用對數 值為橫坐標，繪制標準曲線，進行相關回歸分析，計算該試紙對ZEN的IC50和最低檢測限。經 測定，該試紙ZEN對的曲線回歸方程為:y = -0.3467X+0.8841，相關系數為R2 = 0.987，根據 回歸方程計算出該試紙對ZEN的1C日日為45.8ng/mL，該試紙的最低檢測限為5.36ng/mL，表明 免疫層析試紙對ZEN具有較高的靈敏度。
[0176] 特異性的檢測其他真菌毒素作為競爭物，配制上述標準品不同濃度，用免疫層 析試紙檢測其抑制率，W該試紙對ZEN的與IC50各競爭物IC50的百分比作為其交叉反應率。 測定結果見表3。由表3可看出，該免疫層析試紙的特異性較好，與其他真菌毒素均無交叉反 應。
[0177] 表3免疫層析試紙與其他真菌毒素的交叉反應 [017 引
[0179] 本實施例的試紙條具有W下優點：
[0180] (1)特異性強，靈敏度高。本實施例下轉換巧光納米顆粒標記免疫層析試紙是W氧 化禮(Gcb化）、鶴酸鋼(化2W〇4 · 2此0)為基質，館離子巧u3+)為敏化劑形成的100~200nm納米 顆粒，具有良好的光學特性，使ZEN的檢測消除了背景光的干擾，靈明度大大提高，最低可檢 測到 5.36ng/mL。
[0181] (2)穩定性高。NaGd(W化)2:Eu3+納米顆粒屬于完全惰性的無機發光材料，運些性質 使得其具有非常好的光穩定性，在紫外燈的照射下不發生光漂白，使得讀值穩定。
[0182] (3)簡便、快速。使用本實施例試紙可與巧光讀條儀結合使用，直接讀值，實現現場 定量檢測，只需將試紙條插入被檢樣品中3-5秒鐘，取出后4分鐘內即可判定檢測結果。
[0183] (4)結果顯示形象、直觀、準確。本實施例巧光納米顆粒標記免疫層析試紙是WT線 是否出現吸收峰作為檢測陽性和陰性的標準。若T線處無吸收峰則表示被檢樣品中含有 ZEN，反之則表示被檢樣品中不含ZEN。結果直觀、準確，不易出現假陽性和假陰性等人為誤 判。
【主權項】
1. 一種檢測玉米赤霉烯酮的熒光免疫層析試紙，包括支撐體和固定在支撐體上的吸附 層，吸附層從測試端開始依次為吸附纖維層(2)、熒光抗體纖維層(3)、纖維素膜層(4)及吸 水材料層(7)，其特征在于，所述的纖維素膜層上設有用偶聯ZEN的載體蛋白溶液印制的隱 形檢測印跡(5)和用羊抗小鼠 IgG、兔抗小鼠 IgG或羊抗兔IgG抗體溶液印制的隱形對照印跡 (6);所述的熒光抗體纖維層采用吸附熒光抗體的玻璃纖維棉制成，熒光抗體為氧化石墨烯 熒光納米材料、NaYF4:Yb，Tm納米顆粒或NaGd(W〇4)2:Eu3+納米顆粒標記的ZEN單克隆抗體或 者多克隆抗體。2. 根據權利要求1所述的檢測玉米赤霉烯酮的熒光免疫層析試紙，其特征在于，所述的 支撐體包括設置在吸附層底面的底層(15)和設置在吸附層頂面的面層(14)。3. 根據權利要求1所述的檢測玉米赤霉烯酮的熒光免疫層析試紙，其特征在于，所述的 支撐體包括透明的中空管體(1)，吸附層填充在中空管體內部，吸附層從測試端開始依次為 吸附纖維層、熒光抗體纖維層、纖維素膜層及吸水材料層。4. 根據權利要求3所述的檢測玉米赤霉烯酮的熒光免疫層析試紙，其特征在于，所述的 中空管體(1)的上端裝有連接頭(8)，連接頭(8)上端設置有輔助吸附裝置，所述的輔助吸附 裝置包括與所述連接頭呈密封連接的連接套（13)和設置在所述連接套上部的氣囊（12)，氣 囊（12)的出氣口依次經連接套（13)上部的進氣通道（132)、連接頭(8)的內腔(9)與中空管 體（1)的上口部相連通，進氣通道所在的連接套側壁上設置有只能向外排氣無法向內吸氣 的單向出氣裝置(11); 所述的單向出氣裝置包括設置在進氣通道所在的連接套側壁的換氣腔（111)，換氣腔 (111)內設置有圓球形的密封球（113)，換氣腔（111)的底面上開有與密封球相對應的第一 出氣口（114)，第一出氣口經出氣通道（115)與進氣通道（132)相連通，換氣腔（111)側面設 置有與外界大氣相連通的第二出氣口（112)，構成只能向外排氣、無法向進氣通道吸氣的單 向出氣結構。5. 根據權利要求4所述的檢測玉米赤霉烯酮的熒光免疫層析試紙，其特征在于，所述的 第一出氣口（114)為圓形，其直徑小于密封球的直徑。6. 根據權利要求4所述的檢測玉米赤霉烯酮的熒光免疫層析試紙，其特征在于，所述的 連接頭(8)為上下開口的中空結構，其下端與中空管體（1)的上端呈密封連接，連接頭上部 的外壁上設置有外螺紋，連接套（13)的下部設置有與連接頭相對應的盲孔（131)，盲孔 (131)內壁上設置有與外螺紋相對應的內螺紋，連接頭通過外螺紋和內螺紋旋裝在連接套 下部的盲孔（131)內，連接頭的頂部與盲孔頂部之間在連接套上設置有防止漏氣的密封圈 (10) 〇7. 根據權利要求1所述的檢測玉米赤霉烯酮的熒光免疫層析試紙，其特征在于，所述的 隱形檢測印跡(5)和隱形對照印跡(6)呈相間設置在纖維素膜層(4)的表面，間距為6-10mm; 所述的中空管體(1)的內腔為長方形。8. 根據權利要求1所述的檢測玉米赤霉烯酮的熒光免疫層析試紙，其特征在于，所述的 氧化石墨烯熒光納米材料標記的ZEN單克隆抗體或者多克隆抗體的制備方法，包括以下步 驟： (1)氧化石墨烯熒光材料修飾： 取20mg氧化石墨磨碎，加入到5mL DMF中，超聲混勻后，加入20mL二氯亞砜，80°C下加熱 回流48h后離心，得到中間體酰氯化氧化石墨烯，用四氫呋喃洗滌兩次后，干燥;再在抽真空 氮氣保護的條件下，將酰氯化氧化石墨烯和lmL正丁胺混合，60°C反應72h，冷卻至室溫，得 到烷基胺修飾的氧化石墨烯，分散于20mL雙蒸水中，8000r/min離心，除去未反應的正丁胺， 將剩余的反應液通過旋轉蒸發儀蒸干，蒸干后的干物質重新分散在雙蒸水中，配制成濃度 為lmg/mL的修飾的氧化石墨稀焚光材料水溶液； (2) 表面標記ZEN抗體銀納米顆粒溶液的制備： (a) 將lOOmg硝酸銀溶解于250mL超純水中，加熱沸騰，加入10mL質量分數1%的檸檬酸 鈉溶液，80 °C加熱回流1 h后攪拌0.5h，4°C條件下過夜;取lmL過夜后的溶液，加入ImM的巰基 乙酸l〇yL，攪拌24h后離心，除去未反應的巰基乙酸，超純水洗滌3次，用旋轉蒸發儀蒸干，加 超純水配制成濃度為lmg/mL疏基乙酸包覆的銀納米顆粒溶液； (b) 取0.1 mM的EDC 10yL和0.1 mM的NHS 10yL，逐步加入到lmL巰基乙酸包覆的銀納米顆 粒溶液中，反應lh，得到羧基活化的銀納米顆粒溶液； (c) 取0.1 mM的ZEN單克隆抗體或多克隆抗體12yL，加入到羧基活化的銀納米顆粒溶液 中，4°C反應過夜，得到表面標記ZEN抗體銀納米顆粒溶液； (3) 氧化石墨稀焚光納米材料ZEN抗體的標記： 取修飾的氧化石墨稀焚光材料水溶液5mL，加入2mL戊二醛，室溫反應3h，離心，除去未 反應的戊二醛，將剩余的反應液分散在0.01mol/L、pH7.4的roS緩沖溶液中，加入表面標記 ZEN抗體銀納米顆粒溶液，4°C反應3h，經離心，收集氧化石墨稀焚光納米材料標記的ZEN單 克隆抗體或者多克隆抗體，〇. 01mol/L、pH7.4的PBS緩沖液洗滌，保存備用。9.根據權利要求1所述的檢測玉米赤霉烯酮的熒光免疫層析試紙，其特征在于，所述的 NaYF4: Yb，Tm納米顆粒標記的ZEN單克隆抗體或者多克隆抗體的制備方法，包括以下步驟： (1) 采用水熱合成法制備NaYF4: Yb，Tm納米顆粒： 分別取濃度均為0.5111〇1/1的￥(觀3)3溶液5.511^、￥13(^)3) 3溶液0.511^和1'111(^)3)3溶液 0.5mL，混合均勻，再加入0.4mol/L的檸檬酸鈉溶液2mL，25 °C條件下避光充分反應lh;加入 1.5mol/L NH4F溶液7mL，25°C條件下避光攪拌0.5h，用HN〇3調節pH值至7.4，靜置0.5h，加雙 蒸水稀釋至30mL;再在220°C下反應24h，冷卻到室溫，經過濾、雙蒸水洗滌、干燥，得到發藍 色光的NaYF4: Yb，Tm熒光納米顆粒； (2) 熒光納米顆粒的表面硅化： 將NaYF4: Yb，Tm熒光納米顆粒加入0.01mol/L、pH7.4的PBS緩沖液中，配制成濃度為lmg/ mL的NaYF4: Yb，Tm熒光納米顆粒溶液，再將5mL濃氨水滴入5mL NaYF4: Yb，Tm熒光納米顆粒溶 液中，充分攪拌反應20min，再加入2.5mL正娃酸四乙酯，4°C避光條件下反應4h; 6000r/min 離心10min，得到表面硅化的熒光納米顆粒，用乙醇洗滌4次，分散在甲醇中，配制成濃度為 1 Omg/mL的焚光納米顆粒甲醇溶液； (3) 熒光納米顆粒的表面氨基化： 取3mL熒光納米顆粒甲醇溶液，加入5mL的丙酮，密封后磁力攪拌20min，再用超聲波均 勻分散，加入3yL的APTSA，密封后在40 °C反應30min，再在70 °C水浴反應lh，6000r/min離心 5min，得到表面氨基化的熒光納米顆粒，用乙醇反復洗滌4次，真空干燥后，4°C密封保存； (4) ZEN抗體的標記： 用0.01mol/L、pH7.4的PBS緩沖溶液將表面氨基化的熒光納米顆粒溶解，配制成濃度為 lOmg/mL的表面氨基化的熒光納米顆粒溶液；取lOmL表面氨基化的熒光納米顆粒溶液與 5 · 6mg NHS和15mg EDC混合，室溫避光反應3h，6000r/min離心5min，取上清液；將lmg/mL的 ZEN單克隆抗體或者多克隆抗體加入上清液中，ZEN單克隆抗體或者多克隆抗體和上清液的 體積比為1:100，4°C避光反應4h，離心，雙蒸水洗滌后分散在PBS緩沖溶液中，4°C條件下透 析3d，離心，收集沉淀，得到NaYF4: Yb，Tm納米顆粒標記的ZEN單克隆抗體或多克隆抗體，置 于PBS緩沖溶液中，4°C保存。10.根據權利要求1所述的檢測玉米赤霉烯酮的熒光免疫層析試紙，其特征在于，所述 的NaGd(W〇4)2:Eu3+納米顆粒標記的ZEN單克隆抗體或者多克隆抗體的制備方法，包括以下 步驟： (1) 采用水熱合成法制備NaGd(W〇4)2 :Eu3+納米顆粒 稱取7g Gd2〇3和7g Eu2〇3,分別加入至50mL的HN〇3中，加熱至80°C，保溫濃縮至全部結 晶，制得Gd(N03)3和Eu(N03)3;將Na 2W〇4 · 2H20溶于去離子水中，配制成濃度為0.2mol/L的 Na2W〇4溶液；將制得的Gd (N〇3) 3和Eu (N〇3) 3用去離子水溶解，分別制備質量分數為80 %的Gd (N〇3) 3溶液和質量分數為15 %的Eu (N〇3)3溶液，吸取配制的5mL Gd (N〇3) 3溶液、1 OmLNa2W〇4溶 液和5mL Eu (N〇3)3溶液，加入到反應爸中，用稀硝酸、氫氧化鈉調節pH=5，攪拌均勾，封閉反 應釜，200°C恒溫加熱24h后，自然降至室溫;將反應釜中溶液倒出靜置，待溶液中粉體沉淀 后，去除上清液，用蒸餾水洗滌粉體3次，每次靜置3h;將洗好的粉體加熱至80°C干燥12h，得 到 NaGd(W〇4)2 :Eu3+納米顆粒； (2) ZEN抗體的標記 將ZEN單克隆抗體或多克隆抗體溶液10000r/min離心30min，除去雜質；用去離子水溶 解NaGd(W〇4)2:Eu3+納米顆粒，配制成濃度為0. lmg/mL的NaGd(W〇4)2:Eu3+納米顆粒溶液，然后 用O.lmol/L K2C03溶液調節NaGd(W〇4)2:Eu3+納米顆粒溶液至pH 8.2; 取10mL NaGd(W〇4)2:Eu3+納米顆粒溶液，在攪拌狀態下，加入ZEN單克隆抗體或多克隆抗 體溶液1 〇〇μ 1，ZEN單克隆抗體或多克隆抗體溶液濃度lmg/mL，混勻，室溫溫育30miη，4 °C、 10000r/min離心30min，棄上清，將沉淀用0.02mol/L Na2B4〇7溶液稀釋至 10mL，10000r/min 離心30min，沉淀用0.02mo 1/L Na2B4〇7溶液稀釋至lmL，4°C保存備用。
【文檔編號】G01N33/558GK106066400SQ201610424509
【公開日】2016年11月2日
【申請日】2016年6月14日 公開號201610424509.8, CN 106066400 A, CN 106066400A, CN 201610424509, CN-A-106066400, CN106066400 A, CN106066400A, CN201610424509, CN201610424509.8
【發明人】職愛民, 賈國超, 李鎂娟, 張培蕾, 周志友, 趙強, 王自良, 宋蓮軍, 邱國慶
【申請人】焦作百奧泰科生物科技有限公司