一種高靈敏鏈霉素電化學適配體傳感器的制備方法及應用
【專利摘要】本發明涉及一種用于鏈霉素檢測的電化學適配體傳感器的制備，將多孔碳納米球(PCNS)、聚苯胺?氧化銅?金籠子(PANI?CuO?GM)復合物逐層修飾電極表面常溫下靜置至干燥，然后將鏈霉素適配體固定到經上述納米材料修飾的電極表面，用牛血清蛋白作為封閉劑阻塞非特異性結合位點。將制備好的鏈霉素適配體傳感器進行電化學測試,鏈霉素的濃度可通過適配體與鏈霉素結合前后導致適配體傳感器電流變化量進行測量。本發明的鏈霉素適配體傳感器制備及檢測方法，很好地解決了當前傳感器制備的繁瑣程序，而且采用碳材料作為信號放大材料極大的降低了傳感器制造成本，且同批次電極具有很好的同一性，可以批量生產，實現商品化。
【專利說明】
一種高靈敏鏈霉素電化學適配體傳感器的制備方法及應用
技術領域
[0001]本發明涉及鏈霉素痕量分析檢測領域，更具體的說是一種基于碳材料電化學適配體傳感器的制備與應用。
【背景技術】
[0002]鏈霉素是一種由灰色鏈霉菌生產得到的氨基糖苷類抗生素，是繼青霉素后第2個生產并用于臨床的抗生素。由于鏈霉素具有性質穩定、抗菌譜廣、生產工藝簡單、療效好、尤其對結
對革蘭氏陰性菌有獨特的抑制作用，因此，得到了廣泛的應用，如在人類疾病治療中作為一種抗菌藥，在動物飼養中作為一種獸藥，在農作物維護中作為一種農藥以及在養蜂業中作為一種治療蜜蜂細菌性疾病的抗菌藥等。
[0003]但是，使用鏈霉素也會引起一些嚴重的副作用，主要包括過敏反應，聽覺神經喪失以及腎毒性反應等。當鏈霉素使用過量時，它會殘留在肉、雞蛋以及奶制品等食物產品中，從而對人類的身體健康造成極大的傷害。控制鏈霉素殘留對人體的危害，最為有效的方法之一是加強對食品中鏈霉素殘留檢測的力度。因此，建立有效的、精確的以及經濟實用的檢測鏈霉素殘留的方法對于食品安全的控制有著重要的作用。
[0004]目前，鏈霉素常用檢測方法主要為高效液相色譜法(HPLG)、色譜-質譜串聯(LG-MS)和免疫檢測法。在上述儀器檢測法中，HPLC法檢測鏈霉素殘留的準確性以及靈敏性較好。但由于鏈霉素缺少發色團，因此常常要用到柱后衍生法以及熒光檢測法等對鏈霉素含量進行檢測。LC-MS法能夠很好地對鏈霉素及其他氨基糖苷類抗生素做出精密檢測但檢測前要對樣品進行較為復雜的前處理，而且花費較大，這就大大限制了該種檢測方法的大規模實際應用。免疫檢測法是建立在抗原-抗體特異性結合的基礎上，非常適合高特異性、高靈敏度地檢測低濃度目標物質，由于一些實際樣品如蜂蜜中存在的復雜化合物會發生交叉反應，會影響免疫層析的反應結果，這就限制了該方法在實際樣品中的應用范圍。因此迫切需要開發一種特異性強、靈敏度高、速度快、成本低、檢測范圍廣的電化學分析檢測方法來適應形勢的發展。
【發明內容】
[0005]鑒于現有技術中存在的上述問題，本發明所要解決的技術問題是提供了一種操作簡單、檢測速度快、成本低廉、高選擇性的檢測鏈霉素殘留的方法。
[0006]為了解決上述技術問題，本發明是通過構建一種新型的電化學適配體傳感器來實現高靈敏檢測鏈霉素殘留，該高靈敏電化學適配體傳感器的制備方法為:
(I)用氧化鋁泥漿對玻碳電極進行拋光。
[0007](2)分別用乙醇與去離子水清洗拋光后的玻碳電極。
[0008](3)將5 yL的多孔碳納米球懸浮液滴在玻碳電極表面，在空氣中自然風干。
[0009](4)將5 yL的聚苯胺-氧化銅-金籠子復合物滴加在多孔碳納米球修飾的電極上。
[0010](5)用pH=7.4的緩沖溶液沖洗修飾后的電極。
[0011](6)將5yL的鏈霉素適配體滴加在沖洗后的電極上。
[0012](7)用牛血清蛋白進行封端，阻塞其非特異性結合位點。
[0013](8)將制備好的電極浸泡在含有鏈霉素的溶液中。
[0014](9)連接好電化學工作站。
[0015](10)將制備好的鏈霉素適配體傳感器進行電化學測試，鏈霉素的濃度可通過適配體與鏈霉素結合前后導致適配體傳感器電流變化量進行測量。
[0016]本發明所述制備合成多孔碳納米球PCNS，包括以下步驟:首先以纖維素為碳源，以FeSO4-(NH4)2SO4.6H20為催化劑，利用水熱合成法制備碳納米球。然后利用MgCl2溶液進行活化最后得到多孔碳納米球。
[0017]本發明所述制備合成聚苯胺-氧化銅-金籠子(PAN1-CuO-GM)，包括以下步驟:首先合成聚苯胺-氧化銅，然后再反應生成聚苯胺-氧化銅-金籠子。
[0018]本發明所用到的鏈霉素是在NaH2PO4與Na2HPO4緩沖溶液(pH=7.4)中配制的。
[0019]本發明所制備的電化學傳感器在實際檢測中以鉑絲為對電極，以銀I氯化銀電極為參比電極，并與工作電極組成回路以通過電流，同時降低傳統二電極體系中溶液電阻對工作電極的影響。
[0020]本發明所制備的電化學傳感器在實際檢測中，以K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] (1:1)與0.2 mol/L的KCl溶液為電解液進行檢測。
[0021]本發明所制備的導電材料都是在殼聚糖溶液中溶解的。
[0022]本發明的有益效果:
(I)利用多孔碳納米球作為信號放大材料極大的降低了傳感器的制造成本。
[0023](2 )本發明采用水熱法制備多孔碳納米球，與傳統的模板法相比具有無毒，操作簡單的優點。
[0024](3)利用金籠子固定適配體，增加了適配體的固定量與穩定性。
[0025](4)目標分析物與傳感器能特異性識別與結合，極大的提高了傳感器的靈敏度與特異性。
[0026](5)相比于金屬電極，玻碳電極不僅具有電位窗寬，背景電流低等優點，而且具有較好的化學惰性和對各種傳感和檢測的普適性。
[0027]說明書附圖
下面結合附圖和具體實施方案對本發明作進一步詳細描述:
圖1不同濃度(0.01-200ng/mL)鏈霉素的DPV電流信號；
圖2適配體對鏈霉素的線性檢測的標準曲線。
【具體實施方式】
[0028]實施例1
(I)多孔碳納米球PCNS的制備，首先合成碳納米球，將8.0g纖維素與2.4g FeSO4-(NH4)2SO4.6H20溶于60mL去離子水中，然后將該溶液放入高壓反應釜中，180。(:的條件下反應24h，離心洗滌，60。(:的條件下真空干燥備用；將干燥后的樣品溶于40mL MgCl2(0.25M)溶液中，在120。(:的條件下反應12h，洗滌干燥，將干燥好的樣品在通氮氣的條件下，800。(:活化2h，將活化后的樣品用鹽酸(0.2M)和去離子水洗滌，干燥研磨得到多孔碳納米球。
[0029](2)聚苯胺-氧化銅-金籠子(PAN1-CuO-GM)的制備:將0.2g CuSO4.5H20與0.Ig十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)溶解在80mL去離子水中，然后加入0.12g過硫酸銨，磁力攪拌，待混合均勻后向其加入2.5mL的C6H5NH2，在室溫的條件下反應4h，然后向該混合液中滴加20mL的Na0H(0.2M)的溶液，室溫條件下反應6h，分離出棕色沉淀，并用無水乙醇與去離子水洗滌，然后真空80。C條件下干燥備用；配制18mL的CuSO(0.038M)溶液，然后向其加入2mL檸檬酸三鈉(0.5M)與碳酸鈉(1.0M)混合溶液，磁力攪拌半小時后向該溶液中加入4.0g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，繼續攪拌直至溶解，然后將共混液在90。(:的條件下反應4h，離心洗滌備用；將上述得到的粉末溶解到25mL質量分數為0.2%的PVP溶液中，然后向該溶液中加入2.4mL的HAuCl4( 1mM)溶液，磁力攪拌6h，洗滌離心干燥備用；將20mg上述制得的黑色固體與40mg聚苯胺-氧化銅溶解在40mL PVP(0.04%)與氨水(1%)的混合液中，室溫條件下反應24h，離心洗滌并在真空條件下干燥。
[0030](3)殼聚糖溶液的配制:將ImL的冰乙酸加入到99mL的去離子水中，然后將0.5g殼聚糖加入到冰乙酸與去離子水的溶液中，超聲lOmin，得到質量分數為0.5%的殼聚糖溶液。
[0031](4)傳感器的制備:將5 yL的PCNS懸浮液滴在玻碳電極表面，在空氣中自然風干，然后，將5 yL的PAN1-CuO-GM復合物滴加在PCNS修飾的電極上，用pH=7.4的緩沖溶液沖洗修飾后的電極，將5yL的鏈霉素適配體滴加在沖洗后的電極上，并用牛血清蛋白進行封端，阻塞其非特異性結合位點，將制備好的電極孵化在含有鏈霉素的溶液中，120 min后，利用二次水沖洗未吸附的鏈霉素等待檢測。
[0032](5)實施檢測:先將鉑絲電極用酒精燈內焰燒lmin，去除表面的氧化物與其它雜質，然后用去離子水沖洗銀I氯化銀電極，連接好工作電極、對電極、參比電極，以K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] (1:1)與0.2 mol/L的KCl溶液為電解液進行檢測，如圖1所示，測得不同濃度鏈霉素的DPV信號，通過適配體與鏈霉素結合前后導致適配體傳感器DPV電流變化量進行線性擬合，得到鏈霉素線性檢測范圍與最低檢測線，如圖2所示，本發明對鏈霉素測定的線性范圍為0.01-200ng/mL，最低檢測線為0.38pg/mL,可以用于實際樣品的測定。
[0033](6)本發明的適配體傳感器，成本低，操作簡單，靈敏度高，穩定性好，重現性好等優點，符合我國抗生素殘留快速檢測技術發展與國際化要求。
【主權項】
1.一種高靈敏鏈霉素電化學適配體傳感器的制備方法及應用，其特征是包括以下步驟: (I)用氧化鋁泥漿對玻碳電極進行拋光； (2)分別用乙醇與去離子水清洗拋光后的玻碳電極； (3)將5yL的多孔碳納米球懸浮液滴在玻碳電極表面，在空氣中自然風干； (4)將5此的聚苯胺-氧化銅-金籠子復合物滴加在多孔碳納米球修飾的電極上； (5)用pH=7.4的緩沖溶液沖洗修飾后的電極； (6)將5yL的鏈霉素適配體滴加在沖洗后的電極上； (7)用牛血清蛋白進行封端，阻塞其非特異性結合位點； (8)將制備好的電極浸泡在含有鏈霉素的溶液中； (9)連接好電化學工作站； (10)將制備好的鏈霉素適配體傳感器進行電化學測試，測得不同濃度鏈霉素的DPV信號，通過適配體與鏈霉素結合前后導致適配體傳感器DPV電流變化量進行線性擬合，得到鏈霉素線性檢測范圍與最低檢測線。2.根據權利要求1所述一種高靈敏鏈霉素電化學適配體傳感器的制備方法及應用，制備合成多孔碳納米球PCNS，其特征是:首先合成碳納米球，將8.0g纖維素與2.4g FeSO4-(NH4)2SO4.6H20溶于60 mL去離子水中，然后將該溶液放入高壓反應釜中，180。(:的條件下反應24h，離心洗滌，60。(:的條件下真空干燥備用；將干燥后的樣品溶于40mL MgCl2(0.25M)溶液中，在120。(:的條件下反應12 h，洗滌干燥，將干燥好的樣品在通氮氣的條件下，800。(:活化2h，將活化后的樣品用鹽酸(0.2M)和去離子水洗滌，干燥研磨得到多孔碳納米球。3.根據權利要求1所述一種高靈敏鏈霉素電化學適配體傳感器的制備方法及應用，制備合成聚苯胺-氧化銅-金籠子(PAN1-CuO-GM)，其特征是:將0.2g CuSO4.5出0與0.18十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)溶解在80mL去離子水中，然后加入0.12g過硫酸銨，磁力攪拌，待混合均勻后向其加入2.5mL的C6H5NH2，在室溫的條件下反應4h，然后向該混合液中滴加20mL的Na0H(0.2M)的溶液，室溫條件下反應6h，分離出棕色沉淀，并用無水乙醇與去離子水洗滌，然后真空80。(:條件下干燥備用；配制18mL的CuS0(0.038M)溶液，然后向其加入2mL檸檬酸三鈉(0.5M)與碳酸鈉(1.0M)混合溶液，磁力攪拌半小時后向該溶液中加入4.0g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，繼續攪拌直至溶解，然后將共混液在90。(:的條件下反應4h，離心洗滌備用;將上述得到的粉末溶解到25mL質量分數為0.2%的PVP溶液中，然后向該溶液中加入2.4mL的HAuCl4( 1mM)溶液，磁力攪拌6h，洗滌離心干燥備用；將20mg上述制得的黑色固體與40mg聚苯胺-氧化銅溶解在40mL PVP(0.04%)與氨水(1%)的混合液中，室溫條件下反應24h，離心洗滌并在真空條件下干燥。
【文檔編號】G01N27/48GK106066358SQ201610369023
【公開日】2016年11月2日
【申請日】2016年5月30日 公開號201610369023.9, CN 106066358 A, CN 106066358A, CN 201610369023, CN-A-106066358, CN106066358 A, CN106066358A, CN201610369023, CN201610369023.9
【發明人】陰軍玲, 郭文娟, 裴梅山
【申請人】濟南大學