尿樣品分析方法、尿樣品分析用試劑及尿樣品分析用試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明涉及用于檢測作為尿中有形成分的至少管型及紅細胞的尿樣品分析方法、尿樣品分析用試劑及尿樣品分析用試劑盒。
【專利說明】尿樣品分析方法、尿樣品分析用試劑及尿樣品分析用試劑盒 【技術領域】
[0001] 本發明涉及用于檢測作為尿中有形成分的至少管型及紅細胞的尿樣品分析方法、 尿樣品分析用試劑及尿樣品分析用試劑盒。 【【背景技術】】
[0002] 在腎一泌尿系統中的感染癥、炎癥性病變、變性病變、結石癥、腫瘤等疾病中，根據 各自的疾病，尿中出現各種有形成分。作為有形成分，可舉出紅細胞、管型、白細胞、上皮細 胞、酵母樣真菌、精子等。分析尿中的這些的成分對于腎一泌尿系統的疾病或異常部位的推 定重要。例如，紅細胞是對于判斷從腎臟的腎小球至尿道的途徑中有無出血有用的尿中有 形成分。
[0003] 管型是以Tamm-Horsfal 1粘蛋白質和尿中血楽；蛋白質（主要是白蛋白）的凝固沉淀 物作為基質的固體成分，主要由遠曲小管及集合管形成。此僅由基質組成的管型被稱為透 明管型，但隨腎臟或腎小管的狀態而在透明管型中封入細胞等各種成分，發生進一步變性 的管型。因此，管型是對于掌握腎臟及腎小管的病態或障礙的程度有用的尿中有形成分。
[0004] 在管型及紅細胞等尿中有形成分的分析中，廣泛進行通過將對尿進行離心分離而 得到的沉淀物(有形成分）用顯微鏡觀察的目測檢查。另外，在近年也開發出使用流式細胞 儀的自動分析法。例如，在專利文獻1~4中記載了，為了稀釋用試劑及尿中有形成分的染 色，通過將用含花青苷系染料的3，3 ' -二己基-2，2 ' -碘化氧雜碳花青苷(Di0C6(3))的染色 用試劑處理的尿樣品用流式細胞儀測定，分析尿中有形成分的方法。
[0005] 另一方面，在尿中也存在作為形狀與管型極其類似的成分的粘液絲或細菌或鹽類 等凝集體。由于尿樣品中的管型的數是臨床上重要的信息，所以在管型的檢測時，辨別管型 和粘液絲等與管型類似的成分變得重要。
[0006] 【現有技術文獻】
[0007] 【專利文獻】
[0008] 專利文獻1:特開平11-23446號公報 [0009] 專利文獻2:特開平9-329596號公報 [0010] 專利文獻3:特開平8-240520號公報 [0011] 專利文獻4:特開平8-170960號公報 【
【發明內容】
】
[0012] 【發明要解決的技術課題】
[0013] 本發明旨在提供，與以往技術比，可不使紅細胞溶血地高精度檢測紅細胞，可再將 管型與粘液絲等混雜物區別而高精度檢測的尿樣品分析方法。另外，本發明旨在提供適宜 在該方法中使用的尿樣品分析用試劑及尿樣品分析用試劑盒。
[0014] 【解決課題的技術方案】
[0015] 本發明人經銳意探討的結果發現，通過作為用于對尿中有形成分進行染色的染 料，使用特定的花青苷系熒光染料，可不實質上損傷紅細胞地檢測紅細胞，并且區別檢測管 型和粘液絲，從而完成本發明。
[0016] 從而，本發明提供尿樣品分析方法，其包括:將尿樣品和含選自3,3'_碘化二乙基 氧雜碳花青苷(Di0C2(3))、3,3-碘化二丙基氧雜碳花青苷(01003(3))、3,3'-碘化二丁基氧 雜花青苷(Di0C4(3))及3,3_碘化二戊基氧雜碳花青苷(Di0C5(3))的至少1種熒光染料的第 1試劑混合而調制測定樣品的工序，及檢測在調制工序中得到的測定樣品中所含的作為尿 中有形成分的至少管型及紅細胞的工序。
[0017] 另外，本發明提供用于檢測作為尿中有形成分的至少管型及紅細胞的尿樣品分析 用試劑，其含選自〇丨002(3)、0丨(^3(3)、0丨(^4(3)及0丨(^5(3)的至少1種熒光染料。
[0018] 再者，本發明提供用于檢測作為尿中有形成分的至少管型及紅細胞的尿樣品分析 用試劑盒，其含:含選自〇1002(3)、01003(3)、01(^4(3)及01(^5(3)的至少1種熒光染料的第 1試劑、及含作為分散劑的表面活性劑的第2試劑。
[0019] 【發明效果】
[0020] 由本發明能不使紅細胞實質上損傷地檢測紅細胞，并且能高精度檢測管型及紅細 胞。 【【附圖說明】】
[0021] 【圖1】是顯示尿樣品分析用試劑之一例的圖。
[0022] 【圖2】是顯示尿樣品分析用試劑盒之一例的圖。
[0023] 【實施方式】
[0024][尿樣品分析方法]
[0025] 本實施方式的尿樣品分析方法（以下，也簡稱為"方法"）在尿中有形成分之中以紅 細胞、管型、結晶成分及粘液絲作為分析對象，特別是，對于管型及紅細胞的分析適宜。
[0026] 在管型中有各種各樣的種類，已知上述的僅由基質組成的透明管型、封入有腎小 管上皮細胞的上皮管型、封入有紅細胞的紅細胞管型、封入有白細胞的白細胞管型、封入有 脂肪顆粒的脂肪管型、封入有顆粒成分(主要是變性的上皮細胞）的顆粒管型、管型的全體 或一部分均質且如蠟一樣變性的蠟樣管型。在本實施方式中，管型的種類無特別限定。 [0027]在本實施方式中，紅細胞的種類無特別限定，也可為正常紅細胞及異常紅細胞之 任何。
[0028]在本實施方式的方法中，首先進行將尿樣品和含選自3，3'_碘化二乙基氧雜碳花 青苷(Di0C2(3))、3，3-碘化二丙基氧雜碳花青苷(Di0C3 (3))、3，3 ' -碘化二丁基氧雜花青苷 (Di0C4(3))及3,3_碘化二戊基氧雜碳花青苷(Di0C5(3))的至少1種熒光染料的第1試劑混 合而調制測定樣品的工序。
[0029]在本實施方式中，尿樣品只要是含尿中有形成分的液體樣品，就無特別限定，但優 選是自受試者采集的尿。再有，以自受試者采集的尿作為樣品使用時，有隨時間經過而尿中 有形成分劣化的擔憂，所以優選為在采集后24小時以內、特別3~12小時以內將尿樣品在本 實施方式的方法中使用。
[0030]在本實施方式的方法中使用的第1試劑是用于對含至少管型及紅細胞的尿中有形 成分進行染色的試劑。可在第1試劑中使用的熒光染料的Di0C2(3)、Di0C3(3)、Di0C4(3)及 DiOC5( 3)也各自被稱為NK-85、NK-2605、NK-5587及NK-2453，均可從株式會社林原生物化學 研究所得到。在以往的分析方法中，為了尿中有形成分的染色，使用含花青苷系染料的3， 3'-二己基_2,2'_碘化氧雜碳花青苷(DiOC6(3))的染色用試劑。本發明人發現，相比用含此 DiOC6(3)的染色用試劑處理尿樣品，用含選自DiOC2(3)、DiOC3(3)、DiOC4(3)&DiOC5(3W9 至少1種熒光染料的染色用試劑處理尿樣品更能保持樣品中的紅細胞的形態，可正確地檢 測紅細胞。另外，在本實施方式的方法中，紅細胞的膜成分及管型被這些染料良好地染色， 但粘液絲幾乎未被染色。以下顯示這些染料的結構式。
[0031] 【化1】
[0032]
[0033] 1 第1試劑中的熒光染料可為1種，也可為2種以上。第1試劑中的熒光染料的濃度優 選設定為，在調制的測定樣品中，以可至少對管型及紅細胞適宜地進行染色的終濃度含該 熒光染料。測定樣品中的終濃度根據上述的熒光染料的種類適宜設定。例如，當作為熒光染 料使用Di0C3(3)時，測定樣品中的終濃度是0.1yg/mL以上200yg/mL以下，優選是lyg/mL以 上20yg/mL以下。
[0035] 第1試劑可通過使上述的熒光染料溶解于適宜的溶劑而得到。溶劑只要是可使上 述的熒光染料溶解的水性溶劑，就無特別限定，例如，可舉出水、水溶性有機溶劑、及這些的 混合物。在這些中，特別優選為水溶性有機溶劑。作為水溶性有機溶劑，例如，可舉出碳原子 數1~3的低級醇、乙二醇、二甲基亞砜(DMSO)等。
[0036] 在本實施方式中，根據需要，也可在調制工序中進一步混合用于稀釋尿樣品的稀 釋用試劑。作為那樣的稀釋用試劑，優選為水或緩沖液。緩沖液只要是在PH是5以上9以下、 優選為6.5以上8.6以下、更優選為7.0以上7.8以下的范圍有緩沖作用的緩沖劑的水溶液， 就無特別限定。作為那樣的緩沖劑，例如，可舉出Tris、MES、Bis-Tris、ADA、PIPES、ACES、 M0PS、M0PS0、BES、TES、HEPES、DIPS0、TAPS0、P0PS0、HEPPS0、EPPS、Tricine、Bicine、TAPS# Good緩沖劑等。
[0037] 在本實施方式中，在調制工序中，優選進一步混合含作為分散劑的表面活性劑的 第2試劑。通過進一步混合這樣的第2試劑，可使抑制管型的正確的檢測的細菌或鹽類等混 雜物的凝集體分散、除去。
[0038] 第2試劑可通過使表面活性劑溶解于適宜的溶劑而得到。溶劑只要是可使表面活 性劑溶解，就無特別限定，例如，可舉出水、水溶性有機溶劑、及這些的混合物。作為水溶性 有機溶劑，例如，可舉出碳原子數1~3的低級醇、乙二醇、DMSO等。在本實施方式中，特別優 選為水。再有，第2試劑也可通過使表面活性劑溶解于上述的稀釋用試劑而調制。
[0039] 在第2試劑中使用的表面活性劑的種類無特別限定，可自陽離子性表面活性劑、非 離子性表面活性劑、陰離子性表面活性劑及兩性表面活性劑適宜選擇。第2試劑中所含的表 面活性劑可為1種，也可為2種以上。含2種以上的表面活性劑時，其組合可任意地選擇。
[0040] 在本實施方式中，作為陽離子性表面活性劑，可使用選自季銨鹽型表面活性劑及 吡啶鑰鹽型表面活性劑的至少1種。作為季銨鹽型表面活性劑，例如，可舉出以下的式(I)所 表示的總碳原子數9~30的表面活性劑。
[0041 ]【化2】
[0042]
[0043]上述的式（I)中，R1是碳原子數6~18的烷基或烯基;1?2及辦互相相同或不同，是碳 原子數1~4的烷基或烯基;R4是碳原子數1~4的烷基或烯基、或者芐基;X-是鹵素離子。
[0044] 上述的式(I)中，作為R1，優選為碳原子數6、8、10、12及14的烷基或烯基，特別優選 為直鏈的烷基。作為更具體的辦，可舉出辛基、癸基及十二烷基。作為此及辦，優選為甲基、乙 基及丙基。作為R4,優選為甲基、乙基及丙基。
[0045] 作為吡啶鑰鹽型表面活性劑，例如，可舉出以下的式(II)所表示的表面活性劑。
[0046] m
[0047]
[0048] 在上述的式（II)中，R1是碳原子數6~18的烷基或烯基;X^是鹵素離子。
[0049] 在上述的式（II)中，作為R1，優選為碳原子數6、8、10、12及14的烷基或烯基，特別 優選為直鏈的烷基。作為更具體的心，可舉出辛基、癸基及十二烷基。
[0050] 作為上述的陽離子性表面活性劑的具體例，可舉出十二烷基三甲基溴化銨、癸基 三甲基溴化銨、十二烷基三甲基氯化銨、辛基三甲基溴化銨、辛基三甲基氯化銨、肉豆蔻基 三甲基溴化銨、肉豆蔻基三甲基氯化銨、十二烷基吡啶鑰氯化物等。在這些中特別優選為十 二烷基三甲基溴化銨(DTAB)。
[0051] 在本實施方式中，作為非離子性表面活性劑，可適宜地使用以下的式(III)所表示 的聚氧乙烯系非離子表面活性劑。
[0052] Ri-R2-(CH2CH2O) n-H(III)
[0053]在上述的式（III)中，R1是碳原子數8~25的烷基、烯基或炔基;1?2是-〇-、-〇)〇-或
[0054] 【化4】
[0055]
[0056]作為上述的非離子性表面活性劑的具體例，可舉出聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯甾 醇、聚氧乙烯蓖麻子油、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯烷基胺、聚氧乙烯聚氧丙烯 烷基釀等。
[0057] 在本實施方式中，作為陰離子性表面活性劑，可使用選自羧酸鹽型表面活性劑、磺 酸鹽型表面活性劑及硫酸酯鹽型表面活性劑的至少1種。作為羧酸鹽型表面活性劑，例如， 可舉出以下的式(IV)所表示的表面活性劑。
[0058] Ri-COOT+ (IV)
[0059] 在上述的式(IV)中，R1是碳原子數8~25的烷基、烯基或炔基;Y+是堿金屬離子。
[0060] 在上述的式（IV)中，作為心優選為碳原子數12~18的直鏈的烷基。上述的羧酸鹽 型表面活性劑在現有技術中作為肥皂被知，例如，可舉出月桂酸鈉、硬脂酸鈉、油酸鈉等。
[0061] 作為磺酸鹽型表面活性劑，例如，可舉出以下的式(V)所表示的表面活性劑。
[0062]
[0063]
[0064] 仕上還的甲，m及η是U以上的塋數，m和η乙和是8~2b;Y是堿金屬離子。
[0065] 在上述的式(V)中，m和η之和優選是9~18。上述的式(V)所表示的磺酸鹽型表面活 性劑在現有技術中作為烷基苯磺酸鹽被知，例如，可舉出直鏈癸基苯硫酸鈉、直鏈十一烷基 苯硫酸鈉、直鏈十二烷基苯硫酸鈉、直鏈十三烷基苯硫酸鈉及直鏈十四烷基苯硫酸鈉等。
[0066] 另外，作為磺酸鹽型表面活性劑，也可使用以下的式(VI)及(VII)的各自所表示的 表面活性劑的混合物。
[0067] CH3 (CH2) j -CH=CH- (CH2) k-S03T+ (VI)
[0068] 在上述的式(VI)中，j及k是0以上的整數，j和k之和是10~25的整數;Y+是堿金屬 離子。
[0069] CH3 (CH2 )m-CH( -OH) -(CH2 )n-S03T+ (VII)
[0070] 在上述的式(VII)中，m及η是0以上的整數，m和η之和是10~25的整數;Y+是堿金屬 離子。
[0071] 在上述的式(VI)中，j和k之和是11~15的整數，在上述的式(VII)中，m和η之和優 選是12~16的整數。上述的式(VI)及(VII)各自表示的表面活性劑在現有技術中作為α-烯 烴磺酸鹽被知，例如，可舉出1-十四烯磺酸鈉、十六烯磺酸鈉、3-羥基十六烷基-1-磺酸鈉、 十八烯-1-磺酸鈉及3-羥基-1-十八烷磺酸鈉等。
[0072] 作為硫酸酯鹽型表面活性劑，例如，可舉出以下的式(VIII)所表示的表面活性劑。
[0073] Ri-O-SO3T+ (VIII)
[0074] 在上述的式(VIII)中，R1是碳原子數10~25的烷基、烯基或炔基;Y+是堿金屬離子。
[0075] 在上述的式(VIII)中，作為R1，優選為碳原子數10~18的直鏈的烷基，特別優選為 碳原子數12的直鏈的烷基。上述的式(VIII)所表示的硫酸酯鹽型表面活性劑在現有技術中 作為高級醇硫酸酯鹽被知，例如，可舉出癸基硫酸鈉、十一烷基硫酸鈉、十二烷基硫酸鈉、十 二烷基硫酸納及十四烷基硫酸納等。
[0076] 另外，作為硫酸酯鹽型表面活性劑，也可使用以下的式(IX)所表示的表面活性劑。
[0077] Ri-O-(CH2CH2O)n-SO3T + (IX)
[0078]在上述的式（IX)中，R1是碳原子數10~25的烷基、烯基或炔基;η是1~8的整數;Y+ 是堿金屬離子或銨離子。
[0079] 在上述的式（IX)中，作為R1，優選為碳原子數12~18的直鏈的烷基，特別優選為碳 原子數12的直鏈的烷基。上述的式(IX)所表示的硫酸酯鹽型表面活性劑在現有技術中作為 聚氧乙烯烷基硫酸酯鹽被知，例如，可舉出十二烷基醚硫酸酯鈉等。
[0080] 另外，作為硫酸酯鹽型表面活性劑，也可使用以下的式(X)所表示的表面活性劑。
[0081] Ri-CH (-SO3I-COOCH3Y+ (X)
[0082] 在上述的式(X)中，R1是碳原子數8~25的烷基、烯基或炔基;Y+是堿金屬離子。 [0083]在上述的式(X)中，作為R 1，優選為碳原子數10~18的直鏈的烷基，特別優選為碳 原子數12的直鏈的烷基。上述的式(X)所表示的硫酸酯鹽型表面活性劑在現有技術中作為 磺基脂肪酸酯被知，例如，可舉出2-磺基十四烷酸-1-甲基酯鈉鹽及2-磺基十六烷酸-1-甲基酯納鹽等。
[0084] 在本實施方式中，作為兩性表面活性劑，可使用選自氨基酸型兩性表面活性劑及 甜菜堿型兩性表面活性劑的至少1種。作為氨基酸型兩性表面活性劑，例如可舉出以下的式 (XI)所表示的表面活性劑。
[0085] Ri-N+H2-CH2CH2COO- (XI)
[0086] 在上述的式(XI)中，R1是碳原子數8~25的烷基、烯基或炔基。
[0087] 在上述的式(XI)中，作為R1，優選為碳原子數12~18的直鏈的烷基。作為上述的氨 基酸型兩性表面活性劑，例如，可舉出3_(十二烷基氨基)丙烷酸及3_(十四烷-1-基氨基)丙 燒酸等。
[0088] 作為甜菜堿型兩性表面活性劑，例如，可舉出以下的式(XII)所表示的表面活性 劑。
[_9]【化6】
[0090]
[0091] 在上述的式(XII)中，R1是碳原子數6~18的烷基或烯基;R2是碳原子數1~4的烷基 或烯基;R 3是碳原子數1~4的烷基或烯基、或者芐基;η是1或2。
[0092] 作為甜菜堿型兩性表面活性劑，例如，可舉出十二烷基二甲基氨基醋酸甜菜堿及 硬脂基二甲基氨基醋酸甜菜堿等。
[0093] 第2試劑中的表面活性劑的濃度優選設定為，在如上述一樣調制的測定樣品中，以 不使紅細胞溶血，并且可使混雜物的凝集體分散的終濃度含該表面活性劑。測定樣品中的 表面活性劑的終濃度可適宜設定，但優選是3ppm以上30ppm以下。
[0094] 在本實施方式中，為了防止pH變化導致的紅細胞的溶血，可將第2試劑的pH設為5 以上9以下、優選為6.5以上8.6以下、更優選為7.0以上7.8以下的范圍。從而，第2試劑也可 為了將PH保持一定而含緩沖劑。作為那樣的緩沖劑，與上述的稀釋用試劑中使用的緩沖劑 相同。
[0095] 在尿樣品中有時含磷酸銨、磷酸鎂、碳酸鈣等無晶性鹽類。在本實施方式中，為了 使這些的無晶性鹽類的影響降低，第2試劑也可含鰲合劑。鰲合劑只要是能除去無晶性鹽類 的鰲合劑，就無特別限定，可自現有技術中公知的脫鈣劑、脫鎂劑等適宜選擇。具體而言，可 舉出乙二胺四醋酸鹽(EDTA鹽）、CyDTA、DHEG、DPTA-OH、EDDA、EDDP、GEDTA、HDTA、HIDA、甲基-EDTA、NTA、NTP、NTPO、EDDPO等，在這些中特別優選為EDTA鹽。
[0096] 第2試劑中的鰲合劑的濃度，在如上述一樣調制的測定樣品中，優選設定為以可降 低無晶性鹽類的影響的終濃度含該鰲合劑。測定樣品中的終濃度根據上述的鰲合劑的種類 適宜設定。例如，在作為鰲合劑使用EDTA2鉀(EDTA-2K)時，測定樣品中的終濃度是O.lmM以 上500mM以下，優選是ImM以上IOOmM以下。
[0097] 在尿中存在酵母樣真菌及紅細胞時，在由流式細胞儀的分析中，已知有酵母樣真 菌和紅細胞的分級分離不太良好的情況。從而，第2試劑也可含使酵母樣真菌的細胞膜損傷 的物質。作為那樣的物質，可舉出2-苯氧基乙醇、芐基醇、苯乙基醇、1-苯氧基-2-丙醇、苯 酚、醋酸苯酯、苯并噻唑等，在這些中特別優選為2-苯氧基乙醇。通過使用含這樣的物質的 第2試劑，酵母樣真菌的染色性變化，紅細胞和酵母樣真菌的分級分離改善。
[0098] 已知尿的滲透壓分布在50~1300m0sm/kg的廣泛圍，但在測定樣品中滲透壓過低 或過高時，有紅細胞損傷的擔憂。測定樣品中的適宜的滲透壓是100m0sm/kg以上6 0 OmO sm/ kg以下，優選是150m0sm/kg以上500m0sm/kg以下。尿的滲透壓過高時，可通過用稀釋用試劑 或第2試劑稀釋適宜調節滲透壓。相反，尿的滲透壓過低時，第2試劑也可含滲透壓補償劑。 作為那樣的滲透壓補償劑，可舉出無機鹽類、有機鹽類、糖類等。作為無機鹽類，可舉出氯化 鈉、溴化鈉等。作為有機鹽類，可舉出丙酸鈉、丙酸鉀、丙酸銨草酸鹽等。作為糖類，可舉出山 梨糖醇、葡萄糖、甘露糖醇等。
[0099]在本實施方式中，將尿樣品、第1試劑和第2試劑混合的順序無特別限定，也可將這 些同時混合。優選為，先混合尿樣品和第2試劑，向其中進一步混合第1試劑。或者，也可先混 合第1試劑和第2試劑，向其中進一步混合尿樣品。
[0100] 在本實施方式中，將尿樣品、第1試劑和第2試劑的混合比例無特別限定，根據各試 劑中所含的成分濃度適宜確定即可。例如，尿樣品和第1試劑的混合比例可從以體積比1: 0.01~1的范圍確定。另外，尿樣品和第2試劑的混合比例可從以體積比1:0.5~10的范圍確 定。再有，尿樣品的量根據第1試劑和第2試劑適宜確定即可。尿樣品的量從不使測定時間變 得過長的觀點優選為I OOOyL以下。尿樣品的量10~I OOOyL左右對于測定是充分的。
[0101] 調制工序中的溫度條件是10~60 °C、優選為35~45°C。也可將各試劑預先加溫而 達這些溫度。另外，也可在將尿樣品和第1試劑及/或第2試劑混合后，溫育1秒鐘~5分鐘、優 選為5~60秒鐘。
[0102] 在本實施方式的方法中，進行檢測在上述的調制工序中得到的測定樣品中所含的 作為尿中有形成分的至少管型及紅細胞的工序。
[0103] 在得到的測定樣品中，尿中有形成分、特別管型及紅細胞由上述的熒光染料染色。 從而，通過使用熒光顯微鏡觀察測定樣品中的各有形成分的形狀及染色的程度等，可檢測 這些的有形成分。
[0104]在優選的實施方式中，在上述的檢測工序之前，還進行向測定樣品中所含的尿中 有形成分照射光而取得光學信息的工序。此光學信息的取得工序優選由流式細胞儀進行。 在由流式細胞儀的測定中，通過在染色的尿中有形成分通過流動池時向該有形成分照射 光，可作為自該有形成分發的信號得到光學信息。作為那樣的光學信息，優選為散射光信息 及熒光信息。
[0105] 散射光信息一般只要是可用市售的流式細胞儀測定的散射光的信息，就無特別限 定，例如，可舉出前方散射光(例如，光接收角度0~20度附近)或側方散射光(光接收角度90 度附近)等散射光的強度及波形信息等。更具體而言，作為散射光信息，可舉出散射光強度、 散射光脈寬及散射光積分值等。在現有技術中，已知側方散射光反映細胞的核或顆粒等內 部信息，前方散射光反映細胞的大小的信息。在本實施方式中，優選使用前方散射光的信 息。
[0106] 熒光信息只要是將適當的波長的激發光照射到染色的尿中有形成分而測定激發 的熒光而得到的信息，就無特別限定，例如，可舉出熒光的強度及波形信息。更具體而言，作 為熒光信息，可舉出熒光強度、熒光脈寬及熒光積分值等。再有，熒光自被第1試劑中所含的 熒光染料染色的有形成分內的核酸等發出。另外，光接收波長可根據第1試劑中所含的熒光 染料適宜選擇。
[0107] 在本實施方式中，流式細胞儀的光源無特別限定，可適宜選擇對于熒光染料的激 發適宜的波長的光源。例如，使用紅色半導體激光、藍色半導體激光、氬激光、He-Ne激光、汞 弧光燈等。特別是，由于半導體激光與氣體激光比非常地廉價，從而適宜。
[0108] 在本實施方式的方法中進行上述的取得工序時，在檢測工序中，基于在該取得工 序中得到的光學信息，檢測作為尿中有形成分的至少管型及紅細胞。再有，在"檢測"中，不 僅發現測定樣品中存在尿中有形成分，也包括對尿中有形成分進行分類及計數。
[0109] 在本實施方式中，尿中有形成分的檢測優選通過制成以散射光信息和熒光信息作 為二軸的散點圖，將得到的散點圖使用適當的解析軟件解析來進行。例如，在以X軸作為熒 光強度，以Y軸作為前方散射光強度描繪散點圖時，根據各尿中有形成分的粒子尺寸及染色 性(核酸含量），在散點圖上出現各自的集團（群集）。在本實施方式的方法中，可將至少管型 及紅細胞作為在各自不同的區域出現的2種集團進行檢測。另外，可由解析軟件在散點圖上 設包圍各集團的窗，對各窗中的粒子數進行計數。
[0110][尿樣品分析用試劑]
[0111]本實施方式的尿樣品分析用試劑ll(以下，也簡稱為"試劑"）是用于檢測作為尿樣 品中的有形成分的至少管型及紅細胞的試劑。本實施方式的試劑含選自Di0C2(3)、Di0C3 (3)、Di0C4(3)及Di0C5(3)的至少1種熒光染料。再有，對于本實施方式的試劑與對于本實施 方式的尿樣品分析方法中使用的第1試劑所述的相同。
[0112] 在本發明的范圍內也包括，含選自0丨002(3)、0丨003(3)、0丨(^4(3)及0丨(^5(3)的至 少1種熒光染料的試劑用于檢測作為尿樣品中的有形成分的至少管型及紅細胞的用途。在 圖1顯示本實施方式的試劑11之一例。
[0113] [尿樣品分析用試劑盒]
[0114] 本實施方式的尿樣品分析用試劑盒（以下，也簡稱為"試劑盒"）是用于檢測作為尿 樣品中的有形成分的至少管型及紅細胞的試劑盒。此試劑盒含：含選自Di0C2(3)、Di0C3 (3)、Di0C4(3)及Di0C5(3)的至少1種熒光染料的第1試劑，及含作為分散劑的表面活性劑的 第2試劑。
[0115] 對于試劑盒中所含的第1試劑及第2試劑與對于本實施方式的尿樣品分析方法中 使用的第1試劑及第2試劑所述的相同。
[0116] 在本實施方式中，優選將第1試劑和第2試劑收容到不同的容器中，作為具備這些 的2試劑型的試劑盒。在圖2顯示含容器中收容的第1試劑22及容器中收容的第2試劑33的本 實施方式的試劑盒之一例。
[0117] 在本發明的范圍內也包括試劑盒用于檢測作為尿樣品中的有形成分的至少管型 及紅細胞的用途，所述試劑盒含:含選自〇丨002(3)、0丨(^3(3)、0丨(^4(3)及0丨(^5(3)的至少1 種熒光染料的第1試劑，及含作為分散劑的表面活性劑的第2試劑。
[0118] 接下來，由實施例詳細地說明本發明，但本發明不限于這些實施例。 【實施例】
[0119] 【實施例1】
[0120] 在實施例1中，探索能對管型進行染色、并且能由對管型和粘液絲染色的差進行判 別的染料。再有，管型和粘液絲的判別通過在熒光顯微鏡下觀察樣品進行。另外，也進行由 流式細胞儀的測定。
[0121] (1)尿樣品
[0122] 作為尿樣品，使用含管型及粘液絲的尿。
[0123] (2)試劑
[0124] ?染色用試劑
[0125] 作為染色用試劑，調制含表1所示的各染料的染色液1~29。再有，這些染色液均為 使染料溶解于乙二醇(NACALAI TESQUE株式會社)至成lmg/mL的濃度而調制。
[0126] 【表1】
[0128] ?稀釋用試劑
[0129] 作為稀釋用試劑，使用HEPES-OH(100mM、pH7)(株式會社同仁化學研究所）。再有， 溶劑使用經逆滲透膜過濾的水。
[0130] (3)由熒光顯微鏡的觀察及結果
[0131] 將尿樣品（200yL)、稀釋用試劑(580yL)和各染色液(20yL)混合，于40°C反應1分鐘 而調制測定樣品。進而，將得到的測定樣品中的管型及粘液絲由熒光顯微鏡BX51(01ymp US 株式會社制)觀察。觀察的結果，上述的29種染料之中，能對管型進行染色、并且能由對管型 和粘液絲染色的差進行判別的染料是DioC2(3)、DioC3(3)、DioC4(3)、DioC5(3)、DioC6(3) 及Di 〇C7(3)的僅6種。在使用這些染料時，相比粘液絲，管型被更良好地染色，結果，可進行 管型和粘液絲的判別。
[0132] (4)由流式細胞儀的測定及結果
[0133] 受由熒光顯微鏡的觀察結果，對于分別用染色液1~6染色的樣品探討，是否由流 式細胞儀也能辨別管型和粘液絲。樣品的測定使用流式細胞儀UF-1000 i (Sysmex株式會社 制)進行。此由流式細胞儀的測定的具體的工序如下。首先，將尿樣品（200μυ、稀釋用試劑 (580yL)和各染色液(20yL)混合，于40 °C反應60秒鐘而調制測定樣品。進而，向測定樣品照 射光，取得前方散射光強度、側方散射光強度、焚光強度及焚光的積分值。再有，作為流式細 胞儀的光源，使用激發波長488nm的半導體激光。從熒光強度及熒光的積分值，算出相對管 型的粘液絲的熒光強度比及熒光總和比。結果示于表2。
[0134] 【表2】
LUl^j 表不，在便用染笆淞1~仕例時，災光強度比及災光總和比也均為1.2以上。 特別是得知，在使用染色液1~4時，熒光強度比及熒光總和比高。結果顯示，Di〇C2(3)、 01 〇03(3)、0丨〇04(3)及0丨〇05(3)適宜于由流式細胞儀辨別管型和粘液絲。
[0137] 【實施例2】
[0138] 在實施例2中，探討DioC2(3)、DioC3(3)、DioC4(3)、DioC5(3)、DioC6(3)&DioC7 (3)對紅細胞的影響（溶血）。再有，對紅細胞的影響基于測定樣品中的紅細胞數進行評價。
[0139] (1)紅細胞樣品
[0140]將自健康自愿者采集的人血液用生理鹽水(大塚制藥工場)稀釋1000倍，調制紅細 胞樣品。
[0141] (2)試劑
[0142] 作為染色用試劑，使用與實施例1相同的染色液1~6。作為稀釋用試劑，使用與實 施例1相同的緩沖液。
[0143] (3)測定及結果
[0144]樣品的測定使用流式細胞儀UF-1000 i (Sysmex株式會社制)進行。再有，與實施例1 同樣地調制測定樣品。進而，向測定樣品照射光，取得熒光強度及前方散射光強度。再有，作 為流式細胞儀的光源，使用激發波長488nm的半導體激光。進而，基于這些的測定值，對測定 樣品中的紅細胞數進行計數。結果示于表3。
[0145]【表3】
L〇147」如表3所示，當使用染色液5及6時，與使用染色液I~4時比，測定樣品中的紅細胞 的數顯著地減少。這顯示由染色用試劑中的Di〇C6(3)及Di〇C7(3)的影響而紅細胞溶血。從 而，在將Di 〇C6(3)及Di〇C7(3)用于尿樣品的染色時，難以對該樣品中的紅細胞正確地進行 計數。與此相對，得知0丨〇02(3)、0丨〇03(3)、0丨〇04(3)及0丨〇05(3)與0丨〇06(3)及0丨〇07(3)比， 給紅細胞帶來的影響極其小，適宜于尿樣品中的紅細胞的測定。
[0148] 【實施例3】
[0149] 在實施例3中，將使用流式細胞儀的本實施方式的尿樣品分析方法的臨床性能與 目測檢查的結果比較而進行評價。
[0150] (1)尿樣品
[0151] 作為尿樣品，使用由顯微鏡觀察判斷為未出現管型的陰性尿待測樣品（42待測樣 品）。
[0152] (2)試劑
[0153] ?染色用試劑
[0154] 作為染色用試劑，使用與實施例1相同的染色液2(含有Di〇C3(3))。
[0155] ?稀釋用試劑
[0156] 作為稀釋用試劑，調制下述的組成的稀釋液1及2。再有，在稀釋液1及2中，將經逆 滲透膜過濾的水作為溶劑使用。
[0157] 稀釋液 l:HEPES-OH(100mM、pH7)及 EDTA-2K(25mM)(中部 Chelest 株式會社）
[0158] 稀釋液 2 :HEPES-OH(100mM、pH7)、EDTA-2K(25mM)及 DTAB(IOppm)(東京化成工業株 式會社）
[0159] (3)測定及結果
[0160]樣品的測定使用流式細胞儀UF-1000 i (Sysmex株式會社制)進行。此由流式細胞儀 的測定的具體的工序如下。首先，將尿樣品（200yL)、稀釋用試劑(58〇yL)和各染色液(2〇yL) 混合，于40°C反應10秒鐘而調制測定樣品。進而，向得到的測定樣品照射光，取得前方散射 光強度、側方散射光強度及熒光強度。再有，作為流式細胞儀的光源，使用激發波長488nm的 半導體激光。基于這些的測定值算出測定樣品中的管型的數，由流式細胞儀(FCM)求出判斷 為陰性的待測樣品數。另外，以由目測（顯微鏡觀察）的陰性待測樣品數作為參照，求出由 FCM分析管型的特異度。結果示于表4。 「01611 r 豐 4?
[0163] 表4顯示，使用含Di〇C3(3)的染色用試劑和稀釋液處理尿樣品，通過用FCM測定得 到的測定樣品，可以70%以上的特異度分析尿樣品。另外，通過用作為分散劑含陽離子性表 面活性劑的DTAB的稀釋液處理尿樣品，特異度升高。這被認為是由于由DTAB的作用而與管 型類似的混雜物減少。
[0164] 本申請關于2014年2月28日申請的日本國專利申請特愿2014-039281號，將其專利 權利要求、說明書、附圖及摘要的全部作為參照并入本說明書中。
[0165] 【符號的說明】
[0166] 11:尿樣品分析用試劑
[0167] 22:第1試劑
[0168] 33:第 2試劑
【主權項】
1. 尿樣品分析方法，其包括： 將尿樣品和第1試劑混合而調制測定樣品的工序，所述第1試劑含選自3,3'_碘化二乙 基氧雜碳花青苷、3,3-碘化二丙基氧雜碳花青苷、3,3'-碘化二丁基氧雜花青苷及3,3-碘化 二戊基氧雜碳花青苷的至少1種熒光染料，及 檢測在調制工序中得到的測定樣品中所含的作為尿中有形成分的至少管型及紅細胞 的工序。2. 權利要求1所述的尿樣品分析方法，其中在調制工序中，進一步混合含作為分散劑的 表面活性劑的第2試劑。3. 權利要求2所述的尿樣品分析方法，其中表面活性劑是選自陽離子性表面活性劑、陰 離子性表面活性劑、兩性表面活性劑及非離子性表面活性劑的至少1種。4. 權利要求2所述的尿樣品分析方法，其中表面活性劑是十二烷基三甲基溴化銨。5. 權利要求2所述的尿樣品分析方法，其中第2試劑還含鰲合劑。6. 權利要求5所述的尿樣品分析方法，其中鰲合劑是乙二胺四醋酸鹽(EDTA鹽）。7. 權利要求1所述的尿樣品分析方法，其還包括向在調制工序中得到的測定樣品中所 含的尿中有形成分照射光而取得光學信息的工序， 檢測工序是基于取得的光學信息，檢測作為尿中有形成分的至少管型及紅細胞的工 序。8. 權利要求7所述的尿樣品分析方法，其中光學信息是散射光信息及熒光信息。9. 用于檢測作為尿中有形成分的至少管型及紅細胞的尿樣品分析用試劑，其含選自3， 3 碘化二乙基氧雜碳花青苷、3，3-碘化二丙基氧雜碳花青苷、3，3 碘化二丁基氧雜花青 苷及3,3-碘化二戊基氧雜碳花青苷的至少1種熒光染料。10. 用于檢測作為尿中有形成分的至少管型及紅細胞的尿樣品分析用試劑盒，其含： 第1試劑，其含選自3，3 碘化二乙基氧雜碳花青苷、3，3-碘化二丙基氧雜碳花青苷、3， 3 碘化二丁基氧雜花青苷及3，3-碘化二戊基氧雜碳花青苷的至少1種熒光染料，及 第2試劑，其含作為分散劑的表面活性劑。11. 權利要求10所述的尿樣品分析用試劑盒，其中表面活性劑是選自陽離子性表面活 性劑、陰離子性表面活性劑、兩性表面活性劑及非離子性表面活性劑的至少1種。12. 權利要求10所述的尿樣品分析用試劑盒，其中表面活性劑是十二烷基三甲基溴化 銨。13. 權利要求10所述的尿樣品分析用試劑盒，其中第2試劑還含鰲合劑。14. 權利要求13所述的尿樣品分析用試劑盒，其中鰲合劑是乙二胺四醋酸鹽(EDTA鹽）。
【文檔編號】G01N33/483GK106062556SQ201580010653
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2015年2月27日
【發明人】河合昭典
【申請人】希森美康株式會社