犬弓形蟲感染雙抗夾心elisa檢測試劑盒及制備方法
【專利摘要】本發明提供一種檢測犬弓形蟲循環抗原的雙抗夾心ELISA試劑盒及其制備方法，利用兩株抗弓形蟲SAG3單抗，即一株42#抗弓形蟲SAG3單抗和一株29#抗弓形蟲SAG3單抗建立了檢測犬弓形蟲CAg的雙抗體夾心ELISA方法。該檢測特異性高、靈敏度較好、準確性高、穩定性好。具有操作簡單、檢測快速，易于判斷等優點，適合于臨床的快速診斷和基層等流行病學調查。
【專利說明】
犬弓形蟲感染雙抗夾心EL ISA檢測試劑盒及制備方法
技術領域
[0001]本發明涉及犬弓形蟲感染循環抗原(CAg)的檢測方法，進一步講是提供了用于犬 弓形蟲感染的雙抗夾心ELISA檢測試劑盒，本發明還公開了該試劑盒的制備方法，屬于犬科 動物疾病檢測技術領域。
【背景技術】
[0002]剛第弓形蟲(Toxoplasma gondii)是一種專性細胞內寄生的機會性致病原蟲。它 能廣泛地感染脊椎動物包括人。大多數免疫功能正常人群感染弓形蟲后成為無癥狀的帶蟲 宿主;部分感染者會出現弓形蟲病較典型的癥狀。
[0003] 犬是弓形蟲的中間宿主，也是弓形蟲病的重要傳染源。近年來，因飼養寵物犬數量 的不斷攀升，感染弓形蟲的犬對人類公共健康造成了極大的潛在威脅。現行檢測弓形蟲病 的方法多以抗體檢測為主。但檢測抗體不能區分現癥感染還是既往感染。而檢測循環抗原 (CAg)可確定現癥感染。目前尚無理想的檢測犬弓形蟲感染循環抗原的方法。
【發明內容】
[0004] 本發明公開一種犬弓形蟲感染循環抗原(CAg)雙抗夾心ELISA檢測試劑盒，用于檢 測犬是否感染弓形蟲，解決了當前尚無理想的檢測犬弓形蟲感染循環抗原方法的問題。
[0005] 本發明提供了犬弓形蟲雙抗夾心ELISA檢測試劑盒的制備方法，適用于工業化生 產。
[0006] 本發明所述的檢測弓形蟲循環抗原的雙抗夾心ELISA試劑盒，其特征在于主要由 以下部分組成：
[0007] HRP酶標單抗、酶標物稀釋液、聚苯乙烯塑料反應板、PBS (磷酸鹽緩沖液）、包被液、 封閉液、洗滌液、底物溶液、終止液及樣品稀釋液、犬弓形蟲感染參照陽性及陰性血清等。
[0008] 所述捕獲抗體為42#抗弓形蟲SAG3單克隆抗體(Anti-A-SAG3-42)(效價為204800， 亞型為G1);
[0009] 檢測抗體為HRP標記的29#抗弓形蟲SAG3單克隆抗體(HRP-Anti-A-SAG3-29)(效價 為204800,亞型為G2a)
[0010]包被液是PH值為9.6的0.05M碳酸鹽緩沖液；
[0011] 樣品稀釋液(PBS)及洗滌液(PBST)是含有0.5 % Tween-20的磷酸鹽緩沖液；
[0012 ] 封閉液是1 〇 %胎牛血清的PBST溶液；
[0013] 底物顯色液是TMB底物溶液；
[0014] 終止液是2mo 1 /L的H2SO4溶液。
[0015] 本發明所述的檢測犬弓形蟲循環抗原的雙抗夾心ELISA試劑盒的制備方法，包括 以下步驟：
[0016] 1)捕獲抗體，即42#抗弓形蟲SAG3單抗:pH 9.6的包被液稀釋后的單抗，使稀釋濃 度達到1:800;
[0017] 2)樣品稀釋液為pH值7.4的磷酸鹽緩沖液；依次在800mL去離子水中溶解8g的 NaCl、0.2g的KC1、3.63g的Na2HP〇4 ? 12H20和0.24g的KH2P〇4,以濃HC1調節溶液pH值至7.4，加 去離子水定容至lOOOmL，高壓后常溫保存待用；
[0018] 3)包被液為pH值9.6的碳酸鹽緩沖液；稱量2.93g的NaHC〇3和1.95g的Na2C〇3于 250mL燒杯中，加去離子水定容至100mL，高壓后常溫保存待用；
[0019] 4)封閉液為10%胎牛血清的PBST液：lmL胎牛血清溶解于PBST液，定容至10mL;
[0020] 5)洗滌液為0 ? 01mol/L，pH7 ? 4的TOST液：依次在800mL去離子水中溶解8g的NaCl、 0 ? 2g的KC1、3 ? 63g的Na2HP〇4 ? 12H20和0 ? 24g的KH2P〇4，以濃HC1 調節溶液pH值至7 ? 4，加入 0.5mL的Tween-20,加去離子水定容至lOOOmL，高壓后常溫保存待用；
[0021 ] 6)底物溶液:購買的商品化的TMB底物顯色液；
[0022] 7)終止液為2mol/L H2S〇4:濃硫酸22.2mL，去離子水177.8mL;將濃硫酸沿杯壁緩慢 倒入水中，混勻，室溫貯存待用；
[0023] 8)酶標抗體為HRP標記29#抗弓形蟲SAG3單抗：用TOST液1:3000稀釋酶標物后4°C 保存；
[0024] 9)犬弓形蟲參照陽性血清；
[0025] 10)犬弓形蟲參照陰性血清；
[0026] 11)聚苯乙烯塑料反應板；
[0027]試劑盒的保存溫度為4°C保存。
[0028]本發明檢測試劑盒的檢測原理：以42#抗弓形蟲SAG3單抗(捕獲抗體)為包被抗體， 將其包被酶標板后，洗去游離部分;用封閉液進行封閉，洗去游離部分;再加入被檢血清，如 果血清有犬弓形蟲CAg就能和包被抗體特異性結合，形成免疫復合物，將游離的被檢血清洗 去；加入HRP酶標29#抗弓形蟲SAG3單抗(檢測抗體），就會形成42#抗弓形蟲SAG3單抗-犬弓 形蟲CAg-29#抗弓形蟲SAG3酶標單抗復合物，洗去游離的酶標物;加入顯色底物，酶標物會 使無色的顯色劑現色，加終止液后變黃;若被檢血清無弓形蟲CAg，則不能形成42#抗弓形蟲 SAG3單抗-犬弓形蟲CAg-29#抗弓形蟲SAG3酶標單抗物復合物，酶標物不能被固定于酶標 板，加入顯色底物及終止液后無色。
[0029]酶標儀測定在45Onm波長時的吸光度值（OD45值），終止反應后顏色的深淺， 0D45Qnm值大小與相應待檢血清樣品中的弓形蟲CAg含量的多少呈正相關關系。
[0030] 本發明積極效果在于：利用兩株抗弓形蟲SAG3單抗即一株42#抗弓形蟲SAG3單抗 和一株29#抗弓形蟲SAG3單抗建立了檢測犬弓形蟲CAg的雙抗體夾心ELISA方法。該檢測特 異性高、靈敏度較好、準確性高、穩定性好。具有操作簡單、檢測快速，易于判斷等優點，適合 于臨床的快速診斷和基層等流行病學調查。
[0031]本發明的試劑盒所有試劑均為已配制好的工作液，可以直接操作無需處理，減少 了操作步驟，可以快速、靈敏檢測待檢犬血清中的CAg，避免了復雜的操作，對設備要求低； 且本發明的試劑盒樣本用量小，試劑保存時間長，對操作者無毒性等；因此本發明應用42# 抗弓形蟲SAG3單抗和29#抗弓形蟲SAG3單抗建立的檢測犬弓形蟲CAg的雙抗體夾心ELISA方 法檢測試劑盒具有較好的市場前景。
【具體實施方式】：
[0032]本發明與以下實施例作進一步說明，但本發明的內容不局限于以下的實施例中。 [0033] 實施例1:
[0034]用HRP標記單克隆抗體
[0035]依據Glue活化辣根過氧化物酶試劑盒的說明書標記29#抗弓形蟲SAG3單克隆抗 體。步驟如下：
[0036] (1)取McAb-29溶液100ug，加入100ul REAGENTIA型活化辣根過氧化物酶。
[0037] (2)加入REAGENTII后充分混勻并用PH試紙調PH值9.5,置于37°C，30min。
[0038] (3)用200ul的槍頭，插入硼氫化鈉粉末中，在槍頭尖端可看到白色粉末時，將其轉 移至酶標物中，混勻。
[0039] (4)加入REAGENIII (約3倍體積的REAGENT II)并確保酶結合物PH在7 ? 0左右。
[0040] (5)加入甘油至總體積的50%，以穩定酶結合物活性，-20°C保存。
[0041 ] 實施例2:
[0042]標記抗體最佳稀釋度的確定
[0043]選擇最佳封閉劑，捕獲抗體和犬弓形蟲參考陽性血清按最佳工作濃度稀釋，將檢 測抗體稀釋為不同濃度1:3000、1:6000、1:9000。加底物緩沖液顯色，測定OD45〇nm值，確定檢 測抗體最佳工作濃度為1:3000。
[0044] 實施例3:
[0045] 雙抗夾心ELISA方法的建立
[0046] 1、捕獲抗體和犬弓形蟲參考陽性血清工作濃度的確定
[0047] 采用棋盤方陣的方法，分別取不同濃度的捕獲抗體：1:200、1:400、1:800、1:1600、 1:3200、1:6400/孔的稀釋倍數包被酶標板，選擇最佳封閉劑，用不同稀釋倍數1:6、1:12、1: 24、1:48、1:96、1:192的弓形蟲參考陽性血清孵育，進行雙抗體夾心ELISA，確定捕獲抗體和 血清最佳工作濃度。捕獲抗體的最佳包被濃度為1:800/100此，弓形蟲參考陽性血清最佳稀 釋度為1:12。
[0048]表1棋盤法確定抗體最適包被濃度和弓形蟲參考陽性血清最適稀釋濃度
[0050] 2、最佳封閉劑的選擇
[0051] 在已確定的最佳包被抗體、酶標抗體的稀釋濃度下，選用3種封閉劑(包括10%胎 牛血清、5%脫脂奶粉、1%BSA)進行封閉。10%的胎牛血清為最佳封閉劑(見表2)。
[0052]表2 ?最佳封閉劑的確定
[0054] 3、雙抗夾心ELISA臨界值的判定
[0055] 按建立的雙抗體夾心ELI SA方法對15份陰性血清進行檢測計算出15份陰性血清的 X=0.087,SD = 0.0125;陽性界限3+3SEMU25;陰性界限根據統計學原則 得到雙抗體夾心ELISA方法判定標準0D45Q?值彡0.125者判為陽性值，0D45Q?值〈0.112者判 為陰性，介于二者之間，即〇.125〈X彡0.112判為可疑(見表3)。
[0056] 表3 ?雙抗體夾心ELISA臨界值的確定
[0058] 4、性能的測定
[0059] (1)敏感性試驗
[0060] 采用已經建立的雙抗夾心ELISA方法，將犬弓形蟲參考陽性血清按1:12到1:768倍 比稀釋。判斷該方法的敏感性。該方法的靈敏性為1:48(見表4)。
[0061 ] 表4 ?敏感性試驗
[0063] (2)特異性試驗
[0064] 以犬陰性血清作為參照，經雙抗體夾心ELISA方法檢測，犬弓形蟲參考陽性血清與 犬心絲蟲陽性血清、犬等孢球蟲陽性血清、犬蛔蟲陽性血清、犬巴貝斯蟲陽性血清均無交叉 反應發生，確定該方法的特異性(見表5 )，結果表明該方法特異性較強。
[0065] 表5特異性試驗
[0067] (3)重復性試驗[0068] 選用3份犬弓形蟲參考陽性血清和3份犬弓形蟲參照陰性血清，經建立的雙抗體夾 心ELISA方法進行批間批內重復性試驗后得到，批內重復性試驗的變異系數最大值為 10.47%，批間變異系數最大值為14.00%，表明該方法重復性較好(見表6)。
[0069] 表6 ?雙抗體夾心ELISA的批內、批間重復性試驗結果
[0071] 實施例4
[0072]檢測犬弓形蟲CAg雙抗體夾心ELISA試劑盒的組裝 [0073] ELISA檢測試劑盒包括以下組分：
[0074] 1.捕獲抗體，即42#抗弓形蟲SAG3單抗:pH 9.6的包被液稀釋后的單抗，使稀釋濃 度達到1:800;
[0075] 2.樣品稀釋液，即roS(磷酸鹽緩沖液，pH值7.4):依次在800mL去離子水中溶解8g 的NaCl、0.2g的KC1、3.63g的Na2HP〇4 ? 12H20和0.24g的KH2PO4,以濃HC1調節溶液pH值至7.4， 加去離子水定容至l〇〇〇mL，高壓后常溫保存待用；
[0076] 3?包被液(碳酸鹽緩沖液，pH值9 ? 6):稱量2 ? 93g的NaHC03和1 ? 95g的Na2C03于250mL 燒杯中，加去離子水定容至100mL，高壓后常溫保存待用；
[0077] 4.封閉液（10 %胎牛血清的PBST液）：lmL胎牛血清溶解于PBST液，定容至10mL; [0078] 5.洗滌液(0.01mol/L，pH7.4的TOST液）：依次在800mL去離子水中溶解8g的NaCl、 0 ? 2g的KC1、3 ? 63g的Na2HP〇4 ? 12H20和0 ? 24g的KH2P〇4，以濃HC1 調節溶液pH值至7 ? 4，加入 0.5mL的Tween-20,加去離子水定容至lOOOmL，高壓后常溫保存待用；
[0079] 6.底物溶液:購買的商品化的TMB底物顯色液；
[0080] 7.終止液(2mol/L H2S〇4):濃硫酸22.2mL，去離子水177.8mL。將濃硫酸沿杯壁緩慢 倒入水中，混勻，室溫貯存待用；
[00811 8.酶標抗體(HRP標記29#抗弓形蟲SAG3單抗)使用液配制：用PBST液1:3000稀釋酶 標物后4°C保存；
[0082] 9.犬弓形蟲參照陽性血清；
[0083] 10.犬弓形蟲參照陰性血清；
[0084] 11.聚苯乙烯塑料反應板；
[0085] 試劑盒的保存溫度為4°C保存。弓形蟲參照陽性血清和參照陰性血清為-20°C保 存。
[0086] 實施例5
[0087]犬待檢樣本檢測:長春地區某寵物醫院提供待檢犬血清76份。
[0088] 其步驟如下：
[0089] (1)取捕獲抗體以每孔100yL的體積包被酶標板，4°C條件下包被過夜；
[0090] (2)用洗滌液洗滌3次，每次洗滌lmin，間隔5min，拍干；
[0091] (3)每孔加入1 OOyL封閉液，37 °C溫育2h;
[0092] (4)用洗滌液洗滌3次，每次洗滌lmin，間隔5min，拍干；
[0093] (5)待檢血清用PBS稀釋（1:12)，同時設陰性及空白對照各1孔，陰性對照血清也以 1:12稀釋，空白對照不用稀釋，直接加樣。37°C溫育2h;
[0094] (6)用PBST洗滌3次，每次洗滌lmin，間隔5min，拍干；
[0095] (7)酶標抗體使用液，每孔加1 OOyL，37 °C溫育50min;
[OO96] (8)用洗滌液洗滌4次，每次洗滌lmin，間隔5min，拍干；
[0097] (9)加入TMB底物溶液，每孔100yL，
[0098] (10)37°C顯色10min后，每孔滴加100yL終止液，室溫終止即可；
[0099] (11)測0D值：用酶標儀測定0D45Qnm值;每次實驗每板均設參照陰性血清和空白對 照。
[0100] (12)結果判定：以空白對照孔調零后測各孔值，用酶標儀于450nm讀取0D值。當 OD45〇nm多0 ? 125時，樣品判定為陽性；當OD45〇nm<0 ? 112時，樣品判定為陰性；當0 ? 125< OD45〇nm<0.112時，樣品判定為可疑，但是需要重新檢測。
[0101] 應用已建立的雙抗夾心ELISA方法對76份來自長春地區某寵物醫院犬待檢血清進 行檢測，陽性率為5.26% (4/76)。
【主權項】
1. 一種檢測弓形蟲循環抗原的雙抗夾心ELISA試劑盒，其特征在于主要由以下部分組 成： HRP酶標單抗、酶標物稀釋液、聚苯乙烯塑料反應板、PBS(磷酸鹽緩沖液）、包被液、封閉 液、洗滌液、底物溶液、終止液及樣品稀釋液、犬弓形蟲感染參照陽性及陰性血清； 所述捕獲抗體為42#抗弓形蟲SAG3單克隆抗體(Anti-A-SAG3-42)(效價為204800，亞型 為 G1); 檢測抗體為HRP標記的29#抗弓形蟲SAG3單克隆抗體(HRP-Anti-A-SAG3-29)(效價為 204800,亞型為 G2a) 包被液是PH值為9.6的0.05M碳酸鹽緩沖液； 樣品稀釋液(PBS)及洗滌液(PBST)是含有0.5% Tween-20的磷酸鹽緩沖液； 封閉液是10 %胎牛血清的PBST溶液； 底物顯色液是TMB底物溶液； 終止液是2mol/L的H2S〇4溶液。2. 如權利要求1所述的一種檢測弓形蟲循環抗原的雙抗夾心ELISA試劑盒制備方法，包 括以下步驟： 1) 捕獲抗體，即42#抗弓形蟲SAG3單抗:pH 9.6的包被液稀釋后的單抗，使稀釋濃度達 到1:800; 2) 樣品稀釋液為pH值7.4的磷酸鹽緩沖液;依次在800 mL去離子水中溶解8 g的NaCl、 0.28的1((：1、3.63 8的恥2冊04.12!120和0.24 8的腿2?04，以濃11(：1調節溶液?!1值至7.4，加去 離子水定容至1000 mL，高壓后常溫保存待用； 3) 包被液為口田直9.6的碳酸鹽緩沖液;稱量2.938的似!1〇)3和1.95 8的似2〇)3于250 1^ 燒杯中，加去離子水定容至100 mL，高壓后常溫保存待用； 4) 封閉液為10%胎牛血清的PBST液：1 mL胎牛血清溶解于PBST液，定容至10 mL; 5) 洗滌液為0.01 mol/L，pH7.4的TOST液：依次在800 mL去離子水中溶解8 g的NaCl、 0.2 g的KC1、3.63 g的Na2HP〇4.12H20和0.24 g的KH2P〇4,以濃HC1 調節溶液pH值至7.4,加入 0.5 mL的Tween-20,加去離子水定容至1000 mL，高壓后常溫保存待用； 6) 底物溶液:購買的商品化的TMB底物顯色液； 7) 終止液為2 mol/L H2S〇4:濃硫酸22.2 mL，去離子水177.8 mL;將濃硫酸沿杯壁緩慢 倒入水中，混勻，室溫貯存待用； 8) 酶標抗體為HRP標記29#抗弓形蟲SAG3單抗：用PBST液1: 3000稀釋酶標物后4 °C保 存； 9) 犬弓形蟲參照陽性血清； 10) 犬弓形蟲參照陰性血清； 11) 聚苯乙烯塑料反應板； 試劑盒的保存溫度為4 °C保存。
【文檔編號】G01N33/577GK106053818SQ201610383181
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月2日
【發明人】李建華, 宋慧琦, 張西臣, 楊升, 高珺珊, 寇金華, 宮鵬濤, 楊舉, 李 赫, 李棕松, 楊正濤, 尹繼剛
【申請人】吉林大學