Gpc1作為腫瘤診斷標志物的用圖
【專利摘要】本發明提供了GPC1蛋白作為腫瘤診斷標志物的用途。GPC1蛋白作為腫瘤診斷標志物可用于制備消化系統惡性腫瘤診斷試劑或試劑盒。本發明申請的腫瘤標志物GPC1，目前在小規模臨床樣本中即可證實適合作為消化系統腫瘤的診斷標志物，較傳統AFP、CEA、CA199等均具有更好的敏感性和特異性，可作為人群普查的腫瘤標志物。
【專利說明】
GPC1作為腫瘤診斷標志物的用途
技術領域
[0001] 本發明涉及GPC1作為腫瘤診斷標志物的用途，用于早期診斷腫瘤。
【背景技術】
[0002] 腫瘤標志物是指特異性存在于惡性腫瘤細胞，或由惡性腫瘤細胞異常產生的物 質，或是宿主對腫瘤細胞的刺激反應而產生的物質。腫瘤標志物能夠反映腫瘤發生、發展， 監測腫瘤對治療反應的一類物質。目前體檢常見的腫瘤標志物包括:1 )CEA:常見于胃腸癌、 肺癌、卵巢癌等腫瘤中；2)AFP:是最早發現的腫瘤標識物，常見于原發性肝細胞肝癌；3) PSA:常見于前列腺癌;4)CA199:常見于胰腺癌。但目前臨床應用的腫瘤標志物都缺乏很好 的敏感性和特異性，因此，對于新型高特異性敏感性腫瘤標志物的開發十分關鍵，有利于我 們早期發現腫瘤、預測患者預后、和進行個性化治療，并對腫瘤患者進行管理和隨訪。
[0003] GPC1是一種細胞膜卯定蛋白，大量研究表明，GPC1在胰腺癌、乳腺癌、神經膠質瘤、 卵巢癌、結腸癌等實體瘤組織中呈高表達。血清中的外泌體是由正常細胞或者腫瘤細胞分 泌的微囊泡，對微環境的變化很穩定。外泌體中含有蛋白質、核酸等多種小分子物質，可反 映機體的疾病狀態。
[0004] 發表在2015年nature上的一篇文章發現在胰腺癌患者的血清外泌體中明顯高表 達GPC1，而相比之下胰腺炎、良性胰腺病變和正常對照組中的血清外泌體GPC1的表達水平 較低，提示GPC1可能作為胰腺癌早期診斷的腫瘤標志物。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是提供GPC1蛋白的新用途。
[0006] 為了達到上述目的，本發明采用了如下技術方案：
[0007] GPC1蛋白作為腫瘤診斷標志物在制備消化系統惡性腫瘤診斷試劑或試劑盒中的 用途。
[0008] 優選地，所述的消化系統惡性腫瘤為肝癌、胃癌、食管癌、結直腸癌和胰腺癌中的 至少一種。
[0009] 優選地，所述的消化系統惡性腫瘤診斷試劑包括抗GPC1蛋白的抗體。
[0010] 優選地，所述的GPC1蛋白為外泌體膜上卯定的GPC1蛋白。
[0011] -種消化系統惡性腫瘤診斷試劑盒，其特征在于，包括抗GPC1蛋白的抗體、帶熒光 的二抗，和可吸附外泌體并被流式細胞儀所檢測到的磁珠。
[0012]本發明通過納入64例胰腺癌、61例食管癌、54例胃腺癌、42例結直腸癌、30例肝癌， 并用30例正常對照、30例胃腸息肉、7例胰腺炎作對照，發現GPC1可作為消化系統惡性腫瘤 的診斷標志物，且具有較高的敏感性和特異性。
[0013]與現有技術相比，本發明的有益效果是：
[0014] 1、本發明申請的腫瘤標志物GPC1，目前在小規模臨床樣本中即可證實適合作為消 化系統腫瘤的診斷標志物，較傳統AFP、CEA、CA199等均具有更好的敏感性和特異性，可作為 人群普查的腫瘤標志物。
[0015] 2、目前大部分血清腫瘤標志物采用ELISA或電化學發光的方法，檢測血清中的腫 瘤相關蛋白，有如下問題：1)如果該腫瘤相關蛋白不是膜蛋白，則部分血清中的腫瘤蛋白被 外泌體包被起來，ELISA無法檢測到，僅能夠檢測血清中游離的腫瘤蛋白，從而產生誤差。2) 血清中游離的腫瘤蛋白受保存條件和檢測時間影響易降解或變性，都會使檢測結果受到影 響。3)血清中游離的腫瘤蛋白不同于外泌體所包含蛋白，大部分由細胞崩解所被動產生，因 此易受炎癥和藥物等影響，對于腫瘤的診斷敏感性和特異性較低。
[0016] 3、血清中的外泌體對保存環境和檢測時間都很穩定，不易被降解，且外泌體內的 蛋白、核酸等均為細胞主動或被動分泌，為功能性的，更具診斷價值。而本發明通過提取血 清中的外泌體，檢測外泌體表面的膜鉚釘蛋白GPC1，可保證結果的穩定和可靠。
【附圖說明】
[0017] 圖1各組血清外泌體GPC1陽性率柱狀圖，可見肝癌、胃癌、食管癌、結直腸癌、胰腺 癌中血清外泌體GPC1陽性率明顯高于胃腸息肉、胰腺炎和正常組，P值〈0.01。
[0018] 圖2為R0C曲線圖，如圖2所示，外泌體GPC1陽性率可診斷肝癌、胃癌、食管癌、結直 腸癌、胰腺癌，且相比于傳統的腫瘤標志物CA199、AFP、CEA具有較高的敏感性和特異性。圖 中，A為GPC1和CA199對胰腺癌診斷的R0C曲線，B為GPC1和AFP對肝癌診斷的R0C曲線，C為 GPC1和CEA對胃癌診斷的R0C曲線，D為GPC1對食管鱗癌診斷的R0C曲線，E為GPC1和CEA對胰 腺癌診斷的R0C曲線。
[0019] 圖3為胰腺癌患者術前和術后(術后5天)血清中GPCl+crExos的表達水平圖，如圖3 所示，胰腺癌患者術后5天血清外泌體GPC1陽性率明顯低于術前。
【具體實施方式】
[0020] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明 而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人 員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定 的范圍。
[0021] 實施例
[0022] 1、實驗方法：
[0023] (1)病人和樣本納入：
[0024]在本實驗中，共納入了64個胰腺癌患者，61個食管鱗癌患者，54個胃腺癌患者，42 個結直腸癌患者，30例肝癌患者，30個胃腸息肉患者，7個胰腺炎患者，和30個正常人對照。
[0025] 腫瘤患者的入選和排除標準包括：1)有明確的病理診斷確診為相應腫瘤;2)初診 腫瘤，之前沒有進行過任何抗癌治療;3)沒有其他急性疾病或者系統性疾病例如自身免疫 性疾病、糖尿病、冠心病等。
[0026] 對照組的患者要求沒有急性疾病或者系統性疾病。
[0027] (2)樣品收集
[0028]血樣采集后置于黃頭促凝管中，在4°C下以離心力2500g離心10分鐘，吸取上層淡 黃色血清之后存儲于-80°C冰箱中。
[0029] 外泌體的提取借助Invitrogen公司Total Exosome Isolation試劑盒，提取方法 如下：20yl提取試劑加入100ul血清中，4°C孵育30分鐘，之后在室溫以離心力10,000g離心 10分鐘，棄去上清，沉淀溶于40ul 1 X PBS中，即為外泌體。
[0030] (3)流式分析外泌體包被磁珠
[0031 ] 取100ul血清中所提的外泌體中加入5ul 4-ym aldehyde/sulphate latex磁珠 (Invitrogen)室溫顛倒翻轉15分鐘混勾，之后加入lml PBS繼續室溫顛倒旋轉30分鐘。加入 0.5ml 100mM glycine(甘氨酸)和2%BSA(牛血清白蛋白）室溫顛倒旋轉30分鐘。以離心力 14，800g離心1分鐘后沉淀為外泌體包被磁珠，用2 %BSA清洗并再次離心，沉淀用10 %BSA終 止反應。再次用2%BSA清洗磁珠后用GPC1-抗（Invitrogen，濃度為3yl抗體加入20yl 2% BSA中）室溫孵育30分鐘。清洗后用Alexa-488標記的熒光二抗（Invitrogen，濃度為3yl抗體 加入20yl 2%BSA中）4°C孵育半小時。之后用2%BSA反復清洗并離心2次。沉淀用100ul 2% BSA溶解并避光保存。僅用二抗孵育的樣品作為陰性對照并設門。樣品用流式細胞儀檢測 GPC1+的外泌體包被磁珠，100，000個磁珠中GPC1陽性率作為每個樣品的最終指標。
[0032] (4)統計方法
[0033]統計米用SPSS 19.0for Windows(SPSS Inc.，Chicago，USA)軟件進行。
[0034] 2、實驗結果：
[0035] (1)、如圖1所示，腫瘤患者血清中GPC1+外泌體(GPCl+crExos)水平明顯增高：
[0036] 正常人GPCl+crExos平均值為0 ? 67 ± 0 ? 12 % (范圍從0 ? 12到2 ? 29 % )
[0037] 胃腸息肉1.12±0.36%(范圍從0.006到10.4%)
[0038] 胰腺炎0 ? 69 ±0 ? 22% (范圍從0 ? 24到 1 ? 87 % )
[0039] 肝癌 10.20± 1.44% (范圍從0.76到32%)
[0040] 胃腺癌29 ? 96±3 ? 64% (范圍從2 ? 68到99 ? 5% )
[0041 ]食管鱗癌30.91 ±3.01 % (范圍從 1.18到97.9%)
[0042] 結直腸癌33.18±3.05% (范圍從5.65到81.7%)
[0043] 胰腺癌 34.34±3.01%(范圍從 3.44 到 99 ? 8 % )
[0044] P<〇.〇〇〇1〇
[0045] (2)、GPCl+crEX〇S可作為胃腸系統腫瘤的診斷標志物(表1，圖2)
[0046] 采用R0C曲線圖計算相應的腫瘤蛋白在診斷腫瘤時工作曲線下面積和診斷的精確 性、敏感性，從而得到表1和圖2。傳統腫瘤標志物采用Roche cobas e411全自動電化學免疫 發光分析儀和配套試劑檢測獲得。
[0047]表1 GPC1陽性的外泌體水平和傳統腫瘤標志物診斷效率
[0048]
[0050] 縮寫:AUC代表曲線下面積，ROC代表工作曲線特性;95 % CI代表95 %可信區間；
[0051 ]如圖2所示，外泌體GPC1陽性率可診斷肝癌、胃癌、食管癌、結直腸癌、胰腺癌，且相 比于傳統的腫瘤標志物CA199、AFP、CEA具有較高的敏感性和特異性。
[0052]從實驗結果中可以看出，陽性率達到2.035%以上有腫瘤風險，當陽性率成倍增長 時提示腫瘤風險大，需進一步行影像學或胃腸鏡檢查。
[0053] (3)、GPCl+crExos水平和臨床特點間的關系
[0054]選取的病人和樣本的臨床特點如表2、3所示：
[0055]表2納入病人臨床資料：
[0056]
[0058]表3 GPC1陽性外泌體水平和患者臨床特性之間的關系：
[0061 ] 通過上述軟件分析得到GPCl+crExos水平和胰腺腫瘤侵犯深度(P = 0.042)、食管 鱗癌17#分期相關(P = 0.019)，另外在胰腺癌患者中男性患者血清GPCl+crExos水平更高(P =0.002)。因此，GPC1蛋白在胰腺腫瘤中侵犯越深則表達水平越高，在食管鱗癌TM1分期越 晚期則表達水平越高。
[0062] (4)、GPC1與患者預后復發相關
[0063]在上述的64個胰腺癌患者中，選取12例胰腺癌患者，采用上述實驗方法檢測12例 胰腺癌患者術前和術后(術后5天)血清中GPCl+crExos的表達水平，發現11個患者術后GPC1 +crExos的表達水平發生明顯下降(P = 0.020，如圖3所示）。由于術后GPCl+crExos的表達水 平明顯下降，提示其表達與腫瘤負荷相關。因此在復發情況下可能再次升高。
【主權項】
1. GPC1蛋白作為腫瘤診斷標志物在制備消化系統惡性腫瘤診斷試劑或試劑盒中的用 途。2. 如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的消化系統惡性腫瘤為肝癌、胃癌、食管 癌、結直腸癌和胰腺癌中的至少一種。3. 如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的消化系統惡性腫瘤診斷試劑包括抗 GPC1蛋白的抗體。4. 如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的GPC1蛋白為外泌體膜上卯定的GPC1蛋 白。5. -種消化系統惡性腫瘤診斷試劑盒，其特征在于，包括抗GPC1蛋白的抗體、帶熒光的 二抗，和可吸附外泌體并被流式細胞儀所檢測到的磁珠。
【文檔編號】G01N33/574GK106053815SQ201610513757
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年7月1日
【發明人】沈錫中, 陳妍潔, 吳昊, 劉韜韜, 董玲
【申請人】復旦大學附屬中山醫院