一種基于手性納米組裝體的循環腫瘤細胞檢測新方法
【專利摘要】本發明提供了一種基于手性納米組裝體的循環腫瘤細胞檢測新方法，涉及生物治療技術領域。其特征在于循環腫瘤細胞相比于正常細胞HER2過度表達，利用HER2適配體修飾的手性Ag@Au核殼納米粒子組裝體實現了對循環腫瘤細胞的特異性識別。包括如下步驟：Ag@Au核殼納米粒子的制備；HER2適配體修飾的手性Ag@Au核殼納米粒子組裝體的制備；利用手性Ag@Au核殼納米粒子組裝體與HER2接觸發生解離特異性識別并檢測HER2陽性乳腺癌SK?BR?3細胞；利用手性Ag@Au核殼納米粒子組裝體對生物樣品中的循環腫瘤細胞進行特異性識別檢測。
【專利說明】
一種基于手性納米組裝體的循環腫瘤細胞檢測新方法
技術領域
[0001]本發明建立一種基于手性納米組裝體的循環腫瘤細胞檢測新方法，屬于納米生物傳感領域。
【背景技術】
[0002]手性納米超材料來源于手性分子和金屬納米結構之間的等離子-激子相互作用以及組裝體的空間排布。研究手性納米材料的動態等離子圓二色性響應是獲取新型手性超材料的關鍵，在不對稱催化、對映選擇性分離和等離子激元器件應用上有潛在的研究價值。
[0003]控制手性超材料與光的相互作用是調控手性信號的關鍵，等離子納米粒子的局域表面等離子體共振(LSPR)產生的局部電磁場增強為放大手性信號提供了一個有效的研究途徑。和其他貴金屬納米粒子相比，銀在可見光波段具有最好的等離子增強作用，同時金具有優異的生物相容性和穩定性，可以修飾在銀納米顆粒的外層，因此AgOAu核殼納米粒子可能產生強烈的特定的等離子圓二色性響應，但有關AgOAu核殼納米粒子的等離子手性活性的研究較少。了解AgOAu核殼納米粒子組裝體的動態等離子圓二色性響應有利于研究銀核-金殼實時耦合作用，發揮其在光催化劑、手性光學傳感器和光電子器件等領域的實際應用。
[0004]與紫外和拉曼信號相比，手性信號具有更高的靈敏度和可信度，手性組裝體強烈的等離子響應使得其有可能應用于手性光學傳感器，可以用于循環腫瘤細胞(CTCs)的檢測。HER2是來自于HER2陽性乳腺癌SK-BR-3細胞的特定相關標記物，HER2適配體被篩選出來，并對HER2表現出良好的生物親和性。基于手性AgOAu核殼納米粒子組裝體可以實現CTCs的快速檢測。
【發明內容】
[0005]本發明解決的技術問題在于提供了一種手性AgOAu核殼納米粒子組裝體并將其應用于循環腫瘤細胞的檢測。
[0006]本發明的原理和技術方案:
[0007]AgOAu核殼納米粒子組裝體在圓二色譜400nm?580nm區間內表現出穩定且明顯的手性分裂等離子信號。循環腫瘤細胞相比于正常細胞HER2過度表達，利用HER2適配體修飾的手性AgOAu核殼納米粒子組裝體來實現對循環腫瘤細胞的特異性識別。
[0008]本發明的具體工藝步驟:
[0009]I) AgOAu核殼納米粒子的制備:
[0010]取已合成的銀納米粒子離心濃縮后，在室溫攪拌條件下將該銀納米粒子溶液加入到聚乙烯吡咯烷酮溶液中，之后向其中加入抗壞血酸溶液，再調節溶液的pH，最后加入氯金酸溶液，攪拌反應一段時間后得到AgOAu核殼納米粒子，將其離心后重溶于超純水中備用。[0011 ] 所述銀納米粒子的粒徑為12±3nm;
[0012]所述銀納米粒子濃縮的倍數為10倍；
[0013]所述聚乙烯吡咯烷酮(PVP)溶液的濃度為I % ;
[0014]所述抗壞血酸和氯金酸溶液的濃度比為1000:1;
[0015]所述銀納米粒子、聚乙烯吡咯烷酮和抗壞血酸溶液的體積比為I:10:1;
[0016]所述混合溶液的pH調節到9.5;
[0017]所述氯金酸溶液的加入速度為lOOyL/min;
[0018]所述反應時間為I小時。
[0019]2)HER2適配體修飾的手性AgOAu核殼納米粒子組裝體的制備:
[0020]在含有氯化鈉的磷酸緩沖溶液中加入AgOAu核殼納米粒子和HER2適配體和其互補DNA片段，培育一段時間后離心除去多余的適配體和DNA片段，得到AgOAu NPs-DNA復合物，再將其和巰基化的聚乙二醇反應，在磷酸緩沖溶液中雜交一段時間后離心重分散于超純水中。
[0021]所述氯化鈉濃度為20mmol/L;
[0022]所述AgOAu核殼納米粒子和HER2適配體的摩爾比為I: I;
[0023]所述AgOAu核殼納米粒子和適配體的互補DNA片段的摩爾比為1:1.5;
[0024]所述AgOAuNPs-DNA復合物和PEG-SH(MW1000)的摩爾比為l:10;
[0025]所述培育時間為12小時；
[0026]所述雜交時間為2小時。
[0027]3)HER2陽性乳腺癌SK-BR-3細胞的檢測:
[0028]SK-BR-3細胞在胎牛血清的培養基中培養，離心去除上清液后分散于磷酸緩沖溶液中，之后按一定比例不斷稀釋該溶液得到八組含不同細胞數的溶液。將AgOAu納米粒子組裝體在目標細胞的懸浮液中培育一段時間后離心去除沉淀物，再將包含解離AgOAu組裝體的上清液離心后重分散于磷酸緩沖溶液中。最后將該上清液濃縮一定倍數用圓二色譜進行檢測;手性等離子傳感器的特異性在多種細胞的混合溶液中進行。
[0029]所述胎牛血清的濃度為10%;
[0030]所述八組細胞溶液中細胞的個數分別為100000，50000，10000，5000，1000，500，100,50；
[0031]所述培育時間為I小時；
[0032]所述上清液濃縮倍數為I倍；
[0033]所述多種細胞的總個數為15000;
[0034]所述多種細胞分別為HBE(人體正常支氣管上皮細胞)，NL9980(人肺癌細胞系)，H1299(人肺腺癌細胞系)，293T(人胚腎細胞)，HMEC-1 (人微血管內皮細胞)，MDA-MB-231MDA-MB-415，MDA-MB-436(人乳腺癌細胞MPMCF 1A(人體正常乳腺細胞)。
[0035]4)實際生物樣品中循環腫瘤細胞的特異性識別檢測:
[0036]將不同數量的SK-BR-3細胞混入來自醫院健康女性獻血者濃縮了的一定體的積血液中，之后分別向其中加入等量的手性AgOAu納米粒子組裝體，培育一段時間后，離心多次消除基體干擾，取上清液用圓二色譜進行檢測。
[0037]所述的幾組SK-BR-3細胞的個數分別為80，200，800，2000，8000和20000 ；
[0038]所述的血液濃縮倍數為10倍；
[0039]所述的手性AgOAu納米粒子組裝體和血液的體積比為I: 10
[0040]所述的培育時間為I小時； [0041 ] 所述的離心次數彡3。
【附圖說明】
[0042]圖1銀納米組裝體和銀@金核殼結構納米組裝體的手性圖譜
[0043]圖2基于手性銀O金核殼結構納米組裝體的循環腫瘤細胞檢測手性圖譜
【具體實施方式】
[0044]實施例1:
[0045]l)Ag@Au核殼納米粒子的制備
[0046]依據之前已報道的方法合成粒徑為12±3nm的銀納米粒子，取ImL在16200g條件下離心10分鐘后濃縮10倍重溶于10yL超純水中。均勻攪拌條件下將這10yL銀納米粒子溶液加入到ImL濃度為I %的聚乙烯吡咯烷酮溶液中，再向其中加入100yL，濃度為10mM的抗壞血酸溶液。之后將溶液的pH調至9.5 ο用恒定流量栗以100yL/min的速度向該混合溶液中加Λ0.1mM的氯金酸溶液。在攪拌I小時后將最終的產物溶液離心并重溶于10yL超純水中。
[0047]2)HER2適配體修飾的手性AgOAu核殼納米粒子組裝體的制備
[0048]在含20mM氯化鈉的磷酸緩沖溶液中，制備的AgOAuNPs通過金巰共價結合修飾上0嫩<^8_11納米粒子和冊1?2適配體的摩爾比控制在1:1，AgOAu納米粒子與適配體的互補DNA片段的摩爾比控制在1:1.5。12小時后，復合物在5400g條件下離心10分鐘除去多余的適配體和DNA片段。AgOAu NPs-DNA復合物再進一步與聚乙二醇發生作用，二者摩爾比為1:10。功能化的AgOAu NPs在磷酸緩沖溶液中相互雜交2小時后離心重分散于超純水中。
[0049 ] 3) HER2陽性乳腺癌SK-BR-3細胞的檢測
[0050]SK-BR-3細胞在含10%胎牛血清的培養基中培養，在2000g條件下離心5分鐘去除上清液后分散于ImL PBS溶液。之后分別稀釋成八組包含細胞數分別為100000 ,50000，10000，5000,1000,500,100,50的溶液。室溫下將AgOAu納米組裝體在目標細胞的懸浮液中孵育I小時，再將該混合物2000g離心5分鐘后除去沉淀物。包含解離AgOAu納米組裝體的上清液需要離心后重分散于PBS中。該上清液濃縮I倍后用圓二色譜檢測。
[0051 ]手性等離子傳感器的特異性在15000個細胞中進行評估，包括HBE(人體正常支氣管上皮細胞)，NL9980(人肺癌細胞系)，H1299(人肺腺癌細胞系)，293T(人胚腎細胞)，HMEC-1(人微血管內皮細胞)，MDA-MB-231MDA-MB-415，MDA-MB-436(人乳腺癌細胞)和MCFlOA(人體正常乳腺細胞)。31(-81?-3，!11299，2931'，]\?^-]\?-231，]\?^-]\?-415，]\?^-]\?-436和]\07 1A細胞系來自于中科院細胞系;HBE(人體正常支氣管上皮細胞)，HMEC-1 (人微血管內皮細胞)來自于美國菌種保藏中心美國菌種保藏中心;NL9980(人肺癌細胞系)來自于四川省肺癌分子生物學省級重點實驗室。
[0052]4)實際生物樣品中循環腫瘤細胞的特異性識別檢測
[0053]不同數量的SK-BR-3細胞，包括80，200，800，2000，8000和20000，分別摻入來自于無錫第四醫院健康女性獻血者濃縮了 10倍的ImL血液中，在分別加入等量的10yL AgiAuNP組裝體，培育I小時后，分離的AgOAu NP組裝體需通過至少三次離心消除基體干擾。所有血液中SK-BR-3細胞的檢測均按上述實施例3步驟進行。
【主權項】
1.本發明為一種基于手性納米組裝體的循環腫瘤細胞檢測的新方法。其特征在于，循環腫瘤細胞相比于正常細胞HER2過度表達，利用HER2適配體修飾的手性AgOAu核殼納米粒子組裝體實現對循環腫瘤細胞的特異性識別。包括以下步驟:AgOAu核殼納米粒子的制備；HER2適配體修飾的手性AgOAu核殼納米粒子組裝體的制備;利用手性AgOAu核殼納米粒子組裝體與HER2接觸發生解離特異性識別并檢測HER2陽性乳腺癌SK-BR-3細胞;利用手性AgOAu核殼納米粒子組裝體對生物樣品中的循環腫瘤細胞進行特異性識別檢測。2.如權利I要求所述的一種基于手性納米組裝體的循環腫瘤細胞檢測的新方法，其中所述的AgOAu核殼納米粒子的制備方法如下: 取已合成的銀納米粒子離心濃縮后，在室溫攪拌條件下將該銀納米粒子溶液加入到聚乙烯吡咯烷酮溶液中，之后向其中加入抗壞血酸溶液，再調節溶液的PH，最后加入氯金酸溶液，攪拌反應一段時間后得到AgOAu核殼納米粒子，將其離心后重溶于超純水中備用。3.根據權利2要求所述的制備方法，其特征在于: 所述銀納米粒子的粒徑為12 ± 3nm； 所述銀納米粒子濃縮的倍數為10倍； 所述聚乙烯吡咯烷酮(PVP)溶液的濃度為I % ; 所述抗壞血酸和氯金酸溶液的濃度比為1000: I; 所述銀納米粒子、聚乙烯吡咯烷酮和抗壞血酸溶液的體積比為I:10:1; 所述混合溶液的PH調節到9.5; 所述氯金酸溶液的加入速度為100yL/min; 所述反應時間為I小時。4.如權利I要求所述的一種基于手性納米組裝體的循環腫瘤細胞檢測的新方法，其中所述的HER2適配體修飾的手性AgOAu核殼納米粒子組裝體的制備方法如下: 在含有氯化鈉的磷酸緩沖液中加入AgOAu核殼納米粒子和HER2適配體和其互補DNA片段，培育一段時間后離心除去多余的適配體和DNA片段，得到AgOAu NPs-DNA復合物，再將其和巰基化聚乙二醇反應，最后功能化的AgOAu NPs在磷酸緩沖液中相互雜交一段時間后離心重分散于超純水中。5.根據權利4要求所述的制備方法，其特征在于: 所述氯化鈉濃度為20mmol/L; 所述AgOAu核殼納米粒子和HER2適配體的摩爾比為1:1 ； 所述AgOAu核殼納米粒子和適配體的互補DNA片段的摩爾比為1:1.5; 所述AgOAu NPs-DNA復合物和巰基化聚乙二醇的摩爾比為I: 10; 所述培育時間為12小時； 所述雜交時間為2小時。6.如權利I要求所述的一種基于手性納米組裝體的循環腫瘤細胞檢測的新方法，其中所述的利用手性AgOAu核殼納米粒子組裝體檢測HER2陽性乳腺癌SK-BR-3細胞，其操作步驟如下: SK-BR-3細胞在胎牛血清的培養基中培養，離心去除上清液后分散于磷酸緩沖液中，之后按一定比例不斷稀釋該溶液得到八組含不同細胞數的溶液。將AgOAu納米粒子組裝體在目標細胞的懸浮液中培育一段時間后離心去除沉淀物，再將包含解離AgOAu納米組裝體的上清液離心后重分散于磷酸緩沖液中。最后將該上清液濃縮一定倍數用圓二色譜進行檢測;手性等離子傳感器的特異性在多種細胞的混合溶液中進行。7.根據權利6要求所述的檢測方法，其特征在于: 所述胎牛血清的濃度為10% ; 所述八組細胞溶液中細胞的個數分別為100000，50000，10000，5000,1000,500,100,50； 所述培育時間為I小時； 所述上清液濃縮倍數為I倍； 所述多種細胞的總個數為15000; 所述多種細胞分別為HBE(人體正常支氣管上皮細胞)，NL9980(人肺癌細胞系)，H1299(人肺腺癌細胞系)，293T(人胚腎細胞)，HMEC-1 (人微血管內皮細胞)，MDA-MB-23IMDA-MB-415，MDA-MB-436(人乳腺癌細胞MPMCF 1A(人體正常乳腺細胞)。8.如權利I要求所述的一種基于手性納米組裝體的循環腫瘤細胞檢測的新方法，其中所述的利用手性AgOAu核殼納米粒子組裝體對生物樣品中的循環腫瘤細胞進行特異性識別檢測，其操作步驟如下: 將不同數量的SK-BR-3細胞混入來自醫院健康女性獻血者濃縮了的一定體的積血液中，之后分別向其中加入等量的手性AgOAu納米粒子組裝體，培育一段時間后，離心多次消除基體干擾，取上清液用圓二色譜進行檢測。9.根據權利8要求所述的檢測方法，其特征在于: 所述的幾組SK-BR-3細胞的個數分別為80，200，800，2000，8000和20000 ； 所述的血液濃縮倍數為10倍； 所述的手性AgOAu納米粒子組裝體和血液的體積比為I: 10 所述的培育時間為I小時； 所述的離心次數多3。
【文檔編號】G01N21/31GK106053810SQ201610305925
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年5月10日
【發明人】趙媛, 楊亞鑫, 宋啟軍, 羅耀東
【申請人】江南大學