一種牛源多殺性巴氏桿菌抗體的間接elisa檢測試劑盒及其檢測方法
【專利摘要】本發明公開一種牛源多殺性巴氏桿菌抗體的間接ELISA檢測試劑盒及其檢測方法,所述試劑盒包括用牛源多殺性巴氏桿菌特異性蛋白0230包被的固相載體、HRP標記的IgG酶標二抗、標準陽性對照血清、標準陰性對照血清、樣品稀釋液、濃縮洗滌液、顯色液和終止液;所述方法采用所述試劑盒進行檢測,將待檢測血清樣品與固相載體上包被的牛源多殺性巴氏桿菌特異性蛋白0230接觸和保溫孵育,用HRP標記的IgG酶標二抗特異地捕捉結合于0230蛋白抗原上的特異抗體,并用顯色劑顯色,從而測定得到待檢測血清樣品中針對0230蛋白的抗體水平。本發明檢測試劑盒及檢測方法具有特異性好、敏感性高、重復性好等特點。
【專利說明】
一種牛源多殺性巴氏桿菌抗體的間接EL ISA檢測試劑盒及其 檢測方法
技術領域
[0001]本發明涉及獸醫生物制品領域,更具體的說是涉及基于特異蛋白的一種牛源多殺 性巴氏桿菌抗體的間接ELISA檢測試劑盒及其檢測方法。
【背景技術】
[0002] 牛多殺性巴氏桿菌(Bovine Pastet/i-eDa皿/_/tocic/a,Pm)是一種引起牛發生出血 性敗血癥或呼吸系統疾病的重要病原菌。多殺性巴氏桿菌根據其菌體莢膜抗原的不同,可 分為A、B、D、E和F 5種莢膜血清型,其中對牛致病的莢膜血清型有A、B、E及F型;A和F型主要 導致牛呼吸系統疾病,B和E型主要導致牛出血性敗血癥。以往我國流行的牛多殺性巴氏桿 菌病主要由莢膜血清B型引起,自2008年以來,A型多殺性巴氏桿菌病在我國許多省市相繼 流行,給養牛業造成了重大經濟損失。目前,國內外針對疾病診斷和疫苗效力的檢測方法主 要有病原分離鑒定、PCR檢測技術、瓊脂擴散試驗、間接血凝試驗以及ELISA試驗等。PCR檢測 技術主要用于實驗室研究,瓊脂擴散試驗和間接血凝試驗敏感性較低,ELISA檢測方法具 有靈敏性高和易批量檢測等優點。
[0003] 對于疫病診斷與疫苗效力檢測,其ELISA抗體檢測試劑盒具有一定差異,用于疫病 診斷的ELI SA抗體檢測試劑盒要求祀標抗原特異(最好能區分感染抗體與免疫抗體,如不能 區分則只能用于未免疫動物疫病診斷);而用于疫苗效力檢驗的ELISA抗體檢測試劑盒則要 求所用靶標抗原為特異性保護性抗原,所檢測抗體水平要與其免疫保護性呈現正相關性, 傳統疫苗中不是所有的抗原成分免疫產生的抗體水平都會與該疫苗的保護性呈現正相關, 因此用于疫苗效力檢測的ELISA抗體檢測試劑盒的抗原選擇就尤為重要。
[0004] 目前我國尚無用于牛多殺性巴氏桿菌病血清流行病學調查和疫苗免疫效果評價 的ELISA抗體檢測試劑盒。因此,尋找特異性抗原靶標,研制一種快速、敏感、特異的ELISA抗 體檢測試劑盒,以用于疫苗免疫效果評價和疫病血清流行病學調查,對于有效防控牛多殺 性巴氏桿菌病具有重要意義。
【發明內容】
[0005] 本發明目的在于解決現有技術的缺點和不足,針對目前國內沒有商品化針對牛源 多殺性巴氏桿菌抗體水平進行檢測的檢測試劑盒的技術問題,提供一種能有效評價牛源多 殺性巴氏桿菌疫苗免疫效果及未免疫牛群多殺性巴氏桿菌感染血清流行病學調查的牛源 多殺性巴氏桿菌抗體的間接ELISA檢測試劑盒及其檢測方法,該試劑盒具有快速、特異、敏 感、穩定等特點。
[0006] 本發明的目的通過以下技術方案實現:一種牛源多殺性巴氏桿菌抗體的間接 ELISA檢測試劑盒,包括用牛源多殺性巴氏桿菌特異性蛋白0230包被的固相載體、HRP標記 的I gG酶標二抗、標準陽性對照血清、標準陰性對照血清、樣品稀釋液、濃縮洗滌液、顯色液 和終止液;其中,所述牛源多殺性巴氏桿菌特異蛋白0230的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所 示,氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示;所述陽性對照血清為犢牛感染牛源多殺性巴氏桿菌后 的血清,陰性對照血清為未免疫和未感染多殺性巴氏桿菌的犢牛血清。
[0007] 一種牛源多殺性巴氏桿菌抗體的間接ELISA檢測方法,采用上述牛源多殺性巴氏 桿菌抗體的間接ELISA檢測試劑盒進行檢測,將待檢測血清樣品與固相載體上包被的牛源 多殺性巴氏桿菌特異性蛋白0230接觸和保溫孵育,用HRP標記的IgG酶標二抗特異地捕捉結 合于0230蛋白抗原上的特異抗體,并用顯色劑顯色,從而測定得到待檢測血清樣品中針對 0230蛋白的抗體水平。
[0008] 相比現有技術,本發明具有如下優點: 1、為了能夠使本發明試劑盒能夠全面對牛源A、B和F型多殺性巴氏桿菌的抗體進行檢 測,本發明從A型、B型及F型共有的200多個基因中篩選出32個候選基因,以這些基因翻譯成 蛋白的氨基酸序列調入NCBI數據庫進行比較分析及抗原表位分析,根據其比對結果,綜合 分析其總得分值、覆蓋率、同源性及抗原表位結果,篩選出0230基因,對篩選出的牛源多殺 性巴氏桿菌0230的基因序列經克隆測序分析,顯示其在牛源多殺性巴氏桿菌常見的不同血 清型菌株中同源性高,保守性好,對其蛋白氨基酸序列進行分析,結果顯示其在牛多殺性巴 氏桿菌菌株基因組中具有高度同源性、保守性和通用性,能夠對牛源A、B和F型多殺性巴氏 桿菌具有優異的特異性和保守性,能夠用于牛源A、B和F型多殺性巴氏桿菌抗體的檢測抗 原。
[0009] 2、本發明所用的包被抗原牛多殺性巴氏桿菌0230蛋白可通過基因工程克隆表達 獲得,生物安全性高;本發明所用抗原牛多殺性巴氏桿菌0230蛋白本身具有免疫保護作用, 該蛋白產生的抗體持續時間較長,用該蛋白建立的ELISA試劑盒所檢出的抗體水平與牛源 多殺性巴氏桿菌疫苗免疫保護力及該蛋白免疫保護力呈現線性正相關,可用于牛源多殺性 巴氏桿菌疫苗免疫抗體水平監測、疫苗免疫效果評價及未免疫牛群多殺性巴氏桿菌感染血 清流行病學調查,具有廣闊的應用前景。
[0010] 3、本發明采用篩選出的0230特異性蛋白包被固相載體,制備間接ELI SA檢測試劑 盒,采用制得的檢測試劑盒對牛源多殺性巴士桿菌抗體進行檢測,該方法的檢測原理為:向 包被了0230蛋白的固相載體中加入待檢測的牛血清樣品,如果血清中含有牛源多殺性巴士 桿菌特異性抗體時,抗體會與固相載體上的0230特異性蛋白抗原結合,然后加入能與特異 性抗體鍵合的HRP標記兔抗牛IgG酶標二抗,再加入TMB顯色液,在HRP的催化作用下TMB顯 色,顏色反應的強度與血清樣品中牛多殺性巴氏桿菌抗體含量呈正相關,可以通過酶標儀 讀數顯示,判斷待檢測樣品中抗體含量水平,來判斷抗體的保護效果。
[0011] 4、采用本發明方法對牛源多殺性巴士桿菌抗體進行檢測,檢測步驟方便操作,檢 測時間短,本發明方法檢出限低、檢測靈敏度高,對A型、B型、F型牛源多殺性巴氏桿菌均具 有良好的特異性,且穩定性能好,方法重復性良好,檢測結果真實可靠,誤判率低。
【附圖說明】
[0012] 圖1為0230基因表達產物的SDS-PAGE檢測圖,其中:M:蛋白Marker;a:誘導產物(方 框標記處為目的基因表達的融合蛋白)。
[0013] 圖2為純化的重組蛋白0230 SDS-PAGE檢測圖;其中:M:蛋白Marker;a:純化的融合 蛋白。
[0014] 圖3為純化的重組蛋白0230 Western-blot檢測圖;其中:M:蛋白Marker;a:純化的 融合蛋白。
[0015] 圖4為免疫攻毒后小鼠存活情況圖。
[0016] 圖5為抗體水平與A型巴氏桿菌攻毒保護關系圖。
[0017]圖6為抗體水平與B型巴氏桿菌攻毒保護關系圖。
[0018]圖7為抗體水平與F型巴氏桿菌攻毒保護關系圖。
[0019] 圖8為滅活疫苗免疫不同時間試驗兔攻毒生存曲線圖。
[0020] 圖9為滅活疫苗免疫不同時間試驗兔抗體ELISA檢測結果圖。
[0021]圖10為抗體水平與攻毒保護關系圖。
【具體實施方式】
[0022]下面結合具體實施例和說明書附圖對本發明作進一步詳細說明。本實施案例在以 本發明技術為前提下進行實施,現給出詳細的實施方式和具體的操作過程來說明本發明具 有創造性,但本發明的保護范圍不限于以下的實施例。
[0023]下述實施例中牛源多殺性巴氏桿菌A型CQ2菌株及F型菌株:由西南大學動物科技 學院預防獸醫學實驗室從患有呼吸道綜合征的病死牛肺中分離鑒定保藏。牛源多殺性巴氏 桿菌B型菌株(CVCC450):購自中國獸醫藥品監察所。其他試劑如無特殊說明,即為普通市售 產品。
[0024]實施例1牛源多殺性巴氏桿菌特異性抗原蛋白的篩選: 對牛源多殺性巴氏桿菌A型、B型及F型菌株的全基因組序列進行測序,通過對本實驗室 測定的牛源多殺性巴氏桿菌A型、B型及F型菌株全基因組序列比較分析,根據預測具有信號 肽的得分值,從A型、B型及F型共有的200多個基因中篩選出32個候選基因,以這些基因翻譯 成蛋白的氨基酸序列調入NCBI數據庫進行比較分析(http: //blast.ncbi .nlm.nih. gov)及 抗原表位分析(http: //www ? cbs ? dtu ? dk/services/BepiPred/),根據其比對結果,綜合分 析其總得分值、覆蓋率、同源性及抗原表位結果,篩選出0230基因;進一步對0230基因及其 編碼蛋白進行生物信息學和PCR分析,證明該基因及其編碼蛋白具有多殺性巴氏桿菌屬特 異性,在牛源A、B和F型多殺性巴氏桿菌中均存在,具有較好的特異性和保守性,可以作為對 牛源多殺性巴士桿菌抗體進行檢測的間接ELISA試劑盒中的抗原。
[0025]實施例2多殺性巴氏桿菌0230基因的克隆表達及表達蛋白免疫保護性測定: 根據牛源多殺性巴氏桿菌莢膜血清A型菌株CQ2基因組序列,設計0230基因的擴增引 物:上游引物5'_gagtca g a a 11 c gatgtgattgcagataattt ;下游弓| 物5 ' -gagtcactcgaggaacataagaagatgcccat。上游引物中劃線段為RI酶切位點,下游引物中 劃線段為〇1酶切位點。
[0026]提取牛源多殺性巴氏桿菌莢膜血清A型菌株CQ2的基因組DNA,并以此為模板,采用 上述設計的引物PCR擴增0230基因,擴增條件為94°C 3min; 94 °C 30s,60°C 30s,72 °C 1 min,35個循環;72 °C延伸10 min,4°C保存;將PCR產物經及?o RI酶和處ol酶酶切回收,將 酶切回收產物與原核重組表達載體pET30a連接,獲得0230基因的重組表達質粒pET30a-Pm0230,將該重組質粒轉化大腸桿菌f . coi2BL21(DE3)感受態細胞進行表達,當重組菌液 0D600~0.5時,加入IPTG(500 mmol/L)至在重組菌液中的終濃度為0.1 mmol/L,于37°C、 220 r/min的條件下誘導3 h,獲得表達產物,采用SDS-PAGE檢測重組蛋白的表達,檢測結果 如圖1所示,得到了與預期大小相當的重組蛋白(圖1)。
[0027] 采用與上述相同的方法對該重組菌進行大量誘導表達,獲得大量的重組蛋白,通 過Ni-NTA Superflow Cartridges His親和層析柱(簡稱Ni柱)純化并使用透析除鹽后,采 用SDS-PAGE檢測純化產物,檢測結果如圖2所示,從圖2可以看出得到了與該蛋白大小相符 的純化產物。
[0028]采用感染牛源多殺性巴氏桿菌A型菌株CQ2的牛血清作為一抗,以Western blot方 法檢測上述方法得到的純化蛋白,結果發現該純化蛋白能夠與牛血清發生免疫印跡反應 (圖3 ),表明感染多殺性巴氏桿菌A型菌株CQ2的牛血清中含有0230蛋白的抗體。
[0029]以純化的重組蛋白0230制備抗原免疫昆明小鼠,2免后分別攻毒牛源多殺性巴氏 桿菌A型、B型及F型菌株的各自的4倍半數致死劑量,觀察1周,記錄各自的小鼠存活率,繪制 生存曲線(圖4),從圖4可以看出該蛋白對牛源多殺性巴氏桿菌A型、B型和F型菌株的保護率 分別為80%、70%和60%,該結果同時提示B型及F型菌株也表達了該蛋白。
[0030] 實施例3牛源多殺性巴氏桿菌間接ELISA試劑盒 試劑盒的組分包括用純化的牛源多殺性巴氏桿菌特異性蛋白0230包被的固相載體,標 準陽性對照血清,標準陰性對照血清,HRP標記的兔抗牛IgG酶標二抗,顯色液,終止液,濃縮 洗滌液、樣品稀釋液和血清稀釋板。所述牛源多殺性巴氏桿菌特異蛋白0230的核苷酸序列 如SEQ ID NO. 1所示,氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0031] 其中,固相載體為96孔聚苯乙烯酶標板;所述牛源多殺性巴氏桿菌特異蛋白0230 為采用上述實施例的方法大腸桿菌重組表達后純化的產物;用純化的牛源多殺性巴氏桿菌 特異性蛋白0230包被固相載體是指采用濃度為10 yg/mL的純化重組抗原蛋白0230于4°C包 被固相載體過夜,而后用1 wt.%卵清蛋白37°C封閉1.5h;陽性對照血清為犢牛感染牛源多 殺性巴氏桿菌后的血清,陰性對照血清為未免疫和未感染多殺性巴氏桿菌的犢牛血清;顯 色液為TMB,反應終止液為2 mol/U^H2S〇4,濃縮洗滌液為25倍TOST洗滌液,樣品稀釋液是 含0.5%85厶、0.05%了¥661120、5臟〇1/1£0了厶、0.35 111〇1/1恥(:1、?117.2的?85液。
[0032] 具體地,本實施例設計了如下規格的試劑盒商品: 1、用純化的牛源多殺性巴氏桿菌特異性蛋白0230包被板:96孔/板X 1。
[0033] 2、標準陽性對照血清:30 yL/支XI支。
[0034] 3、標準陰性對照血清:30 yL /支XI支。
[0035] 4、樣品稀釋液:50 mL/瓶X 1。
[0036] 5、HRP標記的兔抗牛IgG酶標二抗:50此/支XI支。臨用前以樣品稀釋液稀釋按 照1:500的體積比稀釋。
[0037] 6、25\?831'濃縮洗滌液:3〇11117瓶\1瓶。
[0038] 7、終止液:10mL/瓶XI瓶(2 mol/L H2S04)。
[0039] 8、TMB顯色液:20 mL/瓶 XI瓶。
[0040] 9、血清稀釋板:96孔/板XI塊 實施例4檢測方法 采用上述檢測試劑盒進行檢測,檢測時需要使用1)酶標儀(建議參考儀器使用說明提 前預熱);2)微量加液器及吸頭,EP管;3)蒸餾水或去離子水。
[0041] 采用該試劑盒進行檢測的原理為:酶標板上包被了牛源多殺性巴氏桿菌特異性抗 原0230蛋白,加入待測血清樣品;如果血清中含有特異性抗體,將與酶標板上的特異性抗原 結合;然后加入能與抗體結合的用HRP標記的兔抗牛IgG酶標二抗,再加入TMB顯色液顯色, 顏色反應的強度與血清樣品中牛多殺性巴氏桿菌抗體含量呈正相關,可以通過酶標儀讀數 顯不〇
[0042] 具體檢測操作步驟如下: 1)實驗開始前,各試劑均應平衡至室溫;對待檢測的血清樣品用樣品稀釋液按照1:100 的體積比進行稀釋,以使稀釋后的樣品檢測的吸光度值符合試劑盒的檢測范圍,計算時再 乘以相應的稀釋倍數;陽性標準血清和陰性標準血清也用樣品稀釋液按照1:100的體積比 進行稀釋。
[0043] 2)加樣:在96孔板固相載體中分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加100 y L樣品稀釋液,陽性標準孔加100此稀釋后的陽性對照血清,陰性標準孔加100此稀釋后的 陰性對照血清,待檢測樣品孔加100此稀釋后的待測樣品,加樣時注意不要使孔中有氣泡, 將各溶液加于酶標板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻,酶標板加上蓋或覆膜,于37 °(:孵育反應90分鐘。為保證實驗結果有效性,每次實驗請使用新的標準品溶液。
[0044] 3)洗滌:步驟2)孵育結束后,棄去并甩干孔內液體,向甩干后的每孔中加洗滌液 350 iiL浸泡4-5分鐘,甩干(也可輕拍將孔內液體拍干)后再進行第二次洗滌,總共洗滌5次。 [0045] 4)HRP標記的兔抗牛IgG酶標二抗:向步驟3)洗滌后的每孔中加稀釋過的酶標二抗 (酶標二抗與樣品稀釋液按照1:500的體積比稀釋,在使用前十分鐘內稀釋)100yL,37°C孵 育30分鐘。
[0046] 5)洗滌:步驟4)孵育后棄去并甩干孔內液體,同步驟3)方法洗滌孔5次。
[0047] 6)顯色:依序向每孔中加入顯色液100 yL,37°C避光反應10分鐘。
[0048] 7)終止反應:依序每孔加終止液100 yL,終止反應,此時藍色立轉黃色。終止液的 加入順序應盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結果的準確性,底物反應時間到 后應盡快加入終止液。
[0049] 8)測定:加終止液后立即進行檢測,用酶標儀在450nm波長依序測量各孔的光密度 (0D值)。測定應在加終止液后15分鐘以內進行。
[0050] 9)結果判定:陽性對照血清45Qnm值大于1.0,陰性對照血清P 45Qnm值小于0.30時, 實驗結果判定為合格;反之,為不合格,需重新檢測;陰陽性臨界值為0.388,待測樣品的 P 值大于0.388時為陽性,小于或等于0.388時為陰性。
[0051]實施例5蛋白0230免疫抗體水平與攻毒保護之間的相關性測定: 以上述重組蛋白0230制備的抗原免疫小鼠,每組10只,免疫12組,對照3組,共15組,分 別在免疫5(1、10(1、15(1、21(1尾靜脈采血分離血清。
[0052]采用本發明檢測試劑盒和方法對分離得到的血清中免疫抗體水平進行測定。結果 表明(表1),該蛋白免疫抗體水平隨著免疫時間的延長而升高。每次采血后分別以牛源多殺 性巴氏桿菌A型、B型及F型菌株進行攻毒保護性試驗,攻毒后觀察7天,記錄小鼠存活率,構 建了免疫抗體水平與不同血清型牛源多殺性巴氏桿菌攻毒保護率相關曲線圖(圖5、6、7), 結果表明,基于0230蛋白構建的ELISA試劑盒所測定的該蛋白免疫抗體水平高低與其免疫 保護呈正相關。
[0053] 表1小鼠血清0230蛋白抗體ELISA槍測結果(0D450nm倌)
實施例6滅活疫苗免疫抗體水平與攻毒保護之間的相關性測定: 按照滅活菌苗制定標準,制備多殺性巴氏桿菌PmCQ2菌株滅活疫苗。選擇30只健康家 兔,隨機分為6組,每組5只(1.5kg/只)。其中1組試驗兔注射lmL生理鹽水作為陰性對照,其 余5組按疫苗最佳免疫劑量(5.6 X 109CFU)依次免疫,第一次免疫第1組,一周之后免疫第2 組,以此類推,第5周時免疫第5組,第6周分別對每組試驗兔進行耳緣靜脈采血,并肌肉接種 最小致死量(1.5 X 109CFU)的PmCQ2,至此使得每組試驗兔分別在免疫后的第35d、第28d、第 21d、第14d和第7d受到攻毒感染。攻毒后,飼養觀察20d,記錄試驗兔存活情況。耳緣靜脈采 血后,分離血清,采用基于重組蛋白0230所建立的ELISA方法測定血清抗體效價,研究免疫 抗體水平與攻毒保護之間的相關性。
[0054] 結果表明,以最佳免疫劑量免疫7(1、14(1、21(1、28(1、35(1后攻毒,對照組家兔3天內全 部死亡,免疫7d組在第3d死亡2只,在第4、lld各死亡一只,存活率為20%;免疫14d組,在第3、 5d各死亡一只,存活率為60%;免疫21d組僅在第4d死亡一只,存活率為80%;免疫28d、35d組 試驗兔全部健活,存活率均為100%(圖8)。
[0055] 免疫7d、14d、21d、28d、35d組試驗兔抗體水平平均值分別為0.762、1.092、 1.290、1.484、1.530,且各試驗組抗體水平隨免疫時間的延長而逐漸增加(圖9);其攻毒保 護率依次為 20%、60%、80%、100%、100%(圖10)。
[0056]從以上結果可以看出,測定多殺性巴氏桿菌特異蛋白0230抗體水平,能夠反映多 殺性巴氏桿菌所制備菌苗免疫動物后其抗體產生的動態變化,同時抗體水平與其保護率呈 現正相關性。
[0057]實施例7特異性、穩定性和靈敏度檢測 對本發明試劑盒和檢測方法的特異性、穩定性和靈敏度進行檢測驗證: 特異性試驗表明,包被重組抗原0230與牛支原體、牛病毒性腹瀉、牛/羊口蹄疫陽性血 清均不發生交叉反應,而與A型、B型、F型牛源多殺性巴氏桿菌陽性血清均呈陽性反應。結果 顯示,以0230重組蛋白構建的間接ELISA方法有較好的特異性(表2)。
[0058] 表2特異性檢測結果
穩定性試驗表明,同批次包被板檢測10份血清0D450nm值變異系數介于2.15%~5.18%之 間,不同批次包被板檢測10份血清0D450nm值變異系數介于5.18%~9.76%之間,說明該方法 重復性良好。
[0059] 隨機選取陽性樣本,對陽性樣本進行倍比稀釋后,用建立的ELISA方法檢測,結果 顯示,當血清以1:1280倍的體積比稀釋后,仍可以檢測到陽性,說明此該方法具有良好的靈 敏性(表3)。
[0060] 表3靈敏性試驗
最后說明的是,以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制,盡管參照較佳實 施例對本發明進行了詳細說明,本領域的普通技術人員應當理解,可以對本發明的技術方 案進行修改或者等同替換,而不脫離本發明技術方案的宗旨和范圍,其均應涵蓋在本發明 的權利要求范圍當中。
【主權項】
1. 一種牛源多殺性巴氏桿菌抗體的間接ELISA檢測試劑盒,其特征在于,包括用牛源多 殺性巴氏桿菌特異性蛋白0230包被的固相載體、HRP標記的IgG酶標二抗、標準陽性對照血 清、標準陰性對照血清、樣品稀釋液、濃縮洗滌液、顯色液和終止液;其中,所述牛源多殺性 巴氏桿菌特異蛋白0230的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示,氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所 示;所述標準陽性對照血清為犢牛感染牛源多殺性巴氏桿菌后的血清,標準陰性對照血清 為未免疫和未感染多殺性巴氏桿菌的犢牛血清。2. 根據權利要求1牛源多殺性巴氏桿菌抗體的間接ELI SA檢測試劑盒,其特征在于,所 述牛源多殺性巴氏桿菌特異性蛋白0230采用如下方法獲得:以牛源多殺性巴氏桿菌莢膜血 清A型CQ2菌株的DNA作為模板,利用設計合成的特異性引物進行PCR擴增,回收PCR擴增后的 目的基因片段,將所述目的基因片段與原核表達載體pET30a連接,構建重組表達質粒 pET30a-Pm0230,將重組表達質粒pET30a-Pm0230轉化入大腸桿菌i coii BL2UDE3)感受 態細胞,并采用異丙基硫代半乳糖苷誘導表達,將獲得的表達產物經過His標簽純化柱純化 和透析除鹽處理,獲得所述牛源多殺性巴氏桿菌特異性蛋白0230;所述特異性引物的上游 引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示,下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。3. 根據權利要求1所述牛源多殺性巴氏桿菌抗體的間接ELISA檢測試劑盒,其特征在 于,所述樣品稀釋液為含0.5 wt·% BSA、0.05 wt·% 吐溫20、5 mmol/L EDTA和0.35 mol/L NaCl的PBS緩沖液,所述樣品稀釋液的pH為7.2。4. 根據權利要求1所述牛源多殺性巴氏桿菌抗體的間接E LIS A檢測試劑盒,其特征在 于,所述濃縮洗滌液為25 XPBST洗滌液。5. 根據權利要求1所述牛源多殺性巴氏桿菌抗體的間接ELISA檢測試劑盒,其特征在 于,所述顯色液為TMB,反應終止液為2 mol/L的硫酸溶液。6. 根據權利要求1所述牛源多殺性巴氏桿菌抗體的間接ELISA檢測試劑盒,其特征在 于,所述用牛源多殺性巴氏桿菌特異性蛋白0230包被的固相載體采用如下方法制得:向固 相載體中加入濃度為10 yg/mL的牛源多殺性巴氏桿菌特異性蛋白0230溶液,于4 °C包被過 夜后,棄去所述牛源多殺性巴氏桿菌特異性蛋白0230溶液,向固相載體中加入質量濃度為1 %的卵清蛋白溶液,于37 °C下封閉1.5 h。7. 根據權利要求1所述牛源多殺性巴氏桿菌抗體的間接ELISA檢測試劑盒,其特征在 于,所述固相載體為96孔聚苯乙烯酶標板。8. 根據權利要求1所述牛源多殺性巴氏桿菌抗體的間接E LIS A檢測試劑盒,其特征在 于,所述HRP標記的IgG酶標二抗為HRP標記的兔抗牛IgG酶標二抗。9. 一種牛源多殺性巴氏桿菌抗體的間接ELISA檢測方法,其特征在于,采用權利要求1~ 8任一所述牛源多殺性巴氏桿菌抗體的間接ELISA檢測試劑盒進行檢測,將待檢測血清樣品 與固相載體上包被的牛源多殺性巴氏桿菌特異性蛋白0230接觸和保溫孵育,用HRP標記的 IgG酶標二抗特異地捕捉結合于0230蛋白抗原上的特異抗體,并用顯色劑顯色,從而測定得 到待檢測血清樣品中針對0230蛋白的抗體水平。10. 根據權利要求9所述牛源多殺性巴氏桿菌抗體的間接ELISA檢測方法,其特征在于, 具體包括如下步驟: 1)將待檢測血清樣品、標準陽性對照血清和標準陰性對照血清分別與樣品稀釋液按照 1:100的體積比進行稀釋,獲得待檢測血清樣品稀釋液、陽性對照血清稀釋液和陰性對照血 清稀釋液; 2) 分別設置空白組、陽性標準組、陰性標準組和待檢測血清樣品組,所述空白組向用牛 源多殺性巴氏桿菌特異性蛋白0230包被的固相載體中加入100 yL樣品稀釋液,陽性標準組 向用牛源多殺性巴氏桿菌特異性蛋白0230包被的固相載體中加入100 yL所述陽性對照血 清稀釋液,陰性標準組向用牛源多殺性巴氏桿菌特異性蛋白0230包被的固相載體中加入 100此所述陰性對照血清稀釋液,待檢測血清樣品組向用牛源多殺性巴氏桿菌特異性蛋白 0230包被的固相載體中加入100 yL所述待檢測血清樣品稀釋液,將加樣后的空白組、陽性 標準組、陰性標準組和待檢測血清樣品組于37 °C孵育反應90分鐘; 3) 步驟2)孵育結束后,棄去空白組、陽性標準組、陰性標準組和待檢測血清樣品組固相 載體中的液體,用濃縮洗滌液分別洗滌各組固相載體若干次; 4) 將HRP標記的IgG酶標二抗與樣品稀釋液按照1:500的體積比進行稀釋,獲得酶標二 抗稀釋液,分別向步驟3)洗滌后的空白組、陽性標準組、陰性標準組和待檢測血清樣品組固 相載體中加入所述酶標二抗稀釋液100 yL,于37°C孵育30分鐘; 5) 步驟4)孵育后,棄去各組固相載體中的液體,用濃縮洗滌液分別洗滌各組固相載體 若干次; 6) 分別向步驟5)洗滌后的各組固相載體中加入100 yL顯色液,于37 °C下避光顯色反 應10~15分鐘; 7) 步驟6)顯色反應結束后,分別向各組固相載體中加入終止液100 yL終止反應,并測 定空白組、陽性標準組、陰性標準組和待檢測血清樣品組中液體在Ρ450Γ?處的吸光度值, 當陽性標準組P4 5Qnm值大于1.0,陰性標準組P45Qnm值小于0.30時,待檢測血清樣品組數 據有效,待檢測血清樣品組P4 5Qnm值大于0.388時判斷為陽性,即待檢測血清樣品中含有 牛源多殺性巴氏桿菌抗體,待檢測血清樣品組P4 5Qnm值小于或等于0.388時判斷為陰性, 即待檢測血清樣品中不含有牛源多殺性巴氏桿菌抗體。
【文檔編號】G01N33/569GK106053807SQ201610596739
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年7月26日 公開號201610596739.2, CN 106053807 A, CN 106053807A, CN 201610596739, CN-A-106053807, CN106053807 A, CN106053807A, CN201610596739, CN201610596739.2
【發明人】彭遠義, 李能章, 程蓉, 李杜, 趙益萍, 劉舒萍
【申請人】西南大學