一種肺炎支原體抗體雙標記納米時間分辨熒光免疫層析定量試紙及其制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種肺炎支原體抗體雙標記納米時間分辨熒光免疫層析試紙及其制備方法，試紙包括粘性底層、樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜和吸水紙；在硝酸纖維素膜上相間隔依次設置肺炎支原體抗原的檢測帶以及兔抗鼠多克隆抗體的質控帶，結合墊表面噴涂標記鼠抗人IgG抗體的包裹銪離子的納米微球與標記鼠抗人IgM抗體的包裹釤離子的納米微球。本發明能夠在一個時間分辨熒光免疫層析試紙上同時進行肺炎支原體IgG和IgM抗體的定量檢測，可以保證同一樣品液體中的肺炎支原體IgG和IgM抗體的檢測結果精確度高、誤差小，為臨床使用提供了極大便利。
【專利說明】
一種肺炎支原體抗體雙標記納米時間分辨熒光免疫層析定量 試紙及其制備方法
技術領域
[0001] 本發明涉及一種肺炎支原體抗體雙標記納米時間分辨熒光免疫層析試紙及其制 備方法，屬于免疫檢測技術領域。
【背景技術】
[0002] 支原體肺炎（my cop lasmal pneumon ia，MP)是由肺炎支原體（Mycop lasma pneumoniae，MP)與宿主呼吸道粘膜上皮細胞的神經氨酸受體粘結，同時釋放有毒代謝產物 致病，引起的肺炎。MP起病緩慢，有發熱、陣發性刺激性咳嗽，少量黏液性或黏液膿性痰(偶 有血痰），肺部體征多不明顯，但易引起肺外多系統受累，也可威脅生命或死亡。MP好發于兒 童或青少年，血清流行病學研究顯示我國社區獲得性肺炎（communi ty-acquired pneumonia，CAP)患者中20 ? 7 %-38 ? 9%由MP引起，居成人社區獲得性肺炎病原體的首位。MP 除導致呼吸道癥狀外，20 %-25 %的病例可出現腦膜炎、心肌炎、溶血性貧血、血小板減少性 紫癜等肺外表現。及時有效的診斷可有效控制MP感染病情的加重，降低死亡率。
[0003] 肺炎支原體的診斷方法主要依靠分離培養和血清學試驗。血清學檢測在MP感染實 驗室診斷中占重要地位，以被動凝集法、免疫層析試驗（immunochromatography assay， ICA)和酶聯免疫分析法(Enzyme immunoassay，ELISA)應用最為廣泛。被動凝集法主要檢測 混合的MP-IgM和MP-IgG，可以半定量;相較于凝集法，ELISA的優勢是可以分型檢測特異性 IgM、IgG等抗體，而這些亞型與感染的病程相關。MP-IgM陽性可作為早期或急性感染的診斷 指標。一般在感染約7天后可被檢測到，10-30天后達到峰值，76.5%的患者2周后降到無法 檢測到的程度。MP-IgG常發病2周后出現，是MP感染最可靠的指標。雙份血清4倍以上滴度上 升提示近期感染，否則為既往感染。雖然單次測定MP-IgM陽性即可判定為MP新近感染，但是 陰性卻不能排除感染。因此臨床強調配對同時檢測MP-IgM和MP--IgG對評價MP感染狀況更 有意義，同時也強調了對微量、更加快速、準確可靠、高靈敏、寬量程的定量診斷技術的需 求。
[0004] 免疫層析試驗（immunochromatography assay，ICA)是一種快速診斷技術，其原理 是將特異的抗原(或抗體)先固定于硝酸纖維素膜的某一區帶，在硝酸纖維素膜的一端加入 樣品后，由于毛細管虹吸作用，樣品將沿著該膜向前移動，當移動至固定有抗原(或抗體)的 區域時，樣品中相應的抗體(或抗原）即與該抗原(或抗體)發生特異性結合，若用免疫膠體 金或免疫酶染色可使該區域顯示一定的顏色，從而實現特異性的免疫診斷。ICA的特點是可 進行單份標本檢測、簡便、快速(5-15分鐘可出結果）、標本用量少、不需任何儀器設備，因 此，發展非常迅速。但存在敏感度略低、精密度較差、質控困難、不易制備定量試劑等缺點。 時間分辨焚光免疫分析(time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA)是一種以鑭系元素螯 合物為標記物的新興技術，具有零本底、線性范圍寬、穩定性好等特點，靈敏度可達到1(T 18mol/L，較ELISA、CLIA、ECLIA等的l(T9-l(T15m 〇l/L更高，非常符合超微量檢測對靈敏度的 要求。但TRFIA完成一次測試需要3個小時左右，需洗板機等其它設備，一般適用于大批量檢 測，在單份測定時存在操作復雜、費時、儀器要求高等不足。將鑭系元素包裹到合適的納米 微球內形成時間分辨熒光微球(不需加解離增強溶液，即可在紫外光的激發下發出高強度 的熒光信號），把高靈敏的TRFIA技術與方便的免疫層析試驗相結合，建立一種時間分辨熒 光免疫層析分析。鑭系元素的檢測窗口和檢測波長不一樣，可進行多標記分析。采用包裹 Eu 3+和Sm3+的納米微球可以建立雙標記納米時間分辨熒光免疫層析方法。
[0005] 本發明提供了一種肺炎支原體抗體雙標記納米時間分辨熒光免疫層析方法，在一 個免疫層析板上同時進行MP-IgM和MP-IgG定量檢測，為臨床提供一種新的方便、快速、靈敏 度高、定量、可用末梢血的檢測技術。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的是克服現有肺炎支原體抗體檢測方法如免疫層析試驗(ICA)和酶聯 免疫分析法(ELISA)技術等僅能定性或半定量檢測，且進行MP-IgM和MP-IgG檢測必須進行2 次實驗等存在的不足，提供一種肺炎支原體抗體(MP-IgM和MP-IgG)雙標記納米時間分辨熒 光免疫層析定量試紙及其制備方法。
[0007] 為了解決上述技術問題，本發明提供了如下的技術方案:一種肺炎支原體抗體雙 標記納米時間分辨熒光免疫層析定量試紙，包括粘性底層、樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜 和吸水紙；
[0008] 所述粘性底層上依次設置樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜和吸水紙;其中硝酸纖維 素膜直接設置于粘性底層上，結合墊的后端搭接在硝酸纖維素膜前端上，樣品墊的后端搭 接在結合墊的前端上，樣品墊的前端直接粘結在粘性底層上;所述吸水紙的前端搭接在硝 酸纖維素膜的后端上；
[0009] 其中硝酸纖維素膜上設有檢測帶(T)和質控帶(C)。
[0010] 優選的，所述質控帶檢測帶平行設置;兩者之間相距0.5-0.6cm;檢測帶T與結合墊 3之間的距離為0 ? 5-0 ? 6cm 〇
[0011] 所述硝酸纖維素膜上相間隔依次設置有由肺炎支原體抗原涂層形成的的檢測帶T 和兔抗鼠多克隆抗體涂層形成的質控帶C;
[0012 ]所述結合墊表面噴涂有鼠抗人I gG抗體和鼠抗人I gM抗體;所述鼠抗人I gG抗體和 鼠抗人IgM抗體分別偶聯有2種不同的鑭系稀土離子的納米微球。
[0013]進一步的，所述鑭系稀土離子為銪離子、釤離子。包裹銪離子的納米微球標記鼠抗 人IgG抗體，包裹釤離子的納米微球標記鼠抗人IgM抗體的。
[0014] 進一步的，所述納米微球的直徑為10~500nm。
[0015] 進一步的，所述吸水紙與硝酸纖維素膜相重疊的部分在粘性底層長度方向的長度 為2mm，且重疊部分中吸水紙位于硝酸纖維素膜的上方;所述結合墊與硝酸纖維素膜相重疊 的部分在粘性底層長度方向的長度為2mm，且重疊部分中結合墊位于硝酸纖維素膜的上方。
[0016] 進一步的，所述樣品墊與結合墊相重疊的部分在粘性底層長度方向的長度為2_， 且重疊部分中樣品墊位于結合墊的上方，結合墊直接與粘性底層相接觸部分的長度大于 4mm 〇
[0017]本發明利用納米微球作為Eu3+標記、Sm3+標記的載體將時間分辨焚光與免疫層析 技術結合建立一種新型的具備兩者優點的雙標記時間分辨熒光免疫層析技術用于肺炎支 原體的檢測。為臨床提供一種新的方便、快速、靈敏度高、定量、可用末梢血的檢測技術，在 一個免疫層析板的一個檢測位置上同時進行MP-IgM和MP-IgG的定量檢測。
[0018]本發明原理如圖1所示，具體如下:將包裹Eu3+的納米微球標記鼠抗人IgG，包裹Sm3 +的納米微球標記鼠抗人IgM，使用定量噴膜儀噴涂于聚酯膜上，當樣品墊上加入樣品液后， 在毛細作用下，樣品液向吸水紙一段泳動，同時樣本中的待測物與時間分辨熒光微球上的 二抗(Eu 3+-鼠抗人IgG和Sm3+-鼠抗人IgM)形成二抗-待測物復合物(Eu3+-鼠抗人IgG-MP-IgG和Sm 3+-鼠抗人IgM-MP-IgM)，隨著層析作用，復合物向前移動，到達識別待測物(MP-IgM 和MP-IgG)的檢測線T處，形成二抗-待測物-針對待測物的特異性抗體夾心復合物(Eu 3+-鼠 抗人IgG-MP-IgG-MP抗原和Sm3+-鼠抗人IgM-MP-IgM-MP抗原），在T線處出現時間分辨熒 光微球的聚集。未結合的時間分辨熒光微球繼續前行，到達質控線C時，針對二抗的抗體(兔 抗鼠IgG)與時間分辨熒光微球上的二抗結合，在C線處出現時間分辨熒光微球的聚集，過量 的時間分辨熒光微球二抗則繼續向吸水塊迀移。采用時間分辨熒光免疫層析分析儀讀卡，T 線和C線產生相應的熒光信號，參照標準濃度曲線就可以得到待測樣品溶液的濃度。
[0019] 所述的肺炎支原體抗體雙標記納米時間分辨熒光免疫層析定量試紙條的制備方 法，包括如下步驟：
[0020] (1)原材料準備:準備符合要求的粘性底層、樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜和吸水 紙；
[0021] (2)抗體的預處理：用0 ? 05mol/L，pH為7 ? 2-7 ? 6的磷酸鹽緩沖液在4°C下用10kDa的 膜分別透析鼠抗人IgG抗體和鼠抗人IgM抗體，過夜，得到預處理后的抗體；
[0022] (3)標記鼠抗人IgG抗體的包裹銪離子的納米微球的制備:取包裹銪離子的納米微 球，用蒸餾水配置成質量濃度為1 %的納米微球溶液;取納米微球溶液250yL，向其中加入碳 二亞胺和步驟(2)預處理過的鼠抗人IgG抗體，碳二亞胺的終濃度為19.5-20.5mmol/L，納米 微球與鼠抗人IgG抗體的質量比為50:1;室溫反應2小時，14000r/min離心，去除上清液后， 加入質量濃度為1 %的BSA溶液，至BSA終濃度為0.05mol/L，用pH為7.15-7.25的磷酸鹽緩沖 液至納米微球濃度為0.99-1.01yg/L，待用；
[0023] (4)標記鼠抗人I gM抗體的包裹釤離子的納米微球的制備:取包裹釤離子的納米微 球，用蒸餾水配置成質量濃度為1 %的納米微球溶液;取納米微球溶液250yL，向其中入碳二 亞胺和步驟(2)預處理過的鼠抗人IgM抗體，碳二亞胺的終濃度為19.5-20.5mmol/L，納米微 球與鼠抗人IgM抗體的質量比為50:1，室溫反應2h，14000r/min離心，去除上清液后，加入質 量濃度為1 %的BSA溶液，至BSA終濃度為0.05mol/L，pH為7.15-7.25的磷酸鹽緩沖液至納米 微球微球濃度為0 ? 99-1 ? 01yg/L，待用；
[0024] (5)結合墊的制備:將步驟(3)制備納米微球溶液與步驟(4)制備的納米微球溶液 按照質量比1:1混合，得到混合納米微球溶液;用定量噴膜儀以3-5iiL/cm的量將混合微球溶 液噴涂于聚酯膜形成的結合墊上，避光的條件下于35-38°C烘干1小時，加入硅膠干燥劑封 存備用；
[0025] (6)硝酸纖維素膜的制備:使用0.02mol/L，pH為7.35-7.45的、含質量濃度1 %蔗糖 的磷酸鹽緩沖液，分別用10kDa的膜透析肺炎支原體抗原和兔抗鼠多克隆抗體，然后分別將 兩者的濃度最終稀釋到lyg/L，使用定量噴膜儀以lyL/cm的量將二者噴于硝酸纖維素膜上， 得到依次設置的肺炎支原體抗原檢測帶(C)和兔抗鼠多克隆抗體質控帶(T)，35-38°C烘干 lh，加入硅膠干燥劑封存備用；
[0026] (7)樣品墊的制備:使用含質量濃度為1%834、0.1%1^1切11100的0.0211?117.35-7.45的磷酸鹽緩沖液浸泡樣品墊lh后，35-38°C烘干3小時；
[0027] (8)免疫層析膜條的組裝:將上述步驟所制得的樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜、吸 水紙依次組裝在粘性底層上，即得到產品肺炎支原體抗體雙標記納米時間分辨熒光免疫層 析試紙。
[0028]本發明的有益效果：
[0029] -、本發明中所述硝酸纖維素膜上相間隔依次設置肺炎支原體抗原的檢測帶C以 及兔抗鼠多克隆抗體的質控帶T，結合墊表面噴涂有標記鼠抗人IgG抗體的包裹銪離子的納 米微球與標記鼠抗人IgM抗體的包裹釤離子的納米微球;該試紙條將時間分辨熒光免疫技 術、免疫層析技術、雙標記分析技術相結合，形成了一種可同時檢測MP-IgM和MP-IgG含量的 試紙條，解決了現有技術中MP-IgM和MP-IgG試紙盒無法同時檢測MP-IgM和MP-IgG的問題， 采用該種試紙條對MP-I gM和MP-I gG檢測，可以保證同一樣品液體中的MP-I gM和MP-IgG的檢 測檢測結果精確度高、誤差小，為臨床使用提供了極大便利；
[0030] 二、本發明將MP-IgM和MP-IgG的檢測帶設置于同一檢測試紙上，在檢測過程中只 會出現相同的誤差，比如同時出現正的誤差或同時出現負的誤差，在計算比值的時候，該誤 差就基本可以相抵，從而計算MP-IgM和MP-IgG比值結果更準確；
[0031]三、本發明在結合墊表面噴涂有標記鼠抗人IgG抗體的包裹銪離子的納米微球與 標記鼠抗人IgM抗體的包裹釤離子的納米微球，減少了稀土離子在樣品溶液的猝滅，提高了 稀土離子發出的熒光強度，因此不僅提高了檢測的精確度，而且便于檢測結果的顯示和操 作者的觀察；
[0032]四、本發明采用銪離子和釤離子作為稀土離子、直徑為10~500nm的納米微球，提 高了檢測的精確度，減少了誤差。
【附圖說明】
[0033]圖1本發明原理不意圖；
[0034]圖2本發明結構示意圖；
[0035]圖3 MP-IgM和MP-IgG抗體的熒光數值標準曲線圖。
[0036] 標記說明：1、粘性底層;2、樣品墊;3、結合墊;4、硝酸纖維素膜;5、吸水紙。
【具體實施方式】
[0037] 以下結合附圖對本發明的優選實施例進行說明，應當理解，此處所描述的優選實 施例僅用于說明和解釋本發明，并不用于限定本發明。
[0038] 以下實施例中的肺炎支原體抗原購自加拿大microbix biosystems公司，鼠抗人 I gG抗體和鼠抗人I gM抗體購自美國s i gma公司，包裹銪離子的納米微球和包裹釤離子的納 米微球購自上海西寶生物公司。
[0039] 實施例1
[0040] -種肺炎支原體抗體雙標記納米時間分辨熒光免疫層析定量試紙，包括粘性底層 1、樣品墊2、結合墊3、硝酸纖維素膜4和吸水紙5;
[0041]所述粘性底層1上依次設置樣品墊2、結合墊3、硝酸纖維素膜4和吸水紙5;其中硝 酸纖維素膜4直接設置于粘性底層1上，結合墊3的后端搭接在硝酸纖維素膜4前端上，樣品 墊2的后端搭接在結合墊3的前端上，樣品墊2的前端直接粘結在粘性底層1上;所述吸水紙5 的前端搭接在硝酸纖維素膜4的后端上;其中硝酸纖維素膜4上設有檢測帶T和質控帶C。 [0042] 所述質控帶C和檢測帶T平行設置，兩者之間相距0.5-0.6cm;檢測帶T與結合墊3之 間的距離為0 ? 5-0 ? 6cm。
[0043]所述檢測帶T由肺炎支原體抗原涂層形成；質控帶C由兔抗鼠多克隆抗體涂層形 成。
[0044]所述結合墊3表面噴涂有鼠抗人I gG抗體和鼠抗人I gM抗體;所述鼠抗人I gG抗體和 鼠抗人IgM抗體分別偶聯有2種不同的鑭系稀土離子的納米微球。
[0045] 所述鑭系稀土離子為銪離子Eu3+和釤離子Sm3+。
[0046] 所述納米微球的直徑為10-500nm。
[0047] 所述吸水紙5與硝酸纖維素膜4相重疊的部分在粘性底層1長度方向的長度為2mm， 且重疊部分中吸水紙5位于硝酸纖維素膜4的上方；
[0048] 所述結合墊3與硝酸纖維素膜4相重疊的部分在粘性底層1長度方向的長度為2_， 且重疊部分中結合墊3位于硝酸纖維素膜4的上方；
[0049] 所述樣品墊2與結合墊3相重疊的部分在粘性底層1長度方向的長度為2mm，且重疊 部分中樣品墊2位于結合墊3的上方，結合墊3直接與底板1相接觸部分的長度大于4_。
[0050] 實施例2
[0051] 肺炎支原體抗體雙標記納米時間分辨熒光免疫層析定量試紙條的制備方法，包括 如下步驟：
[0052] (1)原材料準備:準備符合要求的粘性底層1、樣品墊2、結合墊3、硝酸纖維素膜4和 吸水紙5;
[0053] (2)抗體的預處理：用0 ? 05mol/L，pH為7 ? 2-7 ? 6的磷酸鹽緩沖液在4°C下用10kDa的 膜分別透析鼠抗人IgG抗體和鼠抗人IgM抗體，過夜，得到預處理后的抗體；
[0054] (3)標記鼠抗人IgG抗體的包裹銪離子的納米微球的制備:取包裹銪離子的納米微 球，用蒸餾水配置成質量濃度為1 %的納米微球溶液;取納米微球溶液250yL，向其中加入碳 二亞胺和步驟(2)預處理過的鼠抗人IgG抗體，碳二亞胺的終濃度為19.5-20.5mmol/L，納米 微球與鼠抗人IgG抗體的質量比為50:1;室溫反應2小時，14000r/min離心，去除上清液后， 加入質量濃度為1 %的BSA溶液，至BSA終濃度為0.05mol/L，用pH為7.15-7.25的磷酸鹽緩沖 液至納米微球濃度為0.99-1.01yg/L，待用；
[0055] (4)標記鼠抗人IgM抗體的包裹釤離子的納米微球的制備:取包裹釤離子的納米微 球，用蒸餾水配置成質量濃度為1 %的納米微球溶液;取納米微球溶液250yL，向其中入碳二 亞胺和步驟(2)預處理過的鼠抗人IgM抗體，碳二亞胺的終濃度為19.5-20.5mmol/L，納米微 球與鼠抗人IgM抗體的質量比為50:1，室溫反應2h，14000r/min離心，去除上清液后，加入質 量濃度為1 %的BSA溶液，至BSA終濃度為0.05mol/L，pH為7.15-7.25的磷酸鹽緩沖液至納米 微球微球濃度為0 ? 99-1 ? 01yg/L，待用；
[0056] (5)結合墊的制備:將步驟(3)制備納米微球溶液與步驟(4)制備的納米微球溶液 按照質量比1:1混合，得到混合納米微球溶液;用定量噴膜儀以3-5iiL/cm的量將混合微球溶 液噴涂于聚酯膜形成的結合墊3上，避光的條件下于35-38°C烘干1小時，加入硅膠干燥劑封 存備用；
[0057] (6)硝酸纖維素膜的制備:使用0.02mol/L，pH為7.35-7.45的、含質量濃度1 %蔗糖 的磷酸鹽緩沖液，分別用10kDa的膜透析肺炎支原體抗原和兔抗鼠多克隆抗體，然后分別將 兩者的濃度最終稀釋到lyg/L，使用定量噴膜儀以lyL/cm的量將二者噴于硝酸纖維素膜4 上，得到依次設置的肺炎支原體抗原檢測帶C和兔抗鼠多克隆抗體質控帶T，35-38°C烘干 lh，加入硅膠干燥劑封存備用；
[0058] (7)樣品墊的制備:使用含質量濃度為1%834、0.1%1^1切11100的0.0211?117.35-7.45的磷酸鹽緩沖液浸泡樣品墊lh后，35-38°C烘干3小時；
[0059] (8)免疫層析膜條的組裝:將上述步驟所制得的樣品墊2、結合墊3、硝酸纖維素膜 4、吸水紙5依次組裝在粘性底層1上，即得到產品肺炎支原體抗體雙標記納米時間分辨熒光 免疫層析試紙。
[0060] 納米材料由于具有良好的光學性能、良好的穩定性(相對于酶標）、高靈敏度(單個 納米粒子可釋放出上千的原子)等優點，常常被用作標記物或標記物載體來放大信號，提高 檢測靈敏度。本發明購買的包裹Eu 3+或Sm3+的納米微球，利用包覆技術將稀土配合物納米團 簇包埋微球中，合成具有核殼結構的復合微球。復合微球表面光滑、尺寸分布均勻，其中的 稀土離子可表現出很強的特征發光，與純的稀土配合物相比量子效率、穩定性均有較大的 提尚。
[0061] 免疫層析膜條的組裝中，樣品墊2是使用過程中待測樣品滴加的部位，結合墊3中 固定有標記物-抗體(抗原)復合物，在加入待測樣品后，其可在試紙條上發生免疫反應，硝 酸纖維素膜4是層析試紙的核心部分，抗體或抗原事先被固定于其上分別作為檢測帶T與質 控帶C，吸水紙5在整個檢測過程中，通過毛細管虹吸作用提供液體流過整個試紙條的動力。 [0062]應用實施例1
[0063]使用實施例2制備的肺炎支原體抗體雙標記納米時間分辨熒光免疫層析試紙對檢 測MP-IgM和MP-IgG的定量檢測。
[0064]在制備好的免疫層析試紙條的加樣區加入不同濃度的MP-IgM和MP-IgG抗體的標 準品（取6個不同的濃度)或病人的血清樣本。膜層析反應15min后，通過時間分辨熒光免疫 層析分析儀，讀取T線Eu3+和Sm 3+的熒光信號、C線的Eu3+的熒光信號數值，并與電腦連接，分 析熒光信號，根據保存的標準曲線計算樣本中MP-IgM和MP-IgG抗體的濃度，具體為：
[0065] (1)繪制標準曲線：
[0066]以MP-IgG標準品作為樣品，進行檢測，檢測結果如表1所示。將檢測結果以熒光信 號值為縱坐標，標準品濃度為橫坐標，建立方程并擬合標準曲線，具體如圖3所示。
[0067] MP-IgG 標準品（取6個不同的濃度，分別為 lU/mL、3U/mL、10U/mL、30U/mL、100U/mL、 300U/mL，每個濃度做5個平行樣）。
[0068] 表l:MP_IgG標準品的檢測結果
[0070] 以MP-IgM標準品作為樣品，進行檢測，檢測結果如表2所示。將檢測結果以熒光信 號值為縱坐標，標準品濃度為橫坐標，建立方程并擬合標準曲線，具體如圖3所示。
[0071] MP-I gM 標準品（取6個不同的濃度，分別為 lU/mL、3U/mL、10U/mL、30U/mL、100U/mL、 300U/mL，每個濃度做5個平行樣）。
[0072] 表2:MP_IgM標準品的檢測結果
[0075] (2)血清樣品檢測：
[0076] 1、準備：
[0077] a、打開儀器電源開關，預熱30分鐘；
[0078] b、準備肺炎支原體抗體雙標記納米時間分辨熒光免疫層析試紙、樣品稀釋液(pH 為7.35-7.45的磷酸鹽緩沖液）、樣品室溫平衡；
[0079] 2、檢測
[0080] c、取20yL樣品滴加在試紙卡的加樣孔中，再加入50yL樣品稀釋液，等待15min后立 即檢測；
[0081] d、熒光掃描所述質控線C，分別測定所述質控線C區域的熒光強度，若所述質控線C 區域出現熒光發射峰，則表明該試紙條有效，反之則無效。
[0082] (3)數值分析與整理:根據測定的MP-IgG標準品的熒光值及標準品濃度繪制標準 曲線，樣本的熒光值代入標準曲線計算樣品中的MP-IgG的含量；同樣根據測定的MP-IgM標 準品的熒光值及標準品濃度繪制標準曲線，樣本的熒光值代入標準曲線計算樣品中的MP-IgM的含量。取5份臨床樣本進行檢測，結果見表3。
[0083]表3:5份臨床樣本檢測結果
【主權項】
1. 一種肺炎支原體抗體雙標記納米時間分辨熒光免疫層析定量試紙，其特征是:包括 粘性底層(1)、樣品墊(2 )、結合墊(3 )、硝酸纖維素膜(4 )和吸水紙(5 ); 所述粘性底層（1)上依次設置樣品墊（2)、結合墊(3)、硝酸纖維素膜(4)和吸水紙（5); 其中硝酸纖維素膜(4)直接設置于粘性底層（1)上，結合墊(3)的后端搭接在硝酸纖維素膜 (4)前端上，樣品墊(2)的后端搭接在結合墊(3)的前端上，樣品墊(2)的前端直接粘結在粘 性底層(1)上;所述吸水紙(5)的前端搭接在硝酸纖維素膜(4)的后端上； 其中硝酸纖維素膜(4)上設有檢測帶(T)和質控帶(C)。2. 如權利要求1所述的肺炎支原體抗體雙標記納米時間分辨熒光免疫層析定量試紙， 其特征是:所述質控帶(C)和檢測帶(T)平行設置，兩者之間相距0.5-0.6cm;檢測帶(T)與結 合墊(3)之間的距離為0.5-0.6cm。3. 如權利要求1所述的肺炎支原體抗體雙標記納米時間分辨熒光免疫層析定量試紙， 其特征是:所述檢測帶(T)由肺炎支原體抗原涂層形成；質控帶(C)由兔抗鼠多克隆抗體涂 層形成。4. 如權利要求1所述的肺炎支原體抗體雙標記納米時間分辨熒光免疫層析定量試紙， 其特征是:所述結合墊(3 )表面噴涂有鼠抗人I gG抗體和鼠抗人I gM抗體;所述鼠抗人I gG抗 體和鼠抗人IgM抗體分別偶聯有2種不同的鑭系稀土離子的納米微球。5. 如權利要求4所述的肺炎支原體抗體雙標記納米時間分辨熒光免疫層析定量試紙， 其特征是:所述鑭系稀土離子為銪離子Eu3+和釤離子Sm 3+。6. 如權利要求4所述的肺炎支原體抗體雙標記納米時間分辨熒光免疫層析定量試紙， 其特征是:所述納米微球的直徑為l〇-500nm。7. 如權利要求1所述的肺炎支原體抗體雙標記納米時間分辨熒光免疫層析定量試紙， 其特征是:所述吸水紙(5)與硝酸纖維素膜(4)相重疊的部分在粘性底層（1)長度方向的長 度為2mm，且重疊部分中吸水紙(5)位于硝酸纖維素膜(4)的上方； 所述結合墊（3)與硝酸纖維素膜(4)相重疊的部分在粘性底層（1)長度方向的長度為 2mm，且重疊部分中結合墊(3)位于硝酸纖維素膜(4)的上方； 所述樣品墊(2)與結合墊(3)相重疊的部分在粘性底層（1)長度方向的長度為2mm，且重 疊部分中樣品墊(2)位于結合墊(3)的上方，結合墊(3)直接與底板（1)相接觸部分的長度大 于 4mm〇8. 權利要求1-7之一所述的肺炎支原體抗體雙標記納米時間分辨熒光免疫層析定量試 紙條的制備方法，其特征是包括如下步驟： (1) 原材料準備:準備符合要求的粘性底層（1)、樣品墊（2)、結合墊（3)、硝酸纖維素膜 (4)和吸水紙(5); (2) 抗體的預處理：用0.05mol/L，pH為7.2-7.6的磷酸鹽緩沖液在4°C下用10kDa的膜分 別透析鼠抗人IgG抗體和鼠抗人IgM抗體，過夜，得到預處理后的抗體； (3 )標記鼠抗人I gG抗體的包裹銪離子的納米微球的制備：取包裹銪離子的納米微球， 用蒸餾水配置成質量濃度為1%的納米微球溶液;取納米微球溶液250yL，向其中加入碳二亞 胺和步驟(2)預處理過的鼠抗人IgG抗體，碳二亞胺的終濃度為19.5-20.5mmol/L，納米微球 與鼠抗人IgG抗體的質量比為50:1;室溫反應2小時，14000r/min離心，去除上清液后，加入 質量濃度為1%的BSA溶液，至BSA終濃度為0.05 mol/L，用pH為7.15-7.25的磷酸鹽緩沖液至 納米微球濃度為ο · 99-1 · Olyg/L，待用； (4 )標記鼠抗人I gM抗體的包裹釤離子的納米微球的制備：取包裹釤離子的納米微球， 用蒸餾水配置成質量濃度為1%的納米微球溶液;取納米微球溶液250yL，向其中入碳二亞胺 和步驟（2)預處理過的鼠抗人IgM抗體，碳二亞胺的終濃度為19.5-20.5mmol/L，納米微球 與鼠抗人IgM抗體的質量比為50:1，室溫反應2h，14000r/min離心，去除上清液后，加入質量 濃度為1%的834溶液，至854終濃度為0.05 111〇1/1^!1為7.15-7.25的磷酸鹽緩沖液至納米 微球微球濃度為0 · 99-1 · Olyg/L，待用； (5 )結合墊的制備:將步驟(3 )制備納米微球溶液與步驟(4 )制備的納米微球溶液按照 質量比1:1混合，得到混合納米微球溶液；用定量噴膜儀以3-5yL/cm的量將混合微球溶液噴 涂于聚酯膜形成的結合墊(3)上，避光的條件下于35-38Γ烘干1小時，加入硅膠干燥劑封存 備用； (6) 硝酸纖維素膜的制備:使用0.02mol/L，pH為7.35-7.45的、含質量濃度1%蔗糖的磷 酸鹽緩沖液，分別用lOkDa的膜透析肺炎支原體抗原和兔抗鼠多克隆抗體，然后分別將兩者 的濃度最終稀釋到lyg/L，使用定量噴膜儀以lyL/cm的量將二者噴于硝酸纖維素膜(4)上， 得到依次設置的肺炎支原體抗原檢測帶(C)和兔抗鼠多克隆抗體質控帶(T)，35-38°C烘干 lh，加入硅膠干燥劑封存備用； (7) 樣品墊的制備:使用含質量濃度為1% BSA、0.1% TritonlOO的0.02M pH7.35-7.45 的磷酸鹽緩沖液浸泡樣品墊lh后，35-38°C烘干3小時； (8) 免疫層析膜條的組裝:將上述步驟所制得的樣品墊（2)、結合墊(3)、硝酸纖維素膜 (4)、吸水紙(5)依次組裝在粘性底層（1)上，即得到產品肺炎支原體抗體雙標記納米時間分 辨熒光免疫層析試紙。
【文檔編號】G01N33/569GK106053802SQ201610389390
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月3日
【發明人】胡志剛, 劉潔, 錢俊, 高宏, 楊雪, 俞蕾, 葉燕
【申請人】無錫市人民醫院