抗繆勒氏管激素化學發光免疫檢測試劑盒及其制備方法和應用

抗繆勒氏管激素化學發光免疫檢測試劑盒及其制備方法和應用
【專利摘要】本發明公開了一種抗繆勒氏管激素化學發光免疫檢測試劑盒及其制備方法和應用，抗繆勒氏管激素化學發光免疫檢測試劑盒包括：抗繆勒氏管激素單克隆抗體包被的固相載體和化學發光標記物標記的抗繆勒氏管激素單克隆抗體。這種抗繆勒氏管激素化學發光免疫檢測試劑盒能夠以全自動化學發光免疫分析儀為檢測工具，完成抗繆勒氏管激素的檢測。這種抗繆勒氏管激素化學發光免疫檢測試劑盒，經過實驗，其檢測靈敏度達到0.01ng/mL，相對于傳統的抗繆勒氏管激素的檢測方法靈敏度至少提高了10倍，這種抗繆勒氏管激素化學發光免疫檢測試劑盒的檢測精度較高。
【專利說明】
抗繆勒氏管激素化學發光免疫檢測試劑盒及其制備方法和 應用
技術領域
[0001] 本發明涉及體外檢測領域，尤其涉及一種抗繆勒氏管激素化學發光免疫檢測試劑 盒及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 繆勒氏管激素(MIS)，也叫做抗繆勒氏管激素(Anti-Miillerian hormone，AMH)，是 由二硫化物橋連接兩個72kDa單體組成的140kU的糖蛋白二聚物。MIS/AMH屬于轉化生長 因子(TGF-P)家族總科。由Profess Alfred Jost于1947年首先發現。AMH由睪丸未成熟的 Sertoli細胞及出生后卵巢生長卵泡的顆粒細胞分泌，具有調節細胞發育及分化，使雄性胚 胎苗勒氏管退化的作用。在男性，最初表達在8周胎兒睪丸支持細胞中，始于胚胎形成，并貫 穿生命始終。在胚胎發育期間，AMH會引起繆勒氏管退化，形成正常的男性生殖管道。對于女 性而言，AMH是在36周胎兒期的卵泡顆粒細胞生成的，直至女性更年期，AMH逐漸下降至無法 檢測的水平。
[0003] 在臨床上可用于真假兩性畸形的診斷，腫瘤的特異性標記，精子形成的標記等。 AMH已應用于主要用于監測卵巢儲備力、預測體外受精聯合胚胎移植技術(IVF)的卵巢反應 性、預防卵巢過度刺激綜合征(0HSS)、男性生殖功能的評估等。在多囊卵巢綜合征(PC0S)的 診斷中也以此來代替竇卵泡數(AFC)指標。
[0004] 婦女卵巢功能與年齡、基礎卵泡刺激素（FSH)、基礎抑制素B(INHB)、基礎雌二醇 (E2)、氯米芬激發試驗(CCCT)、促性腺激素釋放激素激動劑(GnRH-a)激發試驗、竇卵泡數、 卵巢體積和卵巢血流豐度以及抗苗勒管激素(AMH)水平等多種因素相關。AMH為其中最敏感 的指標。
[0005] 傳統的AMH的檢測方法主要采用酶聯免疫吸附法，然而，受限于酶聯免疫的特點， 傳統的AMH的檢測方法在檢測過程中處于開放的空間，容易引起各種試劑之間的交叉污染， 并且由于檢測過程多采用手工操作，試劑或樣本的加量不很精確，操作過程極為繁瑣和復 雜，容易發生操作差錯，檢測精度較差。

【發明內容】

[0006] 基于此，有必要提供一種檢測精度較高的抗繆勒氏管激素化學發光免疫檢測試劑 盒及其制備方法和應用。
[0007] -種抗繆勒氏管激素化學發光免疫檢測試劑盒，包括:抗繆勒氏管激素單克隆抗 體包被的固相載體和化學發光標記物標記的抗繆勒氏管激素單克隆抗體。
[0008] 在一個實施例中，所述抗繆勒氏管激素單克隆抗體包被的固相載體中，所述固相 載體為表面帶有用于蛋白質化學反應連接基團的磁微粒。
[0009] 在一個實施例中，所述表面帶有用于蛋白質化學反應連接基團的磁微粒為表面帶 有氨基、羧基、甲苯磺酰基或環氧乙烷基的磁微粒。
[0010] 在一個實施例中，所述表面帶有用于蛋白質化學反應連接基團的磁微粒的粒徑為 0.05M1 ~3mid
[0011] 在一個實施例中，所述抗繆勒氏管激素單克隆抗體包被的固相載體中，所述固相 載體上偶聯有鏈霉親和素、親和素或中性親和素，所述抗繆勒氏管激素單克隆抗體上偶聯 有生物素。
[0012] 在一個實施例中，所述化學發光標記物標記的抗繆勒氏管激素單克隆抗體中，所 述化學發光標記物為異魯米諾、三聯吡啶釕、吖啶酯、堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶。
[0013] 在一個實施例中，所述化學發光標記物標記的抗繆勒氏管激素單克隆抗體中，所 述化學發光標記物上偶聯有鏈霉親和素、親和素或中性親和素，所述抗繆勒氏管激素單克 隆抗體上偶聯有生物素。
[0014] 在一個實施例中，所述化學發光標記物標記的抗繆勒氏管激素單克隆抗體中，所 述化學發光標記物與所述抗繆勒氏管激素單克隆抗體通過化學反應鍵直接連接或通過蛋 白交聯劑連接。
[0015]在一個實施例中，所述蛋白交聯劑選自碳酰二亞胺鹽和琥珀酰亞胺中的至少一 種。
[0016] 在一個實施例中，所述蛋白交聯劑選自1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺、 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺和磺酸化N-羥基琥珀 酰亞胺中的至少一種。
[0017] 在一個實施例中，還包括抗繆勒氏管激素定標品。
[0018] -種上述的抗繆勒氏管激素化學發光免疫檢測試劑盒的制備方法，包括如下步 驟：
[0019] 將抗繆勒氏管激素單克隆抗體和固相載體混合并充分反應，得到抗繆勒氏管激素 單克隆抗體包被的固相載體;以及
[0020] 將化學發光標記物和抗繆勒氏管激素單克隆抗體混合并充分反應，得到化學發光 標記物標記的抗繆勒氏管激素單克隆抗體。
[0021] 在一個實施例中，所述抗繆勒氏管激素單克隆抗體包被的固相載體中，所述固相 載體為表面帶有用于蛋白質化學反應連接基團的磁微粒；
[0022] 所述將抗繆勒氏管激素單克隆抗體和固相載體混合并充分反應，得到抗繆勒氏管 激素單克隆抗體包被的固相載體的操作為:取表面帶有用于蛋白質化學反應連接基團的磁 微粒的懸浮液，磁分離去上清后用緩沖液重懸，接著活化劑活化所述表面帶有用于蛋白質 化學反應連接基團的磁微粒的表面連接基團，接著加入抗繆勒氏管激素單克隆抗體，室溫 下充分反應，磁分離去除上清后重懸，得到抗繆勒氏管激素單克隆抗體包被的表面帶有用 于蛋白質化學反應連接基團的磁微粒。
[0023] 在一個實施例中，所述抗繆勒氏管激素單克隆抗體包被的固相載體中，所述固相 載體上偶聯有鏈霉親和素、親和素或中性親和素，所述抗繆勒氏管激素單克隆抗體上偶聯 有生物素；
[0024] 所述將抗繆勒氏管激素單克隆抗體和固相載體混合并充分反應，得到抗繆勒氏管 激素單克隆抗體包被的固相載體的操作為:將偶聯有鏈霉親和素、親和素或中性親和素的 固相載體和偶聯有生物素的抗繆勒氏管激素單克隆抗體在緩沖液中混合，充分反應后得到 抗繆勒氏管激素單克隆抗體包被的固相載體。
[0025] 在一個實施例中，所述化學發光標記物標記的抗繆勒氏管激素單克隆抗體中，所 述化學發光標記物上偶聯有鏈霉親和素、親和素或中性親和素，所述抗繆勒氏管激素單克 隆抗體上偶聯有生物素；
[0026] 所述將化學發光標記物和抗繆勒氏管激素單克隆抗體混合并充分反應，得到化學 發光標記物標記的抗繆勒氏管激素單克隆抗體的操作為:將偶聯有鏈霉親和素、親和素或 中性親和素的化學發光標記物和偶聯有生物素的抗繆勒氏管激素單克隆抗體在緩沖液中 混合，充分反應后得到化學發光標記物標記的抗繆勒氏管激素單克隆抗體。
[0027] 在一個實施例中，所述化學發光標記物標記的抗繆勒氏管激素單克隆抗體中，所 述化學發光標記物與所述抗繆勒氏管激素單克隆抗體通過化學反應鍵直接連接；
[0028] 所述將化學發光標記物和抗繆勒氏管激素單克隆抗體混合并充分反應，得到化學 發光標記物標記的抗繆勒氏管激素單克隆抗體的操作為:將抗繆勒氏管激素單克隆抗體和 化學發光標記物在緩沖液中混合，充分反應后得到化學發光標記物標記的抗繆勒氏管激素 單克隆抗體。
[0029] 在一個實施例中，所述化學發光標記物標記的抗繆勒氏管激素單克隆抗體中，所 述化學發光標記物與所述抗繆勒氏管激素單克隆抗體通過蛋白交聯劑連接；
[0030] 所述將化學發光標記物和抗繆勒氏管激素單克隆抗體混合并充分反應，得到化學 發光標記物標記的抗繆勒氏管激素單克隆抗體的操作為:將抗繆勒氏管激素單克隆抗體、 化學發光標記物和蛋白交聯劑在緩沖液中混合，充分反應后得到化學發光標記物標記的抗 繆勒氏管激素單克隆抗體。
[0031] -種抗繆勒氏管激素的濃度的檢測方法，采用上述抗繆勒氏管激素化學發光免疫 檢測試劑盒，所述抗繆勒氏管激素的濃度的檢測方法包括如下步驟：
[0032]使用抗繆勒氏管激素單克隆抗體包被的固相載體和化學發光標記物標記的抗繆 勒氏管激素單克隆抗體對待測樣本進行夾心免疫試驗，所述待測樣本中的抗繆勒氏管激素 與抗繆勒氏管激素單克隆抗體包被的固相載體和化學發光標記物標記的抗繆勒氏管激素 單克隆抗體反應，形成夾心復合物，經過清洗分離后，測得待測樣本的發光強度；
[0033]使用抗繆勒氏管激素單克隆抗體包被的固相載體和化學發光標記物標記的抗繆 勒氏管激素單克隆抗體對抗繆勒氏管激素定標品進行夾心免疫試驗，所述抗繆勒氏管激素 定標品中的抗繆勒氏管激素與抗繆勒氏管激素單克隆抗體包被的固相載體和化學發光標 記物標記的抗繆勒氏管激素單克隆抗體反應，形成夾心復合物，經過清洗分離后，測得抗繆 勒氏管激素定標品的發光強度，根據所述抗繆勒氏管激素定標品的發光強度和所述抗繆勒 氏管激素定標品的濃度構建橫縱坐標分別為濃度和發光強度的抗繆勒氏管激素的標準曲 線；以及
[0034]將所述待測樣本的發光信號帶入所述抗繆勒氏管激素的標準曲線中，計算得到所 述待測樣本中的抗繆勒氏管激素的濃度。
[0035]這種抗繆勒氏管激素化學發光免疫檢測試劑盒能夠以全自動化學發光免疫分析 儀為檢測工具，完成抗繆勒氏管激素的檢測。這種抗繆勒氏管激素化學發光免疫檢測試劑 盒，經過實驗，其檢測靈敏度達到0.0 lng/mL，相對于傳統的抗繆勒氏管激素的檢測方法靈 敏度至少提高了 10倍，這種抗繆勒氏管激素化學發光免疫檢測試劑盒的檢測精度較高。
【附圖說明】
[0036] 圖1為實施例3得到的抗繆勒氏管激素的標準曲線圖；
[0037] 圖2為實施例7得到的抗繆勒氏管激素的標準曲線圖。
【具體實施方式】
[0038] 為使本發明的上述目的、特征和優點能夠更加明顯易懂，下面結合附圖和具體實 施例對本發明的【具體實施方式】做詳細的說明。在下面的描述中闡述了很多具體細節以便于 充分理解本發明。但是本發明能夠以很多不同于在此描述的其它方式來實施，本領域技術 人員可以在不違背本發明內涵的情況下做類似改進，因此本發明不受下面公開的具體實施 的限制。
[0039] -實施方式的抗繆勒氏管激素化學發光免疫檢測試劑盒，包括:抗繆勒氏管激素 單克隆抗體包被的固相載體和化學發光標記物標記的抗繆勒氏管激素單克隆抗體。
[0040] 抗繆勒氏管激素單克隆抗體包被的固相載體中，抗繆勒氏管激素單克隆抗體可以 為人源、基因工程表達或動物源。
[0041] 化學發光標記物標記的抗繆勒氏管激素單克隆抗體中，抗繆勒氏管激素單克隆抗 體可以為人源、基因工程表達或動物源。
[0042] 抗繆勒氏管激素單克隆抗體包被的固相載體和化學發光標記物標記的抗繆勒氏 管激素單克隆抗體中，各自使用的抗繆勒氏管激素單克隆抗體可以相同，也可以不相同。
[0043] 在一個實施方式中，抗繆勒氏管激素單克隆抗體包被的固相載體中，固相載體為 表面帶有用于蛋白質化學反應連接基團的磁微粒、表面可進行蛋白質物理吸附的硅基材料 或經過高分子表面處理的磁微粒。
[0044]固相載體為表面帶有用于蛋白質化學反應連接基團的磁微粒或經過高分子表面 處理的磁微粒時，優選的，抗繆勒氏管激素單克隆抗體與磁微粒的質量比為1:20~100。 [0045]表面帶有用于蛋白質化學反應連接基團的磁微粒可以為表面帶有氨基、羧基、甲 苯磺酰基或環氧乙烷基的磁微粒。
[0046]表面帶有用于蛋白質化學反應連接基團的磁微粒的粒徑優選為0.05M1~3wii。 [0047]以固相載體為表面帶有用于羧基的磁微粒為例，抗繆勒氏管激素單克隆抗體包被 的固相載體的制備過程可以為:取羧基化的磁微粒的懸浮液，磁分離去上清后用MES緩沖液 重懸，接著加入EDC水溶液，活化羧基化的磁微粒的表面羧基，接著加入抗繆勒氏管激素單 克隆抗體，室溫下混懸2h~10h，磁分離去除上清后用Tris緩沖液重懸，得到抗繆勒氏管激 素單克隆抗體包被的羧基化的磁微粒。其中，MES (2-(N-嗎啡啉）乙磺酸）緩沖液的濃度為 0.02M，pH為5.5; Tris緩沖液的濃度為0.1M并且含有2 %BSA，pH為8.0 ;EDC( 1-乙基-3-(3-二 甲基氨丙基)_碳化二亞胺)水溶液的濃度為10mg/mL~20mg/mL，EDC與羧基化的磁微粒的比 例為 0.05:0.1 ~1。
[0048] 在另一個實施方式中，抗繆勒氏管激素單克隆抗體包被的固相載體中，固相載體 上偶聯有鏈霉親和素、親和素或中性親和素，抗繆勒氏管激素單克隆抗體上偶聯有生物素。
[0049] 抗繆勒氏管激素單克隆抗體包被的固相載體可以是直接購買的商品化親和素固 相載體，也可以是通過親和素化學鍵和偶聯其他固相載體制備的親和素固相載體。
[0050] 化學發光標記物標記的抗繆勒氏管激素單克隆抗體中，化學發光標記物為異魯米 諾、三聯吡啶釕、吖啶酯、堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶。
[0051] 優選的，抑制素單克隆抗體標記的化學發光標記物中，抗繆勒氏管激素單克隆抗 體與化學發光標記物的比例為50:1~10。
[0052] 在一個實施例中，化學發光標記物標記的抗繆勒氏管激素單克隆抗體中，化學發 光標記物上偶聯有鏈霉親和素、親和素或中性親和素，抗繆勒氏管激素單克隆抗體上偶聯 有生物素。
[0053] 以化學發光標記物上偶聯有鏈霉親和素，抗繆勒氏管激素單克隆抗體上偶聯有生 物素為例，化學發光標記物為吖啶酯為例，化學發光標記物標記的抗繆勒氏管激素單克隆 抗體的制備過程如下:取抗繆勒氏管激素單克隆抗體溶液，加入500yL pH8.0的磷酸鹽緩沖 液，加入0. lmg生物素琥珀酰亞胺(Biotin-NHS)混合，室溫下避光反應，lh~2h后取出，離心 脫鹽柱脫鹽處理，脫鹽過程中首先分別用純凈水及TBS緩沖液進行處理，收集脫鹽管中的液 體保存，得到生物素標記的抗繆勒氏管激素單克隆抗體;取鏈霉親和素溶液，加入0.1M~ 0.2M pH9.0~9.5的碳酸鹽緩沖液，混勻，然后加入吖啶酯混勻，室溫下避光反應，1~2h后 取出，用zeba離心脫鹽柱脫鹽處理，脫鹽過程中首先分別用純凈水及TBS緩沖液進行處理， 最后加入得到的吖啶酯標記的鏈霉親和素;將生物素標記的抗繆勒氏管激素單克隆抗體和 吖啶酯標記的鏈霉親和素混合，得到吖啶酯標記的抗繆勒氏管激素單克隆抗體。
[0054] 在另一實施例中，化學發光標記物標記的抗繆勒氏管激素單克隆抗體中，化學發 光標記物與抗繆勒氏管激素單克隆抗體通過化學反應鍵直接連接或通過蛋白交聯劑連接。
[0055] 蛋白交聯劑可以為碳酰二亞胺鹽和琥珀酰亞胺中的至少一種。
[0056] 優選的，蛋白交聯劑選自1-乙基_(3_二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺、1-乙基_(3_二 甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺和磺酸化N-羥基琥珀酰亞胺中的至 少一種。
[0057]以化學發光標記物為吖啶酯為例，化學發光標記物與抗繆勒氏管激素單克隆抗體 通過化學反應鍵直接連接制得化學發光標記物標記的抗繆勒氏管激素單克隆抗體的過程 如下:取抗繆勒氏管激素單克隆抗體，加入碳酸鹽緩沖液，混勻，然后加入吖啶酯混勻，室溫 下避光反應，lh~2h后取出，離心脫鹽柱脫鹽處理，脫鹽過程中首先分別用純凈水及TBS緩 沖液進行處理，得到吖啶酯標記的抗繆勒氏管激素單克隆抗體。
[0058]以化學發光標記物為堿性磷酸酶，蛋白交聯劑為1-乙基_(3_二甲基氨基丙基)碳 酰二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺為例，化學發光標記物與抗繆勒氏管激素單克隆抗體 通過蛋白交聯劑連接制得化學發光標記物標記的抗繆勒氏管激素單克隆抗體的過程如下： 取lmg抗繆勒氏管激素單克隆抗體溶液、lmg堿性磷酸酶，加入500此pH5.5的2-(N-嗎啡啉） 乙磺酸(MES)緩沖液，加入lmgl-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽和lmg N-羥 基琥珀酰亞胺混合，室溫下避光反應，lh~2h后取出，離心脫鹽柱脫鹽處理，脫鹽過程中首 先分別用純凈水及TBS緩沖液進行處理，收集脫鹽管中的液體保存，得到堿性磷酸酶標記的 抗繆勒氏管激素單克隆抗體。
[0059]在其他的實施例中，上述抗繆勒氏管激素化學發光免疫檢測試劑盒還包括化學發 光底物液。
[0060] 化學發光底物液包括A液和B液。A液可以為H2〇2溶液，B液可以為NaOH溶液。
[0061 ] 本實施例中，A液為濃度為0. lmol/L的H2〇2溶液，B液為濃度為0.25mol/L的NaOH溶 液。
[0062] 在其他的實施例中，上述抗繆勒氏管激素化學發光免疫檢測試劑盒還包括抗繆勒 氏管激素定標品。
[0063] 抗繆勒氏管激素定標品的制備過程如下:采用定標品緩沖液將抗繆勒氏管激素配 制成濃度分別為〇~30ng/mL的抗繆勒氏管激素的溶液。
[0064]具體的，抗繆勒氏管激素定標品為濃度分別為0ng/mL、0 ? 7ng/mL、2 ? 5ng/mL、 4 ? 65ng/mL、13 ? 58ng/mL和28 ? 56ng/mL的抗繆勒氏管激素的溶液。
[0065] 這種抗繆勒氏管激素化學發光免疫檢測試劑盒能夠以全自動化學發光免疫分析 儀為檢測工具，完成抗繆勒氏管激素的檢測。這種抗繆勒氏管激素化學發光免疫檢測試劑 盒，經過實驗，其檢測靈敏度達到0.0 lng/mL，相對于傳統的抗繆勒氏管激素的檢測方法靈 敏度至少提高了 10倍，這種抗繆勒氏管激素化學發光免疫檢測試劑盒的檢測精度較高。
[0066] 這種抗繆勒氏管激素化學發光免疫檢測試劑盒使用時先利用全自動化學發光免 疫分析儀對抗繆勒氏管激素定標品進行檢測，繪制標準曲線，內置于電腦軟件，測試實際樣 本，根據樣本發光值計算樣本濃度，最后對抗繆勒氏管激素全自動化學發光免疫分析系統 進行性能(靈敏度、線性、精密度、干擾性)的評價。
[0067]這種抗繆勒氏管激素化學發光免疫檢測試劑盒，具有以下優點：
[0068] 1、選擇吖啶酯作為標記材料，并應用于化學發光免疫分析系統，該發光體系為直 接化學發光，與傳統的酶促化學發光相比，該反應不需要酶的參與，更加節約成本；
[0069] 2、選用的吖啶酯或堿性磷酸酶化學發光免疫分析系統檢測靈敏度高，能夠達到 0.0 lng/mL，相比其它的檢測方法靈敏度至少提高了 10倍；
[0070] 3、選用吖啶酯的化學發光免疫分析系統線性范圍寬，能達到25ng/mL以上；
[0071] 4、吖啶酯化學發光免疫分析系統重復性高，批內及批間差均在5%以內，這是其它 化學發光免疫分析系統難以達到的；
[0072] 5、化學發光免疫分析系統已實現樣本的定量，通過內置標準曲線到測試軟件，只 需測試樣本就可直接得到樣本的濃度值；
[0073] 6、化學發光免疫分析系統可以實現全自動化，試劑及樣本的添加全有儀器完成， 操作更加簡便，減少了人為的誤差。
[0074]綜上所述，這種抗繆勒氏管激素化學發光免疫檢測試劑盒檢測成本低、靈敏度高、 檢測線性范圍廣、重現性高、可以定量、操作簡單。
[0075]此外，使用這種抗繆勒氏管激素化學發光免疫檢測試劑盒，通過測定特定人群的 AMH濃度水平或分布，受試者AMH濃度與之比較，若偏離標定人群的AMH濃度水平，則提示受 試者為非健康或功能弱。也可以對同一受試者，進行連續AMH水平監測，以評估生殖相關功 能。可用于輔助診斷或預測疾病，監控及預測健康狀態:診斷顆粒細胞瘤、診斷性發育異常、 診斷多囊卵巢綜合征、監測卵巢儲備力、預測體外受精聯合胚胎移植技術(IVF)的卵巢反應 性、預防卵巢過度刺激綜合征(0HSS)、評估男性生殖功能等。
[0076] 本發明還公開了一種上述的抗繆勒氏管激素化學發光免疫檢測試劑盒的制備方 法，包括如下步驟：
[0077] S110、將抗繆勒氏管激素單克隆抗體和固相載體混合并充分反應，得到抗繆勒氏 管激素單克隆抗體包被的固相載體。
[0078] 抗繆勒氏管激素單克隆抗體包被的固相載體中，抗繆勒氏管激素單克隆抗體可以 為人源、基因工程表達或動物源。
[0079] 在一個實施方式中，抗繆勒氏管激素單克隆抗體包被的固相載體中，固相載體為 表面帶有用于蛋白質化學反應連接基團的磁微粒、表面可進行蛋白質物理吸附的硅基材料 或經過高分子表面處理的磁微粒。
[0080] 固相載體為表面帶有用于蛋白質化學反應連接基團的磁微粒或經過高分子表面 處理的磁微粒時，優選的，抗繆勒氏管激素單克隆抗體與磁微粒的質量比為1:20~100。
[0081] 表面帶有用于蛋白質化學反應連接基團的磁微粒可以為表面帶有氨基、羧基、甲 苯磺酰基或環氧乙烷基的磁微粒。
[0082]表面帶有用于蛋白質化學反應連接基團的磁微粒的粒徑優選為0.05WI1~3WI1。
[0083] 當抗繆勒氏管激素單克隆抗體包被的固相載體中，固相載體為表面帶有用于蛋白 質化學反應連接基團的磁微粒時，S110為:取表面帶有用于蛋白質化學反應連接基團的磁 微粒的懸浮液，磁分離去上清后用緩沖液重懸，接著活化劑活化表面帶有用于蛋白質化學 反應連接基團的磁微粒的表面連接基團，接著加入抗繆勒氏管激素單克隆抗體，室溫下充 分反應，磁分離去除上清后重懸，得到抗繆勒氏管激素單克隆抗體包被的表面帶有用于蛋 白質化學反應連接基團的磁微粒。
[0084] 以固相載體為表面帶有用于羧基的磁微粒為例，抗繆勒氏管激素單克隆抗體包被 的固相載體的制備過程可以為:取羧基化的磁微粒的懸浮液，磁分離去上清后用MES緩沖液 重懸，接著加入EDC水溶液，活化羧基化的磁微粒的表面羧基，接著加入抗繆勒氏管激素單 克隆抗體，室溫下混懸2h~10h，磁分離去除上清后用Tris緩沖液重懸，得到抗繆勒氏管激 素單克隆抗體包被的羧基化的磁微粒。其中，MES (2-(N-嗎啡啉）乙磺酸）緩沖液的濃度為 0.02M，pH為5.5; Tris緩沖液的濃度為0.1M并且含有2 %BSA，pH為8.0 ;EDC( 1-乙基-3-(3-二 甲基氨丙基)_碳化二亞胺)水溶液的濃度為10mg/mL~20mg/mL，EDC與羧基化的磁微粒的比 例為 0.05:0.1 ~1。
[0085] 在另一個實施方式中，抗繆勒氏管激素單克隆抗體包被的固相載體中，固相載體 上偶聯有鏈霉親和素、親和素或中性親和素，抗繆勒氏管激素單克隆抗體上偶聯有生物素。
[0086] 抗繆勒氏管激素單克隆抗體包被的固相載體可以是直接購買的商品化親和素固 相載體，也可以是通過親和素化學鍵和偶聯其他固相載體制備的親和素固相載體。
[0087] 抗繆勒氏管激素單克隆抗體包被的固相載體中，固相載體上偶聯有鏈霉親和素、 親和素或中性親和素，抗繆勒氏管激素單克隆抗體上偶聯有生物素時，S110為:將偶聯有鏈 霉親和素、親和素或中性親和素的固相載體和偶聯有生物素的抗繆勒氏管激素單克隆抗體 在緩沖液中混合，充分反應后得到抗繆勒氏管激素單克隆抗體包被的固相載體。
[0088] S120、將化學發光標記物和抗繆勒氏管激素單克隆抗體混合并充分反應，得到化 學發光標記物標記的抗繆勒氏管激素單克隆抗體。
[0089] S110和S120的次序可以替換，不影響本方法。
[0090] 化學發光標記物標記的抗繆勒氏管激素單克隆抗體中，抗繆勒氏管激素單克隆抗 體可以為人源、基因工程表達或動物源。
[0091] 抗繆勒氏管激素單克隆抗體包被的固相載體和化學發光標記物標記的抗繆勒氏 管激素單克隆抗體中，各自使用的抗繆勒氏管激素單克隆抗體可以相同，也可以不相同。
[0092]化學發光標記物標記的抗繆勒氏管激素單克隆抗體中，化學發光標記物為異魯米 諾、三聯吡啶釕、吖啶酯、堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶。
[0093]優選的，抑制素單克隆抗體標記的化學發光標記物中，抗繆勒氏管激素單克隆抗 體與化學發光標記物的比例為50:1~10。
[0094] 在一個實施例中，化學發光標記物標記的抗繆勒氏管激素單克隆抗體中，化學發 光標記物上偶聯有鏈霉親和素、親和素或中性親和素，抗繆勒氏管激素單克隆抗體上偶聯 有生物素。
[0095] 化學發光標記物標記的抗繆勒氏管激素單克隆抗體中，化學發光標記物上偶聯有 鏈霉親和素、親和素或中性親和素，抗繆勒氏管激素單克隆抗體上偶聯有生物素時，S120 為:將偶聯有鏈霉親和素、親和素或中性親和素的化學發光標記物和偶聯有生物素的抗繆 勒氏管激素單克隆抗體在緩沖液中混合，充分反應后得到化學發光標記物標記的抗繆勒氏 管激素單克隆抗體。
[0096] 具體的，以化學發光標記物上偶聯有鏈霉親和素，抗繆勒氏管激素單克隆抗體上 偶聯有生物素為例，化學發光標記物為吖啶酯為例，化學發光標記物標記的抗繆勒氏管激 素單克隆抗體的制備過程如下:取抗繆勒氏管激素單克隆抗體溶液，加入500yL pH8.0的磷 酸鹽緩沖液，加入O.lmg生物素琥珀酰亞胺(Biotin-NHS)混合，室溫下避光反應，lh~2h后 取出，離心脫鹽柱脫鹽處理，脫鹽過程中首先分別用純凈水及TBS緩沖液進行處理，收集脫 鹽管中的液體保存，得到生物素標記的抗繆勒氏管激素單克隆抗體;取鏈霉親和素溶液，加 入0.1M~0.2M pH 9.0~9.5的碳酸鹽緩沖液，混勻，然后加入吖啶酯混勻，室溫下避光反 應，1~2h后取出，用zeba離心脫鹽柱脫鹽處理，脫鹽過程中首先分別用純凈水及TBS緩沖液 進行處理，最后加入得到的吖啶酯標記的鏈霉親和素;將生物素標記的抗繆勒氏管激素單 克隆抗體和吖啶酯標記的鏈霉親和素混合，得到吖啶酯標記的抗繆勒氏管激素單克隆抗 體。
[0097] 在另一實施例中，化學發光標記物標記的抗繆勒氏管激素單克隆抗體中，化學發 光標記物與抗繆勒氏管激素單克隆抗體通過化學反應鍵直接連接或通過蛋白交聯劑連接。 [0098]蛋白交聯劑可以為碳酰二亞胺鹽和琥珀酰亞胺中的至少一種。
[0099] 優選的，蛋白交聯劑選自1-乙基_(3_二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺、1-乙基_(3_二 甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺和磺酸化N-羥基琥珀酰亞胺中的至 少一種。
[0100] 化學發光標記物標記的抗繆勒氏管激素單克隆抗體中，化學發光標記物與抗繆勒 氏管激素單克隆抗體通過化學反應鍵直接連接時，S120為:將抗繆勒氏管激素單克隆抗體 和化學發光標記物在緩沖液中混合，充分反應后得到化學發光標記物標記的抗繆勒氏管激 素單克隆抗體。
[0101] 具體的，以化學發光標記物為吖啶酯為例，化學發光標記物與抗繆勒氏管激素單 克隆抗體通過化學反應鍵直接連接制得化學發光標記物標記的抗繆勒氏管激素單克隆抗 體的過程如下：取抗繆勒氏管激素單克隆抗體，加入碳酸鹽緩沖液，混勻，然后加入吖啶酯 混勻，室溫下避光反應，lh~2h后取出，離心脫鹽柱脫鹽處理，脫鹽過程中首先分別用純凈 水及TBS緩沖液進行處理，得到吖啶酯標記的抗繆勒氏管激素單克隆抗體。
[0102] 化學發光標記物標記的抗繆勒氏管激素單克隆抗體中，化學發光標記物與抗繆勒 氏管激素單克隆抗體通過蛋白交聯劑連接時，S120為:將抗繆勒氏管激素單克隆抗體、化學 發光標記物和蛋白交聯劑在緩沖液中混合，充分反應后得到化學發光標記物標記的抗繆勒 氏管激素單克隆抗體。
[0103] 具體的，以化學發光標記物為堿性磷酸酶，蛋白交聯劑為1-乙基-(3-二甲基氨基 丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺為例，化學發光標記物與抗繆勒氏管激素單 克隆抗體通過蛋白交聯劑連接制得化學發光標記物標記的抗繆勒氏管激素單克隆抗體的 過程如下：取lmg抗繆勒氏管激素單克隆抗體溶液、lmg堿性磷酸酶，加入500此pH5.5的2-(N-嗎啡啉）乙磺酸( MES)緩沖液，加入lmgl-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽 和lmg N-羥基琥珀酰亞胺混合，室溫下避光反應，lh~2h后取出，離心脫鹽柱脫鹽處理，脫 鹽過程中首先分別用純凈水及TBS緩沖液進行處理，收集脫鹽管中的液體保存，得到堿性磷 酸酶標記的抗繆勒氏管激素單克隆抗體。
[0104]在其他的實施例中，抗繆勒氏管激素化學發光免疫檢測試劑盒還包括化學發光底 物液。
[0105] 化學發光底物液包括A液和B液。A液可以為H2〇2溶液，B液可以為NaOH溶液。
[0106] 本實施例中，A液為濃度為0. lmol/L的H2〇2溶液，B液為濃度為0.25mol/L的NaOH溶 液。
[0107]在其他的實施例中，抗繆勒氏管激素化學發光免疫檢測試劑盒還包括抗繆勒氏管 激素定標品。
[0108]抗繆勒氏管激素定標品的制備過程如下:采用定標品緩沖液將抗繆勒氏管激素配 制成濃度分別為〇~30ng/mL的抗繆勒氏管激素的溶液。
[0109]具體的，抗繆勒氏管激素定標品為濃度分別為0ng/mL、0.7ng/mL、2.5ng/mL、 4 ? 65ng/mL、13 ? 58ng/mL和28 ? 56ng/mL的抗繆勒氏管激素的溶液。
[0110]本發明還公開了用上述抗繆勒氏管激素化學發光免疫檢測試劑盒的抗繆勒氏管 激素的濃度的檢測方法，包括如下步驟：
[0111] S210、使用抗繆勒氏管激素單克隆抗體包被的固相載體和化學發光標記物標記的 抗繆勒氏管激素單克隆抗體對待測樣本進行夾心免疫試驗，待測樣本中的抗繆勒氏管激素 與抗繆勒氏管激素單克隆抗體包被的固相載體和化學發光標記物標記的抗繆勒氏管激素 單克隆抗體反應，形成夾心復合物，經過清洗分離后，測得待測樣本的發光信號。
[0112] S220、使用抗繆勒氏管激素單克隆抗體包被的固相載體和化學發光標記物標記的 抗繆勒氏管激素單克隆抗體對抗繆勒氏管激素定標品進行夾心免疫試驗，抗繆勒氏管激素 定標品中的抗繆勒氏管激素與抗繆勒氏管激素單克隆抗體包被的固相載體和化學發光標 記物標記的抗繆勒氏管激素單克隆抗體反應，形成夾心復合物，經過清洗分離后，測得抗繆 勒氏管激素定標品的發光強度，根據抗繆勒氏管激素定標品的發光強度和抗繆勒氏管激素 定標品的濃度構建橫縱坐標分別為濃度和發光強度的抗繆勒氏管激素的標準曲線。
[0113] S210和S220的次序可以替換，不影響本方法。
[0114] 抗繆勒氏管激素定標品的制備過程如下:采用定標品緩沖液將抗繆勒氏管激素配 制成濃度分別為〇~30ng/mL的抗繆勒氏管激素的溶液。
[0115]具體的，抗繆勒氏管激素定標品為濃度分別為0ng/mL、0 ? 7ng/mL、2 ? 5ng/mL、 4 ? 65ng/mL、13 ? 58ng/mL和28 ? 56ng/mL的抗繆勒氏管激素的溶液。
[0116] S230、將S210得到的待測樣本的發光信號帶入S220得到的抗繆勒氏管激素的標準 曲線中，計算得到待測樣本中的抗繆勒氏管激素的濃度。
[0117] 以下為具體實施例。
[0118]實施例1:抗繆勒氏管激素化學發光免疫檢測試劑盒的制備
[0119] (1 )AMH單克隆抗體包被的磁顆粒的制備：
[0120] 取50mg粒徑為0.05iim~3ym的羧基化的磁微粒(MagnaBindTM，貨號21353)懸浮液， 磁分離去上清，用0 ? 02M，pH為5 ? 5的MES緩沖液重懸，加入0 ? 5mL~2mL新配置的10mg/mL的 EDC水溶液，活化磁珠表面羧基，加入lmg~3mg的AMH單克隆抗體(Anshlabs，AA011)，室溫下 混懸2h~10h，磁分離，去除上清，用含2 %BSA的0.1M pH為8.0的Tris緩沖液重懸到lmg/mL， 得到AMH單克隆抗體包被的磁顆粒，每瓶5mL分裝保存于4°C備用。
[0121 ] (2)吖啶酯標記的AMH單克隆抗體的制備：
[0122]取 500yL 1.0mg/mL 的 AMH 單克隆標記抗體（Anshlabs，AA012)溶液，加入 500yL 0.1-0.211?119.0-9.5的碳酸鹽緩沖液，混勻，然后加入10~20此511^/1^的吖啶酯混勻，室 溫下避光反應，1~2h后取出，用2mL的zeba離心脫鹽柱脫鹽處理，脫鹽過程中首先分別用純 凈水及TBS緩沖液進行處理，最后加入得到的吖啶酯標記的AMH單克隆抗體溶液，收集離心 管中的液體至保存管得到吖啶酯標記的AMH單克隆抗體，每瓶lmL分裝保存于4°C備用。 [0 123] (3)AMH定標品的制備：
[0124] 用標準品緩沖液(40mM Tris-HCl，0.5%BSA，l%NaCl，pH 8.0)將人源化AMH蛋白 配置成濃度為〇ng/mL、0 ? 7ng/mL、2 ? 5ng/mL、4 ? 65ng/mL、13 ? 58ng/mL、28 ? 56ng/mL，每瓶 0.5mL分裝，經凍干處理后，4 °C保存備用。
[0125] 實施例2: AMH吖啶酯化學發光免疫檢測方法
[0126] 本發明以全自動化學發光免疫分析儀和實施例1制得的抗繆勒氏管激素化學發光 免疫檢測試劑盒為檢測工具，本發明的方法學模式為夾心法，即儀器依次加入50此的樣品、 50yL的AMH單克隆抗體包被的磁顆粒以及50yL的吖啶酯標記的AMH單克隆抗體，反應lOmin 后，進行磁分離，儀器將反應混合物送入暗室，依次加入發光底物A液(含0.1M HN03和0.5 % H2〇2)及B液(含0.25M NaOH)進行發光反應，最后記錄發光強度，從標準曲線計算出被測樣品 的AMH含量。
[0127] 實施例3:實施例1制得的抗繆勒氏管激素化學發光免疫檢測試劑盒性能評價
[0128] 采用實施例2中的方法對抗繆勒氏管激素定標品進行檢測，得到繪制標準曲線如 圖1所示。
[0129] 靈敏度的檢測：
[0130] 參照CLSI EP17-A文件推薦實驗方案，計算AMH化學發光免疫試劑盒的靈敏度，求 得的靈敏度為〇. 〇〇6ng/mL。
[0131] 線性的檢測：
[0132] 對濃度為0.01ng/mL、0 ? 5ng/mL、2ng/mL、10ng/mL、25ng/mL 標準品做線性分析，計 算線性相關系數，r = 0.9991，另外，該試劑盒對AMH樣品檢測的線性范圍為0.01-25ng/mL。
[0133] 精密度測定：
[0134] 取濃度為0.1 ng/mL及10ng/mL兩個AMH樣品，每個樣本每個濃度各做3個平行，用三 批試劑盒進行檢測，計算試劑盒批內及批間差，結果表明該試劑盒批內及批間差均小于 5%〇
[0135] 干擾性實驗：
[0136] 取混合血清分別添加干擾物包括:結合膽紅素、游離膽紅素、血紅蛋白、抗壞血酸、 甘油酯，添加質量比按照1:20進行，分別測定混合血清及添加了各種干擾物后混合血清的 測值，計算二者之間的偏差，以±10%為可接受范圍。結果表明，干擾性均達到NCCLS的文件 標準，可用于臨床實驗室AMH狀況的準確評估。
[0137] 實施例4、抗繆勒氏管激素化學發光免疫檢測試劑盒的對比實驗
[0138] 分別用實施例2中的化學發光檢測方法和傳統的酶聯免疫吸附法對濃度為0、 50pg/mL的AMH樣品做檢測，對零濃度樣本進行20次重復測試，計算零濃度樣本的均值(M)和 SD，將M+2SD的RLU值帶入定標方程中，求出對應的濃度值，即為檢測靈敏度。兩種方法檢測 靈敏度相比，數據如下表所示：
[0140] 由上表可以看出，化學發光檢測方法的靈敏度較酶聯免疫吸附法提高了約50倍。
[0141] 實施例5:抗繆勒氏管激素化學發光免疫檢測試劑盒的制備
[0142] (1 )AMH單克隆抗體包被的磁顆粒的制備：
[0143] 取50mg粒徑為0.05mi~2wii的甲苯磺酰基化的磁微粒(Dynal，301100)懸浮液，磁 分離去上清，用PH9.0~11.0的硼酸鹽緩沖液重懸，加入lmg~3mg的AMH單克隆抗體 (Anshlabs，AA011)，加入0.5mL~2mL飽和硫酸銨溶液，37°C下旋轉混合反應20h~30h，磁分 離，去除上清，用含2%BSA的0.1M pH為8.0的Tris緩沖液重懸到lmg/mL，得到AMH單克隆抗 體包被的磁顆粒，每瓶5mL分裝保存于4°C備用。
[0144] (2)堿性磷酸酶標記的AMH單克隆抗體的制備：
[0145] 取500yL 2.0mg/mL的AMH單克隆標記抗體(Anshlabs，AA012)，加入500yL pH5.0的 MES酸性緩沖液，加入lmg堿性磷酸酶混勻，然后加入lmg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰 二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCL)交聯劑或加入lmg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸 鹽(EDC.HCL)及lmg N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)混合交聯劑，室溫下避光反應，lh~2h后取出， 離心脫鹽柱脫鹽處理，脫鹽過程中首先分別用純凈水及TBS緩沖液進行處理，收集脫鹽管中 的液體保存。將脫鹽液上AKTA蛋白純化系統進行純化，收集得到堿性磷酸酶標記的AMH單克 隆抗體，每瓶lmL分裝保存于4°C備用。
[0146] (3)AMH定標品的制備：
[0147] 用標準品緩沖液(40mM Tris-HCl，0.5%BSA，l%NaCl，pH 8.0)將人源化AMH蛋白 配置成濃度為〇ng/mL、0 ? 7ng/mL、2 ? 5ng/mL、4 ? 65ng/mL、13 ? 58ng/mL、28 ? 56ng/mL，每瓶 0.5mL分裝，經凍干處理后，4 °C保存備用。
[0148] 實施例6: AMH堿性磷酸酶化學發光免疫檢測方法
[0149] 本發明以全自動化學發光免疫分析儀和實施例5制得的抗繆勒氏管激素化學發光 免疫檢測試劑盒為檢測工具，本發明的方法學模式為夾心法，即儀器依次加入20此的樣品、 50yL的AMH單克隆抗體包被的磁顆粒以及50yL的堿性磷酸酶標記的AMH抗體，反應lOmin后， 進行磁分離，儀器將反應混合物送入暗室，加入AMPH)發光底物進行發光反應，最后記錄發 光強度，從標準曲線計算出被測樣品的AMH含量。
[0150]實施例7:實施例5制得的抗繆勒氏管激素化學發光免疫檢測試劑盒性能評價
[0151] 采用實施例6中的方法對抗繆勒氏管激素定標品進行檢測，得到繪制標準曲線如 圖2所示。
[0152] 靈敏度的檢測：
[0153] 參照CLSI EP17-A文件推薦實驗方案，計算AMH化學發光免疫試劑盒的靈敏度，求 得的靈敏度為〇.〇6ng/mL。
[0154]實施例8:抗繆勒氏管激素化學發光免疫檢測試劑盒的制備
[0155] (1 )AMH單克隆抗體包被的磁顆粒的制備。
[0156] 與實施例5中（1)一致。
[0157] (2)生物素標記AMH單克隆抗體的制備：
[0158] 取500yL 2.0mg/mL的AMH單克隆標記抗體，加入500yL pH8.0的磷酸鹽緩沖液，加 入O.lmg生物素琥珀酰亞胺(Biotin-NHS)混合，室溫下避光反應，1-2h后取出，離心脫鹽柱 脫鹽處理，脫鹽過程中首先分別用純凈水及TBS緩沖液進行處理，收集脫鹽管中的液體保 存。得到生物素標記的AMH單克隆抗體，每瓶lmL分裝保存于4°C備用。
[0159] (3)吖啶酯標記的鏈霉親和素的制備：
[0160] 取500此1.011^/1^的鏈霉親和素，加入500此0.1-0.21^119.0-9.5的碳酸鹽緩 沖液，混勻，然后加入10_20yL 5mg/mL的吖啶酯混勻，室溫下避光反應，1-2h后取出，用2mL 的zeba離心脫鹽柱脫鹽處理，脫鹽過程中首先分別用純凈水及TBS緩沖液進行處理，最后加 入得到的吖啶酯標記的鏈霉親和素，收集離心管中的液體至保存管得到吖啶酯標記的鏈霉 親和素，每瓶lmL分裝保存于4°C備用。
[0161 ] (4)吖啶酯標記的AMH單克隆抗體的制備:將生物素標記AMH單克隆抗體和吖啶酯 標記的鏈霉親和素按照4:1比例混合，得到吖啶酯標記的AMH單克隆抗體。
[0162] (5)AMH定標品的制備：
[0163]用標準品緩沖液(40mM Tris-HCl，0.5%BSA，l%NaCl，pH 8.0)將人源化AMH蛋白 配置成濃度為〇ng/mL、0 ? 7ng/mL、2 ? 5ng/mL、4 ? 65ng/mL、13 ? 58ng/mL、28 ? 56ng/mL，每瓶 0.5mL分裝，經凍干處理后，4 °C保存備用。
[0164] 實施例9:親和素-生物素系統免疫檢測AMH的方法
[0165] 以全自動化學發光免疫分析儀和實施例8制得的抗繆勒氏管激素化學發光免疫檢 測試劑盒為檢測工具，即儀器依次加入1〇此的樣品、50此的AMH單克隆抗體包被的磁顆粒以 及50此的生物素標記的AMH抗體、50此叮啶酯標記的鏈霉親和素，反應20min后，進行磁分 離，儀器將反應混合物送入暗室，依次加入發光底物A液(含0.1M HN03和0.5%H2〇2)及B液 (含0.25M NaOH)進行發光反應，最后記錄發光強度，從標準曲線計算出被測樣品的AMH含 量。
[0166] 實施例10:實施例8制得的抗繆勒氏管激素化學發光免疫檢測試劑盒性能評價
[0167] 靈敏度的檢測：
[0168] 參照CLSI EP17-A文件推薦實驗方案，計算AMH化學發光免疫試劑盒的靈敏度，求 得的靈敏度為〇. 〇〇lng/mL。
[0169] 以上所述實施例僅表達了本發明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并 不能因此而理解為對本發明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員 來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發明的保 護范圍。因此，本發明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。
【主權項】
1. 一種抗繆勒氏管激素化學發光免疫檢測試劑盒，其特征在于，包括:抗繆勒氏管激素 單克隆抗體包被的固相載體和化學發光標記物標記的抗繆勒氏管激素單克隆抗體。2. 根據權利要求1所述的抗繆勒氏管激素化學發光免疫檢測試劑盒，其特征在于，所述 抗繆勒氏管激素單克隆抗體包被的固相載體中，所述固相載體為表面帶有用于蛋白質化學 反應連接基團的磁微粒。3. 根據權利要求2所述的抗繆勒氏管激素化學發光免疫檢測試劑盒，其特征在于，所述 表面帶有用于蛋白質化學反應連接基團的磁微粒為表面帶有氨基、羧基、甲苯磺酰基或環 氧乙烷基的磁微粒。4. 根據權利要求2或3所述的抗繆勒氏管激素化學發光免疫檢測試劑盒，其特征在于， 所述表面帶有用于蛋白質化學反應連接基團的磁微粒的粒徑為〇. 〇5μηι~3μηι。5. 根據權利要求1所述的抗繆勒氏管激素化學發光免疫檢測試劑盒，其特征在于，所述 抗繆勒氏管激素單克隆抗體包被的固相載體中，所述固相載體上偶聯有鏈霉親和素、親和 素或中性親和素，所述抗繆勒氏管激素單克隆抗體上偶聯有生物素。6. 根據權利要求1所述的抗繆勒氏管激素化學發光免疫檢測試劑盒，其特征在于，所述 化學發光標記物標記的抗繆勒氏管激素單克隆抗體中，所述化學發光標記物為異魯米諾、 三聯吡啶釕、吖啶酯、堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶。7. 根據權利要求1或6所述的抗繆勒氏管激素化學發光免疫檢測試劑盒，其特征在于， 所述化學發光標記物標記的抗繆勒氏管激素單克隆抗體中，所述化學發光標記物上偶聯有 鏈霉親和素、親和素或中性親和素，所述抗繆勒氏管激素單克隆抗體上偶聯有生物素。8. 根據權利要求1或6所述的抗繆勒氏管激素化學發光免疫檢測試劑盒，其特征在于， 所述化學發光標記物標記的抗繆勒氏管激素單克隆抗體中，所述化學發光標記物與所述抗 繆勒氏管激素單克隆抗體通過化學反應鍵直接連接或通過蛋白交聯劑連接。9. 根據權利要求8所述的抗繆勒氏管激素化學發光免疫檢測試劑盒，其特征在于，所述 蛋白交聯劑選自碳酰二亞胺鹽和琥珀酰亞胺中的至少一種。10. 根據權利要求9所述的抗繆勒氏管激素化學發光免疫檢測試劑盒，其特征在于，所 述蛋白交聯劑選自1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基） 碳酰二亞胺鹽酸鹽、Ν-羥基琥珀酰亞胺和磺酸化Ν-羥基琥珀酰亞胺中的至少一種。11. 根據權利要求1所述的抗繆勒氏管激素化學發光免疫檢測試劑盒，其特征在于，還 包括抗繆勒氏管激素定標品。12. -種權利要求1~11中任一項所述的抗繆勒氏管激素化學發光免疫檢測試劑盒的 制備方法，其特征在于，包括如下步驟： 將抗繆勒氏管激素單克隆抗體和固相載體混合并充分反應，得到抗繆勒氏管激素單克 隆抗體包被的固相載體;以及 將化學發光標記物和抗繆勒氏管激素單克隆抗體混合并充分反應，得到化學發光標記 物標記的抗繆勒氏管激素單克隆抗體。13. 根據權利要求12所述的抗繆勒氏管激素化學發光免疫檢測試劑盒，其特征在于，所 述抗繆勒氏管激素單克隆抗體包被的固相載體中，所述固相載體為表面帶有用于蛋白質化 學反應連接基團的磁微粒； 所述將抗繆勒氏管激素單克隆抗體和固相載體混合并充分反應，得到抗繆勒氏管激素 單克隆抗體包被的固相載體的操作為:取表面帶有用于蛋白質化學反應連接基團的磁微粒 的懸浮液，磁分離去上清后用緩沖液重懸，接著活化劑活化所述表面帶有用于蛋白質化學 反應連接基團的磁微粒的表面連接基團，接著加入抗繆勒氏管激素單克隆抗體，室溫下充 分反應，磁分離去除上清后重懸，得到抗繆勒氏管激素單克隆抗體包被的表面帶有用于蛋 白質化學反應連接基團的磁微粒。14. 根據權利要求12所述的抗繆勒氏管激素化學發光免疫檢測試劑盒，其特征在于，所 述抗繆勒氏管激素單克隆抗體包被的固相載體中，所述固相載體上偶聯有鏈霉親和素、親 和素或中性親和素，所述抗繆勒氏管激素單克隆抗體上偶聯有生物素； 所述將抗繆勒氏管激素單克隆抗體和固相載體混合并充分反應，得到抗繆勒氏管激素 單克隆抗體包被的固相載體的操作為:將偶聯有鏈霉親和素、親和素或中性親和素的固相 載體和偶聯有生物素的抗繆勒氏管激素單克隆抗體在緩沖液中混合，充分反應后得到抗繆 勒氏管激素單克隆抗體包被的固相載體。15. 根據權利要求12所述的抗繆勒氏管激素化學發光免疫檢測試劑盒，其特征在于，所 述化學發光標記物標記的抗繆勒氏管激素單克隆抗體中，所述化學發光標記物上偶聯有鏈 霉親和素、親和素或中性親和素，所述抗繆勒氏管激素單克隆抗體上偶聯有生物素； 所述將化學發光標記物和抗繆勒氏管激素單克隆抗體混合并充分反應，得到化學發光 標記物標記的抗繆勒氏管激素單克隆抗體的操作為:將偶聯有鏈霉親和素、親和素或中性 親和素的化學發光標記物和偶聯有生物素的抗繆勒氏管激素單克隆抗體在緩沖液中混合， 充分反應后得到化學發光標記物標記的抗繆勒氏管激素單克隆抗體。16. 根據權利要求12所述的抗繆勒氏管激素化學發光免疫檢測試劑盒，其特征在于，所 述化學發光標記物標記的抗繆勒氏管激素單克隆抗體中，所述化學發光標記物與所述抗繆 勒氏管激素單克隆抗體通過化學反應鍵直接連接； 所述將化學發光標記物和抗繆勒氏管激素單克隆抗體混合并充分反應，得到化學發光 標記物標記的抗繆勒氏管激素單克隆抗體的操作為:將抗繆勒氏管激素單克隆抗體和化學 發光標記物在緩沖液中混合，充分反應后得到化學發光標記物標記的抗繆勒氏管激素單克 隆抗體。17. 根據權利要求12所述的抗繆勒氏管激素化學發光免疫檢測試劑盒，其特征在于，所 述化學發光標記物標記的抗繆勒氏管激素單克隆抗體中，所述化學發光標記物與所述抗繆 勒氏管激素單克隆抗體通過蛋白交聯劑連接； 所述將化學發光標記物和抗繆勒氏管激素單克隆抗體混合并充分反應，得到化學發光 標記物標記的抗繆勒氏管激素單克隆抗體的操作為:將抗繆勒氏管激素單克隆抗體、化學 發光標記物和蛋白交聯劑在緩沖液中混合，充分反應后得到化學發光標記物標記的抗繆勒 氏管激素單克隆抗體。18. -種抗繆勒氏管激素的濃度的檢測方法，采用如權利要求1~11中任一項所述抗繆 勒氏管激素化學發光免疫檢測試劑盒，其特征在于，所述抗繆勒氏管激素的濃度的檢測方 法包括如下步驟： 使用抗繆勒氏管激素單克隆抗體包被的固相載體和化學發光標記物標記的抗繆勒氏 管激素單克隆抗體對待測樣本進行夾心免疫試驗，所述待測樣本中的抗繆勒氏管激素與抗 繆勒氏管激素單克隆抗體包被的固相載體和化學發光標記物標記的抗繆勒氏管激素單克 隆抗體反應，形成夾心復合物，經過清洗分離后，測得待測樣本的發光強度； 使用抗繆勒氏管激素單克隆抗體包被的固相載體和化學發光標記物標記的抗繆勒氏 管激素單克隆抗體對抗繆勒氏管激素定標品進行夾心免疫試驗，所述抗繆勒氏管激素定標 品中的抗繆勒氏管激素與抗繆勒氏管激素單克隆抗體包被的固相載體和化學發光標記物 標記的抗繆勒氏管激素單克隆抗體反應，形成夾心復合物，經過清洗分離后，測得抗繆勒氏 管激素定標品的發光強度，根據所述抗繆勒氏管激素定標品的發光強度和所述抗繆勒氏管 激素定標品的濃度構建橫縱坐標分別為濃度和發光強度的抗繆勒氏管激素的標準曲線；以 及 將所述待測樣本的發光信號帶入所述抗繆勒氏管激素的標準曲線中，計算得到所述待 測樣本中的抗繆勒氏管激素的濃度。
【文檔編號】G01N33/543GK106053791SQ201610512550
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月30日
【發明人】夏福臻, 錢純亙, 王剛, 祝亮, 劉美婷
【申請人】深圳市亞輝龍生物科技股份有限公司