利用魚的sod活性檢測水體污染程度的方法
【專利摘要】本發明公開了一種利用魚的超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測水體污染程度的方法。本方法通過獲取需要檢測的水域中的魚，并采用所述魚的SOD作為敏感生物標記物，實現檢測待測水體的污染。本方法利用魚的SOD作為敏感生物標記物，可敏感地監測鎘等重金屬污染、菲(Phe)等多環芳烴污染及多氯聯苯(PCB)污染的污染程度和危害程度，為水體生態環境監測、毒理診斷、調控和防治提供準確、快速的科學方法。
【專利說明】
利用魚的SOD活性檢測水體污染程度的方法
技術領域
[0001] 本發明涉及利用生物敏感標志物檢測水體污染，更具體地說，本發明涉及一種利 用魚的S0D活性檢測水體污染程度的方法。
【背景技術】
[0002] 隨著城鎮化和工農業的迅猛發展，水體污染日益加劇。水域中的水體污染物也各 有不同，有的為單一污染物，也有多種污染物混合污染。對于未知水域中，不管是單一污染 物的污染，還是多種污染物的污染，怎樣獲悉水體是否被污染，甚至知道其污染程度，并能 直觀判斷該水域的污染對生物的危害已達到何種程度。對于水體中受到重金屬或菲一種或 兩種污染時，用化學方法可以定性、定量檢測到污染，但是無法檢測其危害性和危害程度以 及污染程度的準確性。
【發明內容】
[0003] 本發明的一個目的是解決至少上述問題和/或缺陷，并提供至少后面將說明的優 點。
[0004] 本發明還有一個目的就是提供一種利用魚的S0D活性檢測水體污染程度的方法， 本方法利用魚的S0D作為敏感生物標記物，可敏感地監測鎘等重金屬污染的污染程度和危 害程度，還可以敏感檢測菲(Phe)等多環芳烴污染的污染程度和危害程度，為水體生態環境 監測、毒理診斷、調控和防治提供準確、快速的科學方法。
[0005] 為了實現根據本發明的這些目的和其他優點，提供了一種利用魚的S0D活性檢測 水體污染程度的方法。本檢測方法為獲取需要檢測的水域中的魚，并采用所述魚的S0D作為 敏感生物標記物。其中，S0D是超氧化物歧化酶的簡寫。
[0006] 優選的是，所述魚的S0D活性與水體中重金屬鎘的濃度呈負相關。
[0007]優選的是，所述魚的S0D活性與水體中菲的濃度呈負相關。
[0008]優選的是，所述魚的S0D活性與水體中多氯聯苯的濃度呈負相關。
[0009] 優選的是，建立魚的S0D活性與污染物濃度關系的標準曲線，然后將待檢測水域中 的同種同大小的魚的S0D活性與所述標準曲線比對，得到待檢測水域中水體污染物濃度。
[0010] 優選的是，所述標準曲線為魚的S0D活性與重金屬鎘濃度關系的曲線，或者魚的 S0D活性與菲濃度關系的曲線，或者魚的S0D活性與多氯聯苯濃度關系的曲線。
[0011]優選的是，所述魚的S0D活性測定包括如下步驟：
[0012] 步驟一、待測樣本處理:制備全魚勻漿，然后離心分層，取上層清液為待測樣本；
[0013] 步驟二、待測樣本蛋白濃度的測定:分別將等量的雙蒸水、蛋白標準品和待測樣本 加入1、2、3號管中，并分別向各管加入等量的考馬斯亮藍顯色劑，分別混勻，靜置，預熱，用 分光光度計并用雙蒸水調零后，于lcm光徑，在波長595nm處，測定1、2、3號管中物質的光密 度(0D)，分別記為1號0D值，2號0D值，3號0D值，然后代入如下公式計算得待測樣本蛋白濃 度：
[0014]
[0015]步驟三、在對照管和測定管中各加入試劑盒的同樣量的試劑一、試劑二、試劑三和 試劑四，然后在所述測定管中加入待測樣本Ami，在所述對照管中加入蒸餾水Ami，混合均勻 后置38 °C恒溫水浴35-40分鐘；
[0016]步驟四、在所述對照管和所述測定管中各加入等量的顯色劑，混勻，室溫靜置10分 鐘，于波長550nm處，lcm光徑比色杯，蒸餾水調零后，分別測所述對照管和測定管0D，分別記 為對照0D值，測定0D值，其中取量為A，然后代入如下公式計算得魚的S0D活性：
[0017]
[0018] 優選的是，所述步驟一中全魚勻漿為全魚與濃度0.65%的魚用生理鹽水按質量比 為1:9配置，且所述離心分層用冷凍離心機，11028g，4°C，離心10min。
[0019]優選的是，所述步驟二中等量的雙蒸水、蛋白標準品和待測樣本均為0.05ml，蛋白 標準品的濃度為〇.563g/L，分別加入考馬斯亮藍顯色劑的量均為3ml，靜置lOmin;所述步驟 三中分別給對照管和測定管中加入試劑盒的試劑一lml，試劑二0. lml，試劑三0. lml，試劑 四0.1ml，然后混合均勻用漩渦混勻器混合，恒溫水浴36分鐘；所述步驟四中在所述對照管 和所述測定管中各加入考馬斯亮藍顯色劑2ml。
[0020] 優選的是，所述魚為海水青鏘或淡水青鏘。
[0021] 本發明至少包括以下有益效果:本發明以水域中魚的S0D作為敏感生物標記物，通 過對比S0D活性就可以檢測出水體是否受到污染，不但檢測準確和敏感，而且直觀反映該水 域的污染對生物的危害程度。特別是魚的S0D活性與水體中重金屬鎘、菲或多氯聯苯的一種 或一種以上的濃度均呈負相關，所以檢測到魚的S0D活性越低，其的水域受污染的程度越 大，并且明示受到重金屬鎘、菲或多氯聯苯的一種或一種以上的污染。通過建立魚的S0D活 性與重金屬鎘濃度關系的標準曲線，魚的S0D活性與菲濃度關系的曲線，或者魚的S0D活性 與多氯聯苯濃度關系的曲線，可以將待檢測水域中與建立標準曲線同種同大小的魚的S0D 活性比對，獲得水域中重金屬鎘濃度、菲或多氯聯苯濃度或綜合污染濃度值，并且能反映出 目前的污染程度對生物是否在安全范圍或受到危害。
【具體實施方式】
[0022] 下面結合實施例對本發明做進一步的詳細說明，以令本領域技術人員參照說明書 能夠據以實施。
[0023] 實施例1
[0024]本方案利用魚的S0D活性檢測水體污染程度的方法，獲取需要檢測的水域中的魚， 并采用所述魚的S0D作為敏感生物標記物，通過檢測魚的S0D活性，然后比對同類同大小的 魚的S0D活性與某污染物濃度關系的標準曲線，就可以檢測出水體是否受到某污染物的污 染，不但檢測準確，且敏感度高，而且能直觀反映該水域的某污染物的污染程度及其對生物 的危害程度。
[0025] 實施例2
[0026] 本方案利用魚的S0D活性檢測水體污染程度的方法，獲取需要檢測的水域中的魚， 并采用所述魚的S0D作為敏感生物標記物，根據魚的S0D活性與水體中重金屬鎘的濃度呈負 相關，通過測定魚的S0D活性，然后比對同類同大小的魚的S0D活性與鎘濃度關系的標準曲 線，如果檢測樣本魚的S0D活性比正常情況下的同類同大小的魚的S0D活性低，則判斷水域 受到鎘的污染;魚的S0D活性越低，則判斷水域的鎘污染越嚴重，甚至可判斷是否達到危害 水體生物的程度。
[0027] 實施例3
[0028] 本方案利用魚的S0D活性檢測水體污染程度的方法，獲取需要檢測的水域中的魚， 并采用所述魚的S0D作為敏感生物標記物，根據魚的S0D活性與水體中菲(Phe)等多環芳烴 的濃度呈負相關，通過測定魚的S0D活性，然后比對同類同大小的魚的S0D活性與菲濃度關 系的標準曲線，如果檢測樣本魚的S0D活性比正常情況下的同類同大小的魚的S0D活性低， 則判斷水域受到菲的污染;魚的S0D活性越低，則判斷水域的菲污染越嚴重，甚至可判斷是 否達到危害水體生物的程度。
[0029] 實施例4
[0030] 本方案利用魚的S0D活性檢測水體污染程度的方法，獲取需要檢測的水域中的魚， 并采用所述魚的S0D作為敏感生物標記物，根據魚的S0D活性與水體中多氯聯苯的濃度呈負 相關，通過測定魚的S0D活性，然后比對建立標準曲線的魚同類同大小的魚的S0D活性與多 氯聯苯濃度關系的標準曲線，如果檢測樣本魚的S0D活性比正常情況下的同類同大小的魚 的S0D活性低，則判斷水域受到多氯聯苯的污染;魚的S0D活性越低，則判斷水域的多氯聯苯 污染越嚴重，甚至可判斷是否達到危害水體生物的程度。
[0031] 實施例5
[0032] 本方案利用魚的S0D活性檢測水體污染程度的方法，獲取需要檢測的水域中的魚， 并采用所述魚的S0D作為敏感生物標記物。首先通過實驗建立魚的S0D活性與某污染物濃度 關系的標準曲線，然后將待檢測水域中的同種同大小的魚的S0D活性與所述標準曲線比對， 得到待檢測水域中某污染物的濃度。
[0033]通過實驗建立魚的S0D活性與重金屬鎘濃度關系的標準曲線如下：
[0034]本實驗的檢測樣本以海水青鏘為例，分十組，每組3個平行進行養魚實驗，實驗結 束每個平行取3個樣品測定，每組測定3x3 = 9個數據，將每組9個數據數理統計后得到每組 魚的S0D活性大小。各組鎘濃度分別為0，80，160，240，320，400，480，560，640，720yg/L，養殖 條件是鹽度30 ± 2，水溫為28 ± 2°C，pH為8.10，溶氧量彡6.10mg/L，光暗比為14h: 10h，各組 實驗操作均相同。每天投喂飼料三次，總投喂量為投喂時魚體濕重的5 %。每天仔細觀察和 記錄仔稚魚活動、攝食、畸形、死亡等，并跟蹤檢測水體和魚體鎘的變化，7天后隨機采集魚 樣品，分別稱重，存于_80°C冰箱中（因忙未能即測）用于分子、基因、生理、毒理和生化測定。 測定并經數理統計的各組S0D活性分別是：202.37、187.81、176.16、158.78、148.64、 135.19、118.56、101.38、87.63、78.25U/mgprot。海水青鏘的S0D活性與水體中重金屬鎘的 濃度呈負相關，然后根據實驗結果繪制標準曲線。
[0035] 通過實驗建立魚的SOD活性與菲(Phe)濃度關系的標準曲線如下：
[0036] 本實驗的檢測樣本以海水青鏘為例，分五組，每組3個平行進行養魚實驗，實驗結 束每個平行取3尾魚樣品測定，每組測定3x3 = 9個數據，將每組9個數據數理統計后得到每 組魚的S0D活性大小。各組菲濃度分別為0、250、500、750、1000yg/L，養殖條件是鹽度30 ± 2， 水溫為28 ± 2°C，pH為8.10，溶氧量彡6.10mg/L，光暗比為14h: 10h，各組實驗操作均相同。每 天三次投喂飼料，總投喂量為投喂時魚體濕重的5%。每天仔細觀察和記錄仔稚魚活動、攝 食、畸形、死亡等，并跟蹤檢測水體和魚體菲的變化，7天后隨機采集魚樣品，分別稱重，存 于-80°C冰箱中（暫存待測）用于分子、基因、生理、毒理和生化測定。測定并經數理統計的各 組 S0D 活性分別是：130.486、112.282、101.537、81.514、53.829U/mgprot。海水青鏘的 S0D 活 性與水體中菲(Phe)的濃度呈負相關，然后根據實驗結果繪制標準曲線。
[0037]通過實驗建立魚的S0D與多氯聯苯(PCB)濃度關系的標準曲線如下：
[0038]本實驗的檢測樣本以海水青鏘為例，分六組，每組3個平行進行養魚實驗，實驗結 束每個平行取3尾魚樣品測定，每組測定3x3 = 9個數據，將每組9個數據數理統計后得到每 組魚的S0D活性大小。各組多氯聯苯濃度分別為0、50、100、150、200、250yg/L，養殖條件是鹽 度30 ± 2，水溫為28 ± 2 °C，pH為8.10，溶氧量彡6.10mg/L，光暗比為14h: 10h，各組實驗操作 均相同。每天三次投喂飼料，總投喂量為投喂時魚體濕重的5%。每天仔細觀察和記錄仔稚 魚活動、攝食、畸形、死亡等，并跟蹤檢測水體和魚體多氯聯苯的變化，7天后隨機采集魚樣 品，分別稱重，存于-80°C冰箱中（暫存待測）用于分子、基因、生理、毒理和生化測定。測定并 經數理統計的各組 S0D 活性分別是：9.503、7.760、6.012、4.530、3.349、3.035U/mgprot<^$ 水青鏘的SOD活性與水體中多氯聯苯(PCB)的濃度呈負相關，然后根據實驗結果繪制標準曲 線。
[0039]測定待測水域中的海水青鏘的S0D活性的具體步驟如下：
[0040] 步驟一、待測樣本處理:制備全魚勻漿，然后離心分層，取上層清液為待測樣本；
[0041] 步驟二、待測樣本蛋白濃度的測定:分別將等量的雙蒸水、蛋白標準品和待測樣本 加入1、2、3號管中，并分別向各管加入等量的考馬斯亮藍顯色劑，分別混勻，靜置，預熱，用 分光光度計并用雙蒸水調零后，于lcm光徑，在波長595nm處，測定1、2、3號管中物質的0D，分 另IJ記為1號0D值，2號0D值，3號0D值，然后代入如下公式計算得待測樣本蛋白濃度：
[0042]
[0043]步驟三、在對照管和測定管中各加入試劑盒的同樣量的試劑一，試劑二，試劑三和 試劑四，然后在所述測定管中加入待測樣本Ami，在所述對照管中加入蒸餾水Ami，混合均勻 后置38 °C恒溫水浴35分鐘；
[0044]步驟四、在所述對照管和所述測定管中各加入等量的顯色劑，混勻，室溫靜置10分 鐘，于波長550nm處，lcm光徑比色杯，蒸餾水調零分別測所述對照管和所述測定管0D，分別 記為對照0D值，測定0D值，其中取量為A，然后代入如下公式計算得魚的超氧化物歧化酶活 性：
[0046] 然后將計算得海水青鏘的SOD活性大小與標準曲線比對，不但可以知道水體是否 受到污染，而且從標準曲線中可以知道水體中鎘濃度或菲濃度的大小或多氯聯苯濃度大小 或綜合污染的大小，更能知道水體對生物體危害程度。
[0047] 實施例6
[0048]利用實驗可以建立任何水體任何魚種的魚的S0D活性與重金屬鎘濃度關系的標準 曲線，或者建立不同種類的魚的S0D活性與菲濃度關系的標準曲線，然后取待測水域中的魚 做樣本，只要做樣本的魚與建立標準曲線的魚是同類同大小的即可進行比對。
[0049] 測定待測水域中的魚的S0D活性具體步驟如下：
[0050] 步驟一、待測樣本處理:取與建立標準曲線用魚一樣和大小相當的魚制備全魚勻 漿，全魚勻漿為全魚與0.65%濃度的魚用生理鹽水按質量比為1:9配置，然后用冷凍離心 機，11028g，4°C，離心10min分層，取上層清液為待測樣本；
[0051]步驟二、待測樣本蛋白濃度的測定:分別將等量的雙蒸水、蛋白標準品和待測樣本 加入1、2、3號管中，并分別向各管加入等量的考馬斯亮藍顯色劑，分別混勻，靜置，預熱，用 分光光度計并用雙蒸水調零后，于lcm光徑，在波長595nm處，測定1、2、3號管中物質的0D，分 另IJ記為1號0D值，2號0D值，3號0D值，然后代入如下公式計算得待測樣本蛋白濃度：
[0052]
[0053] 步驟三、在對照管和測定管中各加入試劑盒的試劑一3ml，試劑二0.3ml，試劑三 0.3ml和試劑四0.3ml，然后在所述測定管中加入待測樣本lml，在所述對照管中加入蒸餾水 lml，混合均勻后置38°C恒溫水浴40分鐘；
[0054] 步驟四、在所述對照管和測定管中各加入等量的顯色劑，混勻，室溫靜置10分鐘， 于波長550nm處，lcm光徑比色杯，蒸餾水調零后，分別測所述對照管和測定管0D，分別記為 對照0D值，測定0D值，其中取量為1，然后代入如下公式計算得魚的S0D活性：
[0055]
[0056] 將計算得魚的S0D活性大小與標準曲線比對，不但可以知道水體是否受污染，而且 從標準曲線中可以知道水體中鎘濃度或菲濃度或多氯聯苯(PCB)濃度的大小或綜合污染的 大小，更能知道水體對生物體危害程度。
[0057] 實施例7
[0058]利用實驗建立20日齡的淡水青鏘的S0D活性與重金屬鎘濃度關系的標準曲線以及 S0D活性與菲濃度的標準曲線，然后取待測水域中的魚做樣本，只要取得樣本的魚與建立標 準曲線的魚是同類同大小的即可進行比對。
[0059] 取得待測水域中20日齡的淡水青鏘做樣本，然后測定待測水域中的該魚的SOD活 性具體步驟如下：
[0060] 步驟一、待測樣本處理:取與建立標準曲線用魚一樣和大小相當的魚制備全魚勻 漿，全魚勻漿為全魚與0.65%濃度的魚用生理鹽水按質量比為1:9配置，然后用冷凍離心 機，11028g，4°C，離心10min分層，取上層清液為待測樣本；
[0061] 步驟二、待測樣本蛋白濃度的測定:分別將雙蒸水、濃度為0.563g/L的蛋白標準品 和待測樣本各〇.〇5ml加入1、2、3號管中，并分別向各管加入考馬斯亮藍顯色劑3ml，分別混 勻，靜置lOmin，預熱到35°C，預熱待用分光光度計并用雙蒸水調零后，于lcm光徑，波長 595nm處，測定1、2、3號管中溶液的0D，分別記為1號0D值，2號0D值，3號0D值，然后代入如下 公式計算得待測樣本蛋白濃度：
[0062]
[0063] 步驟三、在對照管和測定管中各加入試劑盒的試劑一lml，試劑二0.1ml，試劑三 0. lml和試劑四0. lml，然后在所述測定管中加入待測樣本0.5ml，在所述對照管中加入蒸餾 水0.5ml，用漩渦混勻器混合均勻后，置38°C恒溫水浴36分鐘；
[0064]步驟四、在所述對照管和所述測定管中各加入考馬斯亮藍顯色劑2ml，混勻，室溫 靜置10分鐘，于波長550nm處，lcm光徑比色杯，蒸餾水調零分別測所述對照管和所述測定管 0D，分別記為對照0D值，測定0D值，其中取量為0.5，所用試劑盒為南京生物工程研究所生產 的試劑盒，試劑盒中的各個試劑是固定配置好的，然后代入如下公式計算得魚的S0D活性， 計算得魚的S0D活性為100 ? 5U/mgprot:
[0065]
[0066] 將計算得魚的S0D活性，分別與S0D活性與重金屬鎘濃度的標準曲線、S0D活性與菲 濃度的標準曲線、S0D活性與多氯聯苯濃度的標準曲線比對，得到待測水域的鎘污染濃度 為，552yg/L，菲濃度為451yg/L，多氯聯苯濃度為0yg/L，這樣既可以知道水體已受到污染， 而且從標準曲線中可以知道水體中鎘濃度、菲或多氯聯苯濃度的大小，更能知道水體對生 物體危害程度。
[0067] 盡管本發明的實施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實施方式中所列 應用范例，它完全適用于各種適合本發明的領域，對于熟悉本領域的人員而言，可容易地另 行修改他用，因此在不背離權利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發明并不限于特 定的細節和這里示出與描述的實施例。
【主權項】
1. 一種利用魚的SOD活性檢測水體污染程度的方法，其特征在于，獲取需要檢測的水域 中的魚，并采用所述魚的SOD作為敏感生物標記物。2. 根據權利要求1所述的利用魚的SOD活性檢測水體污染程度的方法，其特征在于，所 述魚的SOD活性與水體中重金屬鎘的濃度呈負相關。3. 根據權利要求1所述的利用魚的SOD活性檢測水體污染程度的方法，其特征在于，所 述魚的SOD活性與水體中菲的濃度呈負相關。4. 根據權利要求1所述的利用魚的SOD活性檢測水體污染程度的方法，其特征在于，所 述魚的SOD活性與水體中多氯聯苯的濃度呈負相關。5. 根據權利要求1-4任一項所述的利用魚的SOD活性檢測水體污染程度的方法，其特征 在于，建立魚的SOD活性與污染物濃度關系的標準曲線，然后將待檢測水域中的同種同大小 的魚的SOD活性與所述標準曲線比對，得到待檢測水域中水體污染物濃度。6. 根據權利要求5所述的利用魚的SOD活性檢測水體污染程度的方法，其特征在于，所 述標準曲線為魚的SOD活性與重金屬鎘濃度關系的曲線，或者魚的SOD活性與菲濃度關系的 曲線，或者魚的SOD活性與多氯聯苯濃度關系的曲線。7. 根據權利要求6所述的利用魚的SOD活性檢測水體污染程度的方法，其特征在于，所 述魚的SOD活性測定包括如下步驟： 步驟一、待測樣本處理:制備全魚勻漿，然后離心分層，取上層清液為待測樣本； 步驟二、待測樣本蛋白濃度的測定:分別將等量的雙蒸水、蛋白標準品和待測樣本加入 1、2、3號管中，并分別向各管加入等量的考馬斯亮藍顯色劑，分別混勻，靜置，預熱，用分光 光度計并用雙蒸水調零后，于lcm光徑，在波長595nm處，測定1、2、3號管中物質的光密度，分 另IJ記為1號0D值，2號0D值，3號0D值，然后代入如下公式計算得待測樣本蛋白濃度：步驟三、在對照管和測定管中各加入試劑盒的同樣量的試劑一，試劑二，試劑三和試劑 四，然后在所述測定管中加入待測樣本Ami，在所述對照管中加入蒸餾水Ami，混合均勻后置 38 °C恒溫水浴35-40分鐘； 步驟四、在所述對照管和所述測定管中各加入等量的顯色劑，混勻，室溫靜置10分鐘， 于波長550nm處，lcm光徑比色杯，蒸餾水調零后，分別測所述對照管和測定管0D，分別記為 對照0D值，測定0D值，其中取量為A，然后代入如下公式計算得魚的SOD活性：8. 根據權利要求7所述的利用魚的SOD活性檢測水體污染程度的方法，其特征在于，所 述步驟一中全魚勻漿為全魚與濃度0.65%的魚用生理鹽水按質量比為1:9配置，且所述離 心分層用冷凍離心機，ll〇28g，4°C，離心10min。9. 根據權利要求7所述的利用魚的SOD活性檢測水體污染程度的方法，其特征在于，所 述步驟^中等量的雙蒸水、蛋白標準品和待測樣本均為〇 . 〇 5m 1，蛋白標準品的濃度為 0.563g/L，分別加入考馬斯亮藍顯色劑的量均為3ml，靜置lOmin;所述步驟三中分別給對照 管和測定管中加入試劑盒的試劑一lml，試劑二0. lml，試劑三0. lml，試劑四0. lml，然后用 漩渦混勻器混合均勻，恒溫水浴36分鐘;所述步驟四中在所述對照管和所述測定管中各加 入考馬斯亮藍顯色劑2ml。10.根據權利要求6-9任一項所述的利用魚的SOD活性檢測水體污染程度的方法，其特 征在于，所述魚為海水青鏘或淡水青鏘。
【文檔編號】G01N33/18GK106053750SQ201610546713
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年7月12日
【發明人】許友卿, 丁兆坤, 劉陽, 李云杰, 劉富娟, 張仁珍
【申請人】廣西大學