口服獨一味后大鼠血漿中胡麻屬苷含量的測定方法

口服獨一味后大鼠血漿中胡麻屬苷含量的測定方法
【專利摘要】本發明涉及醫藥學檢測技術領域，特別是中成藥體內代謝研究技術領域，具體是一種口服獨一味后大鼠血漿中胡麻屬苷成分的確定及其含量測定方法，含量測定方法是采用高效液相色譜質譜聯用檢測方法，在所建立的檢測方法下對口服獨一味后大鼠血漿中胡麻屬苷成分進行含量測定。本發明含量測定方法的精密度高，重現性佳，穩定性好，測定結果準確可靠，可有效評價獨一味中的胡麻屬苷在生物體內的藥動學過程。
【專利說明】
口服獨一味后大鼠血漿中胡麻屬苷含量的測定方法
技術領域
[0001] 本發明涉及醫藥學檢測技術領域，特別是中成藥體內代謝研究技術領域，具體地 說，是口服獨一味后大鼠血漿中胡麻屬苷的鑒定及含量測定方法。
【背景技術】
[0002] 獨一味是中國傳統中藥，其植物全草收錄于《中國藥典》2005版，其地上部分收錄 于《中國藥典》2010版，具有活血化瘀、消腫止痛的作用。用于術后的刀口疼痛、出血、骨質疏 松、風濕及血瘀腫脹等癥狀，在止血和凝血方面具有確切的療效。
[0003] 根據文獻報道，獨一味的主要生物活性成分是環烯醚萜類、黃酮類和苯乙醇苷類 化合物。2005版《中國藥典》中指標成分為木犀草素，藥用部位為全草，即地上部分和根、根 莖部分;2010版《中國藥典》中指標成分變更為山梔苷甲酯和8-乙酰山梔苷乙酯，藥用部位 為地上部分。指標成分和入藥部位的變更論證尚屬空白，且2010版《中國藥典》未提及同樣 具有藥理活性的環烯醚萜苷類化合物。為明確其有效成分在體內的代謝過程，必須建立一 套對服用獨一味后血漿中活性成分的濃度進行監測的方法，為獨一味的后續研究工作提供 可靠依據。
[0004] 通過文獻調研發現，目前對于獨一味中的主要生物活性成分研究已經比較清楚， 且隨著中藥領域技術的發展，中藥成分藥代動力學參數的重要性日益顯現，但是僅有一篇 報道獨一味所含4種環烯醚萜類化合物在生物體內的代謝過程，闡明其濃度隨時間的變化 情況（P.C.Fan，M.X.Li，H.P.Ma，L.L.Jing，J.G.Qiu，Z.P.Jia,Simultaneous determination of four shanzhiside methylester derivatives in rabbit plasma by liquid chromatography/tandem mass spectrometry.Biomed.Chromatogr.26(2012) 1543-1551.)，該方法是在正離子模式下將[M+Na]+峰作為母離子進行檢測，但[M+Na]+峰結 合一般較穩定，較難以裂解形成子離子。
[0005] 潘正等公開了采用高效液相色譜法測定獨一味根中胡麻屬苷等6種化學成分的方 法(潘正，高運玲，張濤，鄧杰.HPLC法測定獨一味根中環烯醚萜苷和苯乙醇苷[J].中草藥， 2011，42(2) :279-281 .)，但采用此方法無法檢測服藥后血漿中胡麻屬苷的含量。
[0006] 目前關于一種口服獨一味后大鼠血漿中胡麻屬苷成分的確定及其含量測定方法 還未見報道。

【發明內容】

[0007] 本發明的目的是提供一種口服獨一味后大鼠血漿中藥物成分的確定及其含量測 定方法。
[0008] 為了對獨一味開展藥動學研究，本發明對比了大鼠服用獨一味藥材地上部分和全 草后血漿所含藥物成分的種類差別，并且建立大鼠血漿中胡麻屬苷的含量測定方法。獨一 味進入體內后，血液中主要存在環烯醚萜類、苯乙醇苷類、黃酮類、糖類化合物，包括原型及 其代謝產物，其數量眾多，結構類似，對各物質的定量檢測帶來了較大的難度。
[0009] 技術方案：（1)采用液質聯用技術(LC-MS)確定胡麻屬苷和替硝唑對照品的質譜條 件；（2)優化色譜條件，使對照品溶液中胡麻屬苷和替硝唑達到基線分離；（3)以替硝唑為內 標，測定大鼠血漿中胡麻屬苷的含量。具體步驟如下：
[0010] ①選取替硝唑為本次實驗的內標。
[0011] ②胡麻屬苷和替硝唑對照品質譜檢測條件：胡麻屬苷465.2-257.2，替硝唑246.0 -125.9〇
[0012]③液相色譜分離條件:Agilent 1200 HPLC液相色譜儀，反相色譜柱，柱溫為35°C， 流動相為:酸性乙腈(A)和酸性水(B)，流速為0.4mL/min，進樣體積為10yL，梯度洗脫，檢測 時間為5min。后運行時間為5min。
[0013]④LC-MS參數:Agilent 6410 QQQ質譜系統，離子化方式為電噴霧條件，采用負離 子條件下MRM模式，內標為替硝唑，干燥氣流速為10L/min，干燥氣溫度為350°C，霧化氣壓力 為40psi，毛細管電壓為4000V。
[0014] ⑤基于LC-MS系統，采用內標法對獨一味中胡麻屬苷進行含量測定。
[0015] ⑥方法學驗證:仔細考察測試方法的基質效應、提取回收率、精密度和穩定性。
[0016] 本發明的目的是通過如下方案實現的：
[0017] 本發明具體提供了一種口服獨一味后大鼠血漿中胡麻屬苷含量的測定方法，包括 以下步驟：
[0018] (a)血漿的處理：取O.lmL大鼠血漿置于1.5mL EP管中，加入0.3mL甲醇溶液（含 0.1 %甲酸(v/v)和200ng/mL替硝唑內標），禍旋混勾3min，再以13000rpm離心10min，取上清 液0.2mL，于37 °C氮氣流吹干，再以0.4mL初始流動相（酸性乙腈和酸性水，8:92，v/v)復溶， 取10此作為血漿測試樣品；
[0019] (b)精密吸取步驟(a)得到的血漿測試樣品注入高效液相色譜-質譜聯用儀，內標 法定量，測得血漿中胡麻屬苷的含量;其中，
[0020] 液相條件為:Agilent 1200HPLC液相色譜儀，反相色譜柱，柱溫為35°C，流動相為： 酸性乙腈和酸性水，流速為0.4mL/min，進樣體積為10yL，梯度洗脫，檢測時間為5min;后運 行時間為5min;所述的酸性乙腈和酸性水中，加入的酸均為甲酸，濃度為0.1% (v/v);
[0021 ] 所述的反相色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18色譜柱，具體規格為2. ImmX 100mm， 填料為3.5ym。
[0022] 所述的梯度洗脫過程為:8-40 %有機相酸性乙腈A(〇-lmin)，40-95 %有機相酸性 乙腈A(l-4min)，95%有機相酸性乙腈A(4-5min)。
[0023]質譜條件為:Agilent 6410 QQQ質譜系統，離子化方式為電噴霧條件，采用負離子 條件下MRM模式，內標為替硝唑，干燥氣流速為10L/min，干燥氣溫度為350°C，霧化氣壓力為 40psi，毛細管電壓為4000V。
[0024]所述的質譜檢測為多反應監測模式，反應離子對分別為：胡麻屬苷465.2-257.2， 替硝唑 246.0-125.9。
[0025]所述的大鼠血漿的制備方法包括以下步驟：
[0026] (a)將獨一味地上部分或全草加入4-5倍體積的50 %乙醇水溶液(v/v)提取3次，每 次30min，得獨一味的提取物。所得提取物溶于適量0.5%CMC-Na溶液(w/v)，得50mg/mL的溶 液，以灌胃方式給大鼠（250 ± 20g)獨一味溶液0.8g/kg;
[0027] (b)分別在給藥后5min、15min、0 ? 5h、lh、1 ? 5h、2h、3h、4h、6h、8h、12h 和24h 從大鼠 眼眶取血0.3mL，置于1.5mL肝素化的聚乙烯管中，立即在4°C恒溫離心1 Omin，轉速4000 X g， 得到口服獨一味后的大鼠血漿。
[0028] 對照品溶液的制備:精密稱取胡麻屬苷對照品，溶于甲醇，加入內標替硝唑得儲備 液。以空白血漿和10%甲醇(MeOH)(V/v)稀釋成不同濃度的標準溶液，得濃度分別為4.00， 10 ? 00，30 ? 00，50 ? 00，100 ? 00，150 ? 00，250ng/mL 的胡麻屬苷溶液。
[0029]本發明優點在于：
[0030] 1、本發明以獨一味中的胡麻屬苷成分為指標，建立了大鼠口服獨一味后胡麻屬苷 在血漿中濃度隨時間變化的情況進行了研究，為獨一味藥物體內藥動學過程研究提供了依 據；
[0031] 2、本發明首次公開了大鼠服用獨一味后，血漿中胡麻屬苷的測定方法，使對獨一 味的藥動學研究上了 一個新臺階。
[0032] 3、本發明含量測定方法的精密度高，重現性佳，穩定性好，測定結果準確可靠，可 有效評價獨一味中的胡麻屬苷在生物體內的藥動學過程。
【附圖說明】
[0033] 圖1是口服獨一味地上部分后，大鼠血漿中胡麻屬苷檢測圖。
[0034]圖2是條件優化時，乙腈-水(含0.1 %甲酸)流動相系統的色譜圖。
[0035] 圖3是條件優化時，甲醇-水(含0.1%甲酸)流動相系統的色譜圖。
[0036] 圖4是條件優化時，Agilent Zorbax色譜柱的色譜圖。
[0037] 圖5是條件優化時，Waters BEH色譜柱的色譜圖。
[0038] 圖6是條件優化時，Agilent Proshell色譜柱的色譜圖。
[0039] 圖7是條件優化時，6%有機相為初始流動相的色譜圖。
[0040] 圖8是條件優化時，8%有機相為初始流動相的色譜圖。
[0041 ]圖9是條件優化時，乙腈為沉淀劑的色譜圖。
[0042]圖10是條件優化時，乙腈(含0.1 %甲酸)為沉淀劑的色譜圖。
[0043] 圖11是條件優化時，甲醇為沉淀劑的色譜圖。
[0044] 圖12是條件優化時，甲醇(含0.1 %甲酸)為沉淀劑的色譜圖。
[0045] 圖13是條件優化時，丙酮為萃取劑的色譜圖。
[0046] 圖14是條件優化時，二氯甲烷為萃取劑的色譜圖。
[0047]圖15是條件優化時，乙酸乙酯為萃取劑的色譜圖。
[0048]圖16是條件優化時，正丁醇為萃取劑的色譜圖。
[0049]圖17是條件優化時，乙酸乙酯和二氯甲烷(1:2)為萃取劑的色譜圖。
[0050]圖18是條件優化時，乙酸乙酯和二氯甲烷(1:1)為萃取劑的色譜圖。
[0051]圖19是條件優化時，乙酸乙酯和二氯甲烷(2:1)為萃取劑的色譜圖。
[0052]圖20是胡麻屬苷標準品溶液檢測圖。
[0053]圖21是空白血漿中胡麻屬苷檢測圖。
[0054]圖22是胡麻屬苷的LL0Q圖。
【具體實施方式】
[0055]下面結合實施例對本發明提供的【具體實施方式】作詳細說明。
[0056]實施例中采用的儀器和試藥：
[0057] Agilent 1200高效液相色譜儀串聯6410質譜儀(Agilent，美國）、AgilentZorbax 58-(：18色譜柱（3.5_，2.1\100111111)、￥乂-200渦旋混合器（美國，1^13116〇、41168抑父-151?離 心機（美國，Beckman Coulter)、SK7200H超聲儀（上海科島）、BSA124S-CW電子天平（德國， Sartorius)、Gilson移液器（美國）。
[0058] 乙腈（德國，Merck)、甲醇（德國，Merck)、甲酸（美國，Tedia)，均為色譜純，水由 M i 11 i -Q超純水系統制得。
[0059] 胡麻屬苷對照品由實驗室從獨一味藥材中提取獲得，經光譜學和波譜學分析鑒定 其結構，液相鑒定純度大于99.0%，替硝唑購于中國藥品生物制品檢定所。
[0060] 實施例1 口服獨一味全草和地上藥材后大鼠血漿中胡麻屬苷成分的含量測定 [0061 ] 包括以下步驟：
[0062] 1.1血漿測試樣品的制備：
[0063] (1)將獨一味地上部分的提取物溶于適量0.5 % CMC-Na溶液，得50mg/mL的溶液，以 灌胃方式給大鼠（250 ± 20g)獨一味溶液0.8g/kg;
[0064] (2)分別在給藥后5min、15min、0 ? 5h、lh、1 ? 5h、2h、3h、4h、6h、8h、12h 和24h 從大鼠 眼眶取血0.3mL，置于1.5mL肝素化的聚乙烯管中，立即在4°C恒溫離心1 Omin，轉速4000 X g， 得血衆；
[0065] (3)取0 ? lmL血漿置于1 ? 5mL EP管中，加入0 ? 3mL甲醇溶液（含0 ? 1 %甲酸和200ng/ mL替硝唑內標），禍旋混勾3min，再以13000rpm離心10min，取上清液0.2mL，于37°C氮氣流吹 干，再以0.4mL初始流動相復溶，取10yL作為血漿供試品溶液1;
[0066] (4)重復步驟（1)至步驟(3)的方法對大鼠灌服獨一味全草，得到血漿供試品溶液 2〇
[0067] (5)對照品溶液的制備:精密稱取胡麻屬苷對照品，溶于甲醇，加入內標替硝唑得 儲備液。以空白血漿和10%Me0H稀釋成不同濃度的標準溶液，得濃度分別為4.00，10.00， 30 ? 00，50 ? 00，100 ? 00，150 ? 00，250ng/mL 的胡麻屬苷溶液。
[0068] 1.2LC-MS/MS分析的色譜分離條件和質譜檢測條件：
[0069] 液相條件為:Agilent 1200HPLC液相色譜儀，反相色譜柱，柱溫為35°C，流動相為： 酸性乙腈(A)和酸性水（B)，流速為0.4mL/min，進樣體積為10yL，梯度洗脫，檢測時間為 5min。后運行時間為5min。
[0070]質譜條件為:Agilent 6410 QQQ質譜系統，離子化方式為電噴霧條件，采用負離子 條件下MRM模式，內標為替硝唑，干燥氣流速為10L/min，干燥氣溫度為350°C，霧化氣壓力為 40psi，毛細管電壓為4000V。
[0071 ] 其中步驟2中，反相色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18色譜柱，具體規格為2.1mmX 100mm，填料為 3.5ym;
[0072] 其中步驟2中，所用的酸性乙腈和酸性水中，加入的酸均為甲酸，濃度為0.1%;
[0073] 其中步驟2中，梯度洗脫過程為:8-40%A(0-lmin)，40-95%A(l-4min)，95%A(4- 5min)；
[0074]其中步驟2中，質譜檢測為多反應監測模式，反應離子對分別為:胡麻屬苷465.2- 257.2,替硝唑 246.0-125.9;
[0075] 1.3測定法:分別精密吸取血漿供試品溶液1、血漿供試品溶液2和對照品溶液注入 高效液相色譜-質譜聯用儀，測定，即得血漿中胡麻屬苷的含量。如圖1所示。
[0076]實施例2檢測條件的優化 [0077] 2.1質譜條件的優化
[0078] 以胡麻屬苷標準品溶液為對象，通過調整碎裂電壓和碰撞電壓，確定質譜檢測條 件，最終確定質譜條件如表1所示。
[0079] 表1以MRM模式優化胡麻屬苷和替硝唑對照品形成穩定離子所需碰撞能量
[0082] 2.2色譜條件的優化
[0083] (1)參考文獻中類似物質的分離條件，確定加入0.1 %甲酸調節酸度。后分別對乙 腈-水(含0.1%甲酸)和甲醇-水(含0.1%甲酸)兩種流動相組成進行考察，結果見圖2-3,由 圖可見，乙腈-水(含0.1 %甲酸)系統峰形較佳。
[0084] (2)分別對Agilent Zorbax SB_C18(2? ImmX 100mm，3 ? 5um)、Waters BE；H(2? ImmX 50mm，2.5iim)和Agilent Proshell 120(2. ImmX 100mm，2? 7ym)色譜柱進行考察，結果見圖 4-6,如圖所示，Agilent Proshell和Zorbax柱能將胡麻屬苷與其它雜質有效分離，Zorbax 色譜柱的響應高于?1'0 811611，且?1'0811611色譜柱的柱壓顯著高于2〇1^31，在本儀器上使用 時容易因柱壓過高而被沖開，因此確定Zorbax作為本實驗的反相色譜柱。
[0085] (3)分別以6 %和8%有機相為初始流動相組成，考察其分離效果和響應強度，結果 見圖7-8，由圖可見，將初始流動相中有機相的比例調整為8 %時，可以有效地縮短分析時 間。后經調整整體梯度方式，確定流動相梯度為0-lmin，8-40%有機相酸性乙腈；l-4min， 40-95 %有機相酸性乙腈;4-5min，95 %有機相酸性乙腈。
[0086] 2.3提取條件的選擇
[0087]分別采用液液萃取和蛋白沉淀兩種提取方式進行提取，液液萃取時分別考察了乙 酸乙酯、丙酮、二氯甲烷、正丁醇和不同比例乙酸乙酯與二氯甲烷的混合溶劑（1:2，1:1和2: 1)的提取效率，蛋白沉淀時考察了乙腈、乙腈(含〇. 1%甲酸）、甲醇和甲醇(含〇. 1%甲酸）， 結果顯示，含0.1%甲酸的甲醇進行蛋白沉淀時提取效率最高，結果見圖9-19。
[0088]實施例3方法學驗證實驗2 [0089] 3.1專屬性的考察
[0090]將口服獨一味地上部分后的大鼠血漿、添加胡麻屬苷標準品的空白血漿溶液和未 添加胡麻屬苷標準品的空白血漿溶液，按上述提取條件進行操作，按上述色譜質譜條件進 行檢測并對比，結果見圖20-22。由圖可以看出該檢測方法專屬性良好，可以滿足檢測要求。 [0091] 3.2線性關系的考察
[0092]將7個不同濃度的胡麻屬苷溶液，按上述提取條件進行操作，按上述色譜質譜條件 進行測定，并以濃度作為橫坐標，對照品與內標的峰面積比值作為縱坐標，以最小二乘法繪 制標準曲線，回歸方程分別為：y = 16.2523X-0.0106，r>0.993，表明胡麻屬苷在4.00~ 250.00ng/mL范圍內線性關系良好。
[0093] 3.3基質效應的考察
[0094] 將胡麻屬苷和替硝唑的混合標準品溶液分別加入10%的甲醇溶液和未服用獨一 味藥物的大鼠血漿，按照上述提取條件進行操作，然后取供試品進行檢測并對比，結果顯示 該基質對檢測干擾較小，可以滿足胡麻屬苷濃度檢測的要求。結果見表2。
[0095] 表2胡麻屬苷的基質效應、提取回收率、精密度和穩定性表
[0096]
[0097] 3.4提取回收率的考察
[0098]將胡麻屬苷和替硝唑的混合標準品溶液加入空白血漿，并按上述提取條件進行操 作，然后取供試品溶液與混合標準品溶液進行檢測并對比，結果顯示該方法提取效率較高， 能夠滿足實際樣本的檢測需要。結果見表2。
[0099] 3.5精密度試驗
[0100] (1)日內精密度
[0101 ]日內精密度:在標準曲線范圍內，選擇胡麻屬苷的低、中、高3個濃度制備質量控制 樣品，每一濃度進樣6次，計算日內精密度，結果符合生物樣品中定量分析研究的方法學要 求。結果見表2。
[0102] (2)日間精密度
[0103] 連續進樣3天，計算日間精密度，結果符合生物樣品中定量分析研究的方法學要 求，說明該方法具有良好的精密度。結果見表2。
[0104] 3.6準確度試驗
[0105] 取不同濃度的質控樣品，與標準曲線同時進行，計算準確度。結果符合生物樣品中 定量分析研究的方法學要求。結果見表2。
[0106] 3.7穩定性試驗
[0107] 取不同濃度的質控樣品，與標準曲線同時進行，做短期、長期和凍融實驗，檢測其 穩定性。結果見表2，說明該方法具有良好的穩定性。
[0108] 以上已對本發明創造的較佳實施例進行了具體說明，但本發明創造并不限于所述 實施例，熟悉本領域的技術人員在不違背本發明創造精神的前提下還可作出種種的等同的 變型或替換，這些等同的變型或替換均包含在本申請權利要求所限定的范圍內。
【主權項】
1. 一種口服獨一味后大鼠血漿中胡麻屬苷含量的測定方法，其特征在于，包括以下步 驟： (a) 血漿的處理:將大鼠血漿加入含0.1 %甲酸和200ng/mL替硝唑內標的甲醇溶液，渦 旋混勻，離心，取上清液氮氣流吹干，再以初始流動相復溶，作為血漿測試樣品； (b) 精密吸取步驟(a)得到的血漿測試樣品注入高效液相色譜-質譜聯用儀，內標法定 量，測得血漿中胡麻屬苷的含量;其中， 液相條件為:Agilent 1200HPLC液相色譜儀，反相色譜柱，柱溫為35°C，流動相為:酸性 乙腈和酸性水，流速為〇 . 4mL/min，進樣體積為10yL，梯度洗脫，檢測時間為5min;后運行時 間為5min;所述的酸性乙腈和酸性水中，加入的酸均為甲酸，濃度為0.1%; 質譜條件為:Agilent 6410QQQ質譜系統，離子化方式為電噴霧條件，采用負離子條件 下MRM模式，內標為替硝唑，干燥氣流速為10L/min，干燥氣溫度為350°C，霧化氣壓力為 40psi，毛細管電壓為4000V。2. 根據權利要求1所述的測定方法，其特征在于，所述的步驟(a)中離心轉速13000rpm， 離心時間lOmin。3. 根據權利要求1所述的測定方法，其特征在于，所述的步驟(b)液相中反相色譜柱為 Agilent Zorbax SB-C18色譜柱，具體規格為2.1_X 100mm，填料為3·5μηι。4. 根據權利要求1所述的測定方法，其特征在于，所述的步驟(b)液相中的梯度洗脫過 程為:0-lmin，8-40%酸性乙腈；l-4min，40-95%酸性乙腈;4-5min，95%酸性乙腈。5. 根據權利要求1所述的測定方法，其特征在于，所述的步驟(b)中質譜檢測為多反應 監測模式，反應離子對分別為:胡麻屬苷465.2-257.2，替硝唑246.0-125.9。
【文檔編號】G01N30/02GK106053641SQ201610363435
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年5月27日
【發明人】張鳳, 喇明平, 陳萬生, 龔曉斌, 高守紅, 楊陽, 孫連娜
【申請人】中國人民解放軍第二軍醫大學