一種有機磷農藥的快速增敏檢測方法

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一種有機磷農藥的快速增敏檢測方法
【專利摘要】本發明涉及化學分析領域，具體涉及一種有機磷農藥的快速增敏檢測方法。旨在解決傳統的酶抑制法快速檢測有機磷農藥中存在的因含P=S基團有機磷農藥對膽堿酯酶抑制能力較弱，從而造成的對含P=S基團有機磷農藥檢測靈敏度和準確性都較低的問題。本發明通過在樣品前處理中增加與酶反應兼容的氧化增敏處理過程，并在酶反應中加入氨基甲酸酯類底物和顯色劑，根據吸光度的變化，進而判定樣品中有機磷農藥的殘留量是否超過限量值。與現有的有機磷農藥的檢測方法相比，本發明通過獨特的增敏處理方法將有機磷農藥中的P=S基團轉化為P=O基團，從而顯著的提高了酶抑制法檢測含P=S基團的有機磷農藥的檢測能力。
【專利說明】
一種有機磷農藥的快速増敏檢測方法
技術領域
[0001] 本發明涉及化學分析領域，具體涉及一種有機磷農藥的快速增敏檢測方法。
【背景技術】
[0002] 有機磷農藥(OPs)是指含C-P、C-0-P、C-S-P或C-N-P鍵的用于防治植物病、蟲、害得有機化合物，多數為油狀液體，少數為固體(樂果、敵百蟲等），顯色為淡黃色至棕色，具有大蒜氣味。大多數OPs不溶于水，而溶于有機試劑，在堿性條件下易水解失效。除了少數用作除草劑、殺菌劑和植物生長調節劑外，大多數都用作農業殺蟲劑。OPs具有高效、快速、廣譜的優點，在農藥中是極其重要的一類化合物，但是累積過多會對人和動物有一定毒性危害，使用中需要對安全特別注意。1941年Adrian等首次提出磷酸酯對膽堿酯酶具有抑制作用的推斷。隨后，1949年Balls證實這種抑制作用是由于酰基部位的磷酰化導致的。（蔬菜中有機磷殺蟲劑多殘留分析方法研究）目前，OPs中毒機理是公認的OPs對體內膽堿酯酶的抑制性學說，即OPs與體內的膽堿酯酶(大量存在于神經末梢突觸間隙，水解膽堿進行神經遞質傳遞）結合形成磷酰化膽堿酯酶，使膽堿酯酶失去活性，神經遞質膽堿大量積累，導致神經功能嚴重損傷，產生急性中毒現象，嚴重者甚至死亡。
[0003] 當前農業生產中，以有機磷農藥為主的農藥得到了廣泛的使用，也造成了環境和食品方面嚴重安全隱患。選擇高效、快速、簡單、有效的農殘檢測方法，對農藥殘留實施有效的監控，具有巨大的實際價值和潛在的經濟價值。在目前的農殘快檢方法中，酶抑制法是應用最廣泛的農殘快速檢測方法，但該方法也存在很大的弊端:如在傳統前處理技術的基礎上進行的酶抑制檢測方法，對部分酶敏感性偏低的農藥（如樂果、毒死蜱等含P = S基團的 OPs)其檢出限往往高于國家限量標準規范。使得這類農藥超標的食品不易通過酶抑制法快速檢出，或檢出量遠遠低于農藥實際含量，導致樣品假陰性，從而使得超標產品直接流入市場中，造成潛在的食品安全風險。因此，為了提高酶抑制法的靈敏度和準確性，需要對樣品前處理方法和檢測方法進行改進，以提高對這部分乙酰膽堿酯酶敏感度偏低的農藥的檢測靈敏度和準確性，從而提高食品中的農殘含量監控能力，更好的保證食品安全。
[0004] 本發明在結合有機磷農藥結構差異性的基礎上從原理認真分類、探究了含P = S基團和含P = 0基團有機磷農藥對酯酶抑制能力的差異，通過獨特的增敏處理方法將含P = S基團的有機磷農藥轉化為含P = 〇的有機磷農藥，以提高酶抑制法檢測P = S的有機磷農藥的檢測能力。

【發明內容】

[0005] 本發明的目的在于解決以上技術問題，提供一種有機磷農藥的快速增敏檢測方法，利用膽堿酯酶催化水解的功能被有機磷農藥抑制，其抑制效果與農藥的濃度存在良好的相關性，在酶反應實驗中加入氨基甲酸酯類底物和顯色劑，觀察測定顏色的變化，進而判斷有機磷農藥的殘留量是否超過限量值。與現有的有機磷農藥的檢測方法相比，本發明通過獨特的增敏處理方法將含P = S基團的有機農藥轉化為含P = 0基團的有機農藥，以提高酶抑制法檢測含P=s基團的有機農藥的檢測能力。
[0006] 為解決上述問題，本發明采用以下技術方案：
[0007] -種有機磷農藥的快速增敏檢測方法，具體制備步驟如下：
[0008] (1)樣品提取，取勻漿破碎后的樣品和丙酮混合，渦旋震蕩浸提，過濾除雜，然后吹干丙酮濾液，加入磷酸鹽緩沖液定容，得到樣品提取液；
[0009] (2)增敏處理，向樣品提取液中，加入次氯酸鈣溶液，氧化反應10-40min，再加入亞硝酸鈉溶液，還原反應l〇-40min，得到待測液；
[0010] ⑶酶抑制檢測，取蒸餾水與待測液，加入工作酶液，30-40 °C恒溫抑制3-30min，再加入反應底物和顯色劑，30-40°C反應5-30min，采用酶標儀檢測在410nm處的吸光度值，按以下公式計算抑制率：
[0012]其中，A Ao為無農藥抑制時反應體系的吸光度；A心為有農藥抑制時反應體系的吸光度。
[0013] 進一步地，所述步驟（1)中，樣品的用量為5-20g，丙酮用量為20-30mL，加入磷酸鹽緩沖液定容至lOOOuL;所述步驟(2)中次氯酸鈣溶液用量為50-500uL，亞硝酸鈉溶液用量為 50-500uL;所述步驟(3)中，蒸餾水的用量為50-200uL，樣品提取液的用量為50-100uL，工作酶液的用量為30-80uL，反應底物的用量為30-80uL，顯色劑的用量為15-40uL;
[0014]更進一步地，所述次氯酸鈣溶液為質量濃度0.02 % -0.10 %的次氯酸鈣溶液;所述亞硝酸鈉溶液為質量濃度5 % -20 %的亞硝酸鈉溶液；
[0015] 更進一步地，所述次氯酸鈣溶液為質量濃度0.05 %的次氯酸鈣溶液;所述亞硝酸鈉溶液為質量濃度10%的亞硝酸鈉溶液。
[0016] 進一步地，所述工作酶液為乙酰膽堿酯酶;所述反應底物為質量濃度0.5 % -5 %碘化硫代乙酰膽堿;所述顯色劑由0.03-0.05g的5，5-二硫代-2，2-二硝基苯甲酸，加pH值為 7.71磷酸緩沖液溶解并定容至1 OOmL配制而成。
[0017] 進一步地，所述磷酸鹽緩沖液pH值為7.71。
[0018] 進一步地，所述步驟(1)中，吹干丙酮濾液是通過30-40 °C的氮氣吹干丙酮濾液。
[0019] 進一步地，所述步驟(2)中，增敏處理的操作溫度為20-40°C。
[0020] 本發明一種有機磷農藥的快速增敏檢測方法，與現有技術相比，其突出的特點和優異的效果在于：
[0021] 1.本發明通過獨特的增敏處理方法將含P = S基團的有機農藥轉化為含P = 0基團的有機農藥，以提尚酶抑制法檢測含P = S基團的有機農藥的檢測能力。
[0022] 2.本發明的檢測方法操作簡單，靈敏度高，便于快速檢測。
【附圖說明】
[0023] 圖1為12種有機磷農藥對乙酰膽堿酯酶的抑制曲線；
[0024]圖2為通過增敏處理對混合加標樣品檢測的影響。
【具體實施方式】
[0025] 以下通過【具體實施方式】和附圖對本發明作進一步的詳細說明，但不應將此理解為本發明的范圍僅限于以下的實施例。在不脫離本發明上述方法思想的情況下，根據本領域普通技術知識和慣用手段做出的各種替換或變更，均應包含在本發明的范圍內。
[0026] 實施例1
[0027] -種有機磷農藥的快速增敏檢測方法：
[0028] 樣品提取，分別稱取10g勻漿破碎后的混合有機磷農藥的樣品和25mL丙酮混合，渦旋震蕩浸提l〇min，然后過濾除雜，用35°C的氮氣吹干丙酮，加入磷酸鹽緩沖液定容至 1000uL；
[0029] 增敏處理，1000此樣品提取液中，加入300此的0.05%次氯酸鈣溶液，30°(：氧化反應15min，再加入300uL的10 %亞硝酸鈉溶液，30 °C還原反應15min，得到待測液；
[0030]酶抑制檢測，在酶標板中，取100uL的蒸餾水與75uL的待測液，再加入50uL的工作酶液乙酰膽堿酯酶，混合均勻，35 °C恒溫抑制15min，再加入50uL的反應底物ATChl和25uL的顯色劑5，5-二硫代-2，2-二硝基苯甲酸，混合均勻，35°C反應10min，采酶標儀檢測在410nm 處的吸光度值。
[0031] 實施例2
[0032] -種有機磷農藥的快速增敏檢測方法：
[0033]樣品提取，分別稱取5g勻漿破碎后的混合有機磷農藥的樣品和20mL丙酮混合，渦旋震蕩浸提5min，然后過濾除雜，用35°C的氮氣吹干丙酮，加入磷酸鹽緩沖液定容至 1000uL；
[0034] 增敏處理，1000uL樣品提取液中，加入50uL的0.05 %次氯酸鈣溶液，30°C氧化反應 10min，再加入50uL的10 %亞硝酸鈉溶液，30 °C還原反應10min，得到待測液；
[0035]酶抑制檢測，在酶標板中，取50uL的蒸餾水與50uL的待測液，再加入30uL的工作酶液乙酰膽堿酯酶，混合均勻，35°C恒溫抑制3min，再加入30uL的反應底物ATChl和15uL的顯色劑5，5-二硫代-2，2-二硝基苯甲酸，混合均勻，35 °C反應5min，采用酶標儀檢測在410nm處的吸光度值。
[0036] 實施例3
[0037] -種有機磷農藥的快速增敏檢測方法：
[0038] 樣品提取，分別稱取20g勻漿破碎后的混合有機磷農藥的樣品和30mL丙酮混合，渦旋震蕩浸提30min，然后過濾除雜，用35°C的氮氣吹干丙酮，加入磷酸鹽緩沖液定容至 1000uL；
[0039] 增敏處理，1000此樣品提取液中，加入500此的0.05%次氯酸鈣溶液，30°(：氧化反應40min，再加入500uL的10 %亞硝酸鈉溶液，30 °C還原反應40min，得到待測液；
[0040]酶抑制檢測，在酶標板中，取200uL的蒸餾水與100uL的待測液，再加入80uL的工作酶液乙酰膽堿酯酶，混合均勻，35 °C恒溫抑制30min，再加入80uL的反應底物ATChl和40uL的顯色劑5,5-二硫代-2,2-二硝基苯甲酸，混合均勻，35°C反應30min，采用酶標儀檢測在 410nm處的吸光度值。
[0041 ] 實施例4
[0042] -種有機磷農藥的快速增敏檢測方法：
[0043]樣品提取，分別稱取15g勻漿破碎后的混合有機磷農藥的樣品和24mL丙酮混合，渦旋震蕩浸提15min，然后過濾除雜，用35°C的氮氣吹干丙酮，加入磷酸鹽緩沖液定容至 lOOOuL；
[0044] 增敏處理，lOOOuL樣品提取液中，加入200uL的0.05 %次氯酸鈣溶液，30°C氧化反應20min，再加入200uL的10 %亞硝酸鈉溶液，30 °C還原反應20min，得到待測液；
[0045]酶抑制檢測，在酶標板中，取120uL的蒸餾水與80uL的待測液，再加入55uL的工作酶液乙酰膽堿酯酶，混合均勻，35°C恒溫抑制20min，再加入55uL的反應底物ATChl和28uL的顯色劑5,5-二硫代-2,2-二硝基苯甲酸，混合均勻，35°C反應15min，采用酶標儀檢測在 410nm處的吸光度值。
[0046] 實施例5
[0047] -種有機磷農藥的快速增敏檢測方法：
[0048]樣品提取，分別稱取12g勻漿破碎后的混合有機磷農藥的樣品和23mL丙酮混合，渦旋震蕩浸提l〇min，然后過濾除雜，用35°C的氮氣吹干丙酮，加入磷酸鹽緩沖液定容至 1000uL；
[0049] 增敏處理，1000uL樣品提取液中，加入400uL的0.05 %次氯酸鈣溶液，30°C氧化反應25min，再加入400uL的10 %亞硝酸鈉溶液，30 °C還原反應25min，得到待測液；
[0050]酶抑制檢測，在酶標板中，取150uL的蒸餾水與80uL的待測液，再加入60uL的工作酶液乙酰膽堿酯酶，混合均勻，35 °C恒溫抑制10min，再加入60uL的反應底物ATChl和33uL的顯色劑5,5-二硫代-2,2-二硝基苯甲酸，混合均勻，35°C反應12min，采用酶標儀檢測在 410nm處的吸光度值。
[0051 ] 實施例6
[0052]樣品提取，分別稱取10g勻漿破碎后的樣品（分別加入相同濃度樂果、毒死蜱、敵百蟲、辛硫磷、馬拉硫磷、殺螟硫磷、三唑磷、氧化樂果、敵敵畏、乙酰甲胺磷、丙溴磷、馬拉氧磷等有機磷農藥的樣品，以及一個無農藥的樣品）和25mL丙酮混合，渦旋震蕩浸提10min，然后過濾除雜，用35°C的氮氣吹干丙酮，加入磷酸鹽緩沖液定容至lOOOuL;
[0053]樣品不經增敏處理直接酶抑制檢測，在酶標板中，取100uL的蒸餾水與75uL的樣品提取液，再加入50uL的工作酶液乙酰膽堿酯酶，混合均勻，35 °C恒溫抑制15min，再加入50uL 的反應底物ATChl和25uL的顯色劑5，5-二硫代-2，2-二硝基苯甲酸，混合均勻，35 °C反應 10min，采用酶標儀檢測在410nm處的吸光度值，計算其抑制率。
[0054]實驗檢測結果如圖1，其中，含P = S基團的有機磷農藥包括:樂果、毒死蜱、敵百蟲、辛硫磷、馬拉硫磷、殺螟硫磷、三唑磷，含P=0基團的有機磷農藥包括:氧化樂果、敵敵畏、乙酰甲胺磷、丙溴磷、馬拉氧磷。實驗結果表明在相同濃度下含P = 〇基團的有機磷農藥對乙酰膽堿酯酶的抑制率顯著高于含P = s基團的有機磷農藥，如若不采取改進措施存在部分含P =S基團有機磷農藥不易被檢出的可能。
[0055] 實施例7
[0056] 樣品提取，分別稱取10g勻漿破碎后的樣品分別加入不同濃度的樂果、毒死蜱、敵百蟲、辛硫磷、馬拉硫磷、殺螟硫磷、三唑磷等含P = S基團的有機磷農藥，與25mL丙酮混合，渦旋震蕩浸提l〇min，然后過濾除雜，合并丙酮濾液，用35°C的氮氣吹干丙酮，加入磷酸鹽緩沖液定容至lOOOuL;
[0057] 樣品等分為兩份，一份進行增敏處理，即lOOOuL樣品提取液中，加入400uL的 0 ? 05 %次氯酸鈣溶液，30 °C氧化反應25min，再加入400uL的10 %亞硝酸鈉溶液，30 °C還原反應25min;另一份不進行增敏處理，作為對照。
[0058]酶抑制檢測，在酶標板中，取100uL的蒸餾水與75uL的待測液，再加入50uL的工作酶液乙酰膽堿酯酶，混合均勻，35 °C恒溫抑制15min，再加入50uL的反應底物ATChl和25uL的顯色劑5,5-二硫代-2,2-二硝基苯甲酸，混合均勻，35°C反應lOmin，采用酶標儀檢測在 410nm處的吸光度值。通過計算其抑制率曲線方程和IC 5Q值。比較含P = S基團的有機磷農藥經增敏處理后，對乙酰膽堿酯酶敏感度的變化。
[0059] 實驗結果見表1，表明經氧化處理后含P = S基團的有機磷農藥對乙酰膽堿酯酶的敏感度普遍提高了 2~4個數量級，顯著的提高了酶抑制法檢測含P = S基團的有機磷農藥的靈敏度。
[0060]表1含P = S基團有機磷農藥氧化處理前后抑制曲線方程和1(：50值
[0062] 其中y為抑制率，x為抑制時間，R2為相關系數，IC5Q(M)為半抑制率。
[0063] 實施例8
[0064]樣品提取，分別稱取10g勻漿破碎后的樣品（分別加入總濃度為0.02mg/kg和2mg/ kg的樂果、毒死蜱、敵百蟲、辛硫磷、馬拉硫磷、殺螟硫磷、三唑磷等含P = S基團的有機磷農藥的混合標準品）和25mL丙酮混合，渦旋震蕩浸提lOmin，然后過濾除雜，用35°C的氮氣吹干丙酮，加入磷酸鹽緩沖液定容至1000uL;
[0065] 樣品等分為兩份，一份進行增敏處理，即1000UL樣品提取液中，加入400uL的 0 ? 05 %次氯酸鈣溶液，30 °C氧化反應25min，再加入400uL的10 %亞硝酸鈉溶液，30 °C還原反應25min;另一份不進行增敏處理，作為對照；
[0066]再將樣品進行酶抑制檢測，在酶標板中，取100uL的蒸餾水與75uL的待測液，再加入50uL的工作酶液乙酰膽堿酯酶，混合均勻，35°C恒溫抑制15min，再加入50uL的反應底物 ATChl和25uL的顯色劑5,5-二硫代-2,2-二硝基苯甲酸，混合均勻，35°(：反應1〇111111，采用酶標儀檢測在41 Onm處的吸光度值，計算抑制率。
[0067] 檢測結果如圖2,結果表明不論在高濃度(2mg/kg)還是低濃度(0.02mg/kg)下，經氧化處理后，含P = S基團的有機磷農藥對乙酰膽堿酯酶的抑制率均有顯著提高。
【主權項】
1. 一種有機磷農藥的快速增敏檢測方法，其特征在于，具體檢測步驟如下： (1) 樣品提取，取勻漿破碎后的樣品和丙酮混合，渦旋震蕩浸提，過濾除雜，然后吹干丙酮濾液，加入磷酸鹽緩沖液定容，得到樣品提取液； (2) 增敏處理，向樣品提取液中，加入次氯酸鈣溶液，氧化反應10-40min，再加入亞硝酸鈉溶液，還原反應10-40min，得到待測液； (3) 酶抑制檢測，取蒸餾水與待測液，加入工作酶液，30-40°C恒溫抑制3-30min，再加入反應底物和顯色劑，30-40°C反應5-30min，采用酶標儀檢測在410nm處的吸光度值，按以下公式計算抑制率：其中，A Ao為無農藥抑制時反應體系的吸光度；A Ai為有農藥抑制時反應體系的吸光度。2. 根據權利要求1所述的一種有機磷農藥的快速增敏檢測方法，其特征在于:所述步驟 (1)中，樣品的用量為5_20g，丙酮用量為20-30mL，加入磷酸鹽緩沖液定容至1000uL;所述步驟(2)中次氯酸鈣溶液用量為50-500uL，亞硝酸鈉溶液用量為50-500uL;所述步驟(3)中，蒸餾水的用量為50-200uL，樣品提取液的用量為50-100uL，工作酶液的用量為30-80uL，反應底物的用量為30-80uL，顯色劑的用量為15-40uL。3. 根據權利要求2所述的一種有機磷農藥的快速增敏檢測方法，其特征在于:所述次氯酸鈣溶液為質量濃度〇. 02 % -0.10 %的次氯酸鈣溶液;所述亞硝酸鈉溶液為質量濃度5 % -20%的亞硝酸鈉溶液。4. 根據權利要求3所述的一種有機磷農藥的快速增敏檢測方法，其特征在于:所述次氯酸鈣溶液為質量濃度〇. 05 %的次氯酸鈣溶液;所述亞硝酸鈉溶液為質量濃度10 %的亞硝酸鈉溶液。5. 根據權利要求1或2所述的一種有機磷農藥的快速增敏檢測方法，其特征在于:所述工作酶液為乙酰膽堿酯酶;所述反應底物為質量濃度〇. 5 % -5 %碘化硫代乙酰膽堿;所述顯色劑由0.03-0.05g的5，5-二硫代-2，2-二硝基苯甲酸，加pH值為7.71磷酸緩沖液溶解并定容至100mL配制而成。6. 根據權利要求1或2所述的一種有機磷農藥的快速增敏檢測方法，其特征在于:所述磷酸鹽緩沖液pH值為7.71。7. 根據權利要求1所述的一種有機磷農藥的快速增敏檢測方法，其特征在于:所述步驟 (1) 中，吹干丙酮濾液是通過30-40 °C的氮氣吹干丙酮濾液。8. 根據權利要求1所述的一種有機磷農藥的快速增敏檢測方法，其特征在于:所述步驟 (2) 中，增敏處理的操作溫度為20-40°C。
【文檔編號】G01N21/78GK106053454SQ201610370322
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年5月30日
【發明人】陳祥貴, 楊瀟, 馬敏
【申請人】西華大學

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