一種線粒體靶向型長波長熒光探針及其應用
【專利摘要】本發明涉及一種線粒體靶向型長波長熒光探針。所述的熒光探針為FAI，熒光探針FAI的結構如(I)所示。本發明的熒光探針能夠快速的定位于線粒體。且該探針具有較長的熒光發射光譜(600?700nm)，較好的化學、光穩定性，較好的溶解性和生物兼容性。激光共聚焦成像實驗表明這類探針具有較好的細胞通透性，對細胞和生物體無毒副作用。
【專利說明】
一種線粒體靶向型長波長熒光探針及其應用
技術領域 [0001] 本發明涉及一種基于熒光素的線粒體靶向型長波長熒光探針。
【背景技術】 [0002] 線粒體是細胞中有氧呼吸的場所，為生物體的各種活動提供著能量，被 人們形象的成為"動力工廠"。此外，線粒體還參與了細胞代謝、信號傳導和細胞凋亡等生理 過程，是細胞中非常重要的細胞器之一。線粒體存在于大多數的真核細胞中，大小不一，一 般在(0.5-1.0)X(l-2)wii，在光學顯微鏡下需要經過特殊染色才能看見。線粒體一般呈短 棒狀或圓球狀，也有環狀、線狀、啞鈴狀、分杈狀、扁盤狀等其它形狀。線粒體的數量與形狀 不但與細胞的種類有關，也與代謝活動和相關疾病密切相關。因此線粒體的形態、數量以及 分布狀況對于研究線粒體的功能與預防相關疾病具有重要意義。
[0003] 隨著熒光技術的快速發展，熒光探針已成為基礎醫學和生物成像研究的重要手 段。熒光探針具有熒光量子產率高，光穩定性好，生物兼容性好等優點，常被應用于細胞、組 織以及體型較小的活體動植物的熒光成像中，成為顯微成像的理想工具。目前用于線粒體 成像的熒光探針種類很多，絕大多數為短波長熒光探針，其發射波長位于400-600nm，但是 發射波長處于近紅外區并能夠定位于線粒體中的熒光探針種類卻很少。長波長熒光探針與 短波長相比具有明顯的優勢，長波長熒光探針具有較強的組織滲透性和較小的生物組織或 生物體自發熒光的干擾，對生物組織的光損害較小，同時可以為短波長探針提供共定位實 驗的參比探針，因此急需開發具有靶向定位于線粒體的長波長熒光探針。
[0004]
【發明內容】
本發明提供了一種線粒體靶向型長波長熒光探針FALFAI的結構如（I) 所示，
[0007]上述這種熒光探針的制備反應式如下：
[0009] 上述的FAI探針的合成方法按如下步驟進行：
[0010] 1摩爾量的二氯熒光素單醛，與1.1倍摩爾量的N-R-2，3，3-三甲基-3H-吲哚，分別 加入到無水乙醇中，在氮氣保護下加熱回流反應5-7小時，反應液冷卻后過濾，濾餅用無水 乙醇清洗，濾餅經無水乙醇重結晶后，得到黃色固體即為目標產物。
[0011]上述的FAI探針可以對線粒體進行染色，所述的活細胞為Hela細胞株、MCF-7細胞 株或RAW264.7細胞株。
[0012]本發明的有益效果是:本發明的熒光探針分子能夠快速的定位于線粒體中，另外， 該探針還具有較長的發射波長(600-650nm)，較好的化學穩定性，較好的溶解性和生物兼容 性，不受其他活性氧和活性氮等物種的干擾。激光共聚焦成像實驗表明這類探針具有較好 的細胞通透性，對細胞和生物體無毒副作用。
【附圖說明】
[0013]圖1是探針FAI-1的熒光光譜和吸收光譜(歸一化）
[0014] 圖2是實施例制備的FAI對線粒體中的熒光共聚焦顯微成像。
【具體實施方式】
[0015] 二氯熒光素單醛的制備方法：
[0016] 二氯熒光素（2.5g，6.14mmol)溶于8ml NaOH 33% (質量分數)溶液與14ml甲醇中， 再加入0.4ml 15-冠醚-5，0 °C下滴加12ml三氯甲烷，再升溫至55 °C下回流反應10h。在0 °C下 將反應液用濃鹽酸酸化，pH調至1-2,出現絮狀沉淀。過濾得到橙黃色固體。用硅膠柱層析 提，得淺黃色固體〇.9g，產率15 IMS: 427.9
[0017] 實施例（l)FAI-l
[0018]二氯熒光素單醛（0.598，1.39!11111〇1)與1甲基-2,3,3-三甲基-311-吲哚（0.25 8， 1.56mmol)，溶于2mL無水乙醇中，在氮氣保護下加熱回流反應5-7小時，反應液冷卻后過濾， 濾餅用無水乙醇清洗，濾餅經無水乙醇重結晶后，得到黃色固體即為目標產物，產率為 89%〇MS：584.1
[0019] 實施例（2)FAI-2
[0020] 二氯熒光素單醛（0.6g，1.41mmol)與N-乙基-2,3,3-三甲基-3H-吲哚（0.3g， 1.62mmol)，溶于2mL無水乙醇中，在氮氣保護下加熱回流反應5-7小時，反應液冷卻后過濾， 濾餅用無水乙醇清洗，濾餅經無水乙醇重結晶后，得到黃色固體即為目標產物，產率為 89%〇MS：584.1
[0021]實施例(3)FAI-1對線粒體的熒光顯微成像
[0022] 向含有]\?^-7或1^1264.7(他13)細胞株的培養皿中，加入濃度為0.05-0.1]\1的?八1- 1的二甲基亞砜溶液，與細胞培養液混合均勻后，使FAI-1在培養液中的終濃度達到10uM。染 色5min后，用pH= 7.2的磷酸鹽緩沖溶液進行清洗三次，然后將該培養皿置于37°C恒溫培養 箱中進行孵育24小時，最后將該培養皿置于共聚焦顯微鏡下進行觀察。結果如圖2所示。 [0023]實驗結果發現，染有FAI-1的細胞線粒體中呈現出較強的紅色熒光，實驗結果表明 FAI-1具有較好的細胞膜透過性，能夠定位于細胞的線粒體中。
【主權項】
1. 一種線粒體靶向型長波長熒光探針，熒光探針為FAI。其結構通式如(I)所示：2. 如權利要求1所述FAI熒光探針的合成方法，其特征包括如下步驟： 1摩爾量的二氯熒光素單醛，與1.1倍摩爾量的N-R-2，3，3-三甲基-3H-吲哚，分別加入 到無水乙醇中，在氮氣保護下加熱回流反應5-7小時，反應液冷卻后過濾，濾餅用無水乙醇 清洗，濾餅經無水乙醇重結晶后，得到黃色固體即為目標產物。3. 如權利要求1所述FAI的應用，其特征在于，用于細胞內線粒體的熒光顯微成像。4. 如權利要求1所述的應用，其特征在于，所述細胞為Hela細胞株、MCF-7細胞株、 RAW264.7細胞株。
【文檔編號】G01N21/64GK106053401SQ201610128941
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年3月8日 公開號201610128941.2, CN 106053401 A, CN 106053401A, CN 201610128941, CN-A-106053401, CN106053401 A, CN106053401A, CN201610128941, CN201610128941.2
【發明人】葉煒
【申請人】北京文資正業投資管理有限公司