一種以水溶性苯胺藍為探針測定殼聚糖含量的方法
【專利摘要】本發明公開了一種以水溶性苯胺藍（AB）為探針測定殼聚糖（CTS）含量的方法，本發明研究發現水溶性苯胺藍與殼聚糖結合形成離子締合物，能引起溶液的共振瑞利散射光(RRS)顯著增強，并出現新的RRS光譜。殼聚糖?水溶性苯胺藍體系在0.01～3.5μg/mL范圍內與殼聚糖濃度呈線性關系，線性方程：ΔI=2597.4c?40.584，R2=0.9992，檢測限6.94ng/mL。更重要的是，以水溶性苯胺藍為探針測定殼聚糖含量時，測定結果的準確性不受殼聚糖分子量的影響，能夠準確測定殼聚糖含量。該方法不僅靈敏高，且選擇性好，能用于復雜樣品的測定，精密度和加標回收率結果令人滿意。
【專利說明】
一種以水溶性苯胺藍為探針測定殼聚糖含量的方法
技術領域
[0001 ]本發明涉及生物檢測技術領域，具體地，涉及殼聚糖含量測定技術領域，更具體 地，涉及一種以水溶性苯胺藍為探針測定殼聚糖含量的方法。
【背景技術】
[0002] 殼聚糖(CTS)是甲殼素脫乙酰基產物，其化學名稱為聚葡萄糖胺（1，4)_2_氨基-2-脫氧-D-葡聚糖，是自然界含量僅次于纖維素的第二大天然有機高分子化合物。它是甲殼類 (蝦、蟹)動物、昆蟲的外骨骼的主要成分。殼聚糖及其衍生物是重要的生物活性物質，具有 抗腫瘤，抗凝血，減肥降脂和增強免疫力等功能，可作為醫藥保健品、食品、化妝品等的添加 劑及制備人造皮膚和手術縫合線等的重要原料。因此，殼聚糖在生物醫學，環境衛生和食品 等領域都有著廣闊的應用前景。
[0003] 隨著殼聚糖廣泛應用，殼聚糖的準確定量顯得十分重要。目前，國內外用于殼聚糖 定量分析的方法主要集中在分光光度法和熒光法。目前，光譜法測定殼聚糖普遍忽略了殼 聚糖作為高分子天然產物，其分子量從幾千到百萬不等，當樣品中殼聚糖分子量與標準品 差異較大時，可能會產生一定的系統誤差，影響準確測定。
【發明內容】
[0004] 本發明為了克服現有技術的上述不足，提供水溶性苯胺藍在作為定量分析殼聚糖 的探針中的應用。
[0005] 本發明的另一個目的是提供一種以水溶性苯胺藍為探針測定殼聚糖含量的方法。
[0006] 為了實現上述目的，本發明是通過以下技術方案予以實現的：
[0007] 本發明研究發現水溶性苯胺藍與殼聚糖結合形成離子締合物，能引起溶液的共振 瑞利散射光(RRS)顯著增強，并出現新的RRS光譜。殼聚糖-水溶性苯胺藍體系在0.01~3.5y g/mL范圍內與殼聚糖濃度呈線性關系，線性方程：AI = 2597.4c-40.584，R2 = 0.9992,檢測 限6.94ng/mL。更重要的是，以水溶性苯胺藍為探針測定殼聚糖含量時，測定結果的準確性 不受殼聚糖分子量的影響，而且，以水溶性苯胺藍為探針可以分析復雜樣品如殼聚糖負載 鑭除氟水樣中殼聚糖的測定，因此，本發明請求保護水溶性苯胺藍在作為定量分析殼聚糖 的探針中的應用。
[0008]以水溶性苯胺藍為探針的定量分析殼聚糖的方法。
[0009] -種以水溶性苯胺藍為探針測定殼聚糖含量的方法，包括如下步驟：
[0010] 標準曲線的繪制:配置n個成梯度濃度的殼聚糖溶液和1個空白試劑，向n個成梯度 濃度的殼聚糖溶液和1個空白試劑中分別加入2倍體積的甘氨酸-鹽酸緩沖溶液，然后再分 別加入等體積的水溶性苯胺藍，混合均勻后得到稀釋后的成濃度梯度的殼聚糖待測溶液， 靜置反應，檢測殼聚糖待測溶液的共振瑞利散射強度，具體為以Ae X = Aem進行同步掃描，記 錄RRS光譜，并于349nm處分別測量離子締合物的I和試劑空白的IQ，A I = I-IQ，繪制標準曲 線，進一步得線性方程；
[0011] 樣品檢測：向經過初步處理后的待測樣品的上清液中，加入2倍體積的甘氨酸-鹽 酸緩沖溶液，然后再加入等體積的水溶性苯胺藍，混合均勻后靜置反應，檢測共振瑞利散射 強度，由上述線性方程計算出待測樣品中殼聚糖的濃度。
[0012] 優選地，所述甘氨酸-鹽酸緩沖溶液的pH值為1.7。
[0013] 優選地，所述水溶性苯胺藍的濃度為1 .〇X 10-4mol/L。
[0014] 優選地，所述靜置反應的溫度為100°(：，反應時間為101^11。反應后4.5小時內穩定， 在4.5h內檢測殼聚糖待測溶液的共振瑞利散射強度。
[0015] 優選地，待測樣品初步處理的步驟如下:將待測樣品用0.5mol/L的醋酸溶液溶解， 待完全溶解后離心，得上清液，上清液稀釋后用于共振瑞利散射法檢測。
[0016] 優選地，可以向待測樣品中加入適量EDTA掩蔽劑降低離子干擾物對殼聚糖的影 響。更優選地，所述H)TA掩蔽劑的加入濃度為0.001m 〇l/L。
[0017] 更優選地，一種以水溶性苯胺藍為探針測定殼聚糖含量的方法，包括以下步驟：
[0018] 標準曲線的繪制:在一系列10.OOmL的比色管中，按先后順序分別加入lmL濃度分 別為0.1、0.5、1、3、5、10、20、30、35yg/mL的殼聚糖溶液，pHl. 7的甘氨酸-鹽酸緩沖溶液 2.00mL，l .OX l(T4m〇l/L水溶性苯胺藍1.00mL，以蒸餾水稀釋至刻度線，搖勻得到濃度分別 為0.01、0.05、0.10、0.30、0.50、1.00、2.00、3.00、3.50噸/11^的殼聚糖待測溶液，靜置反應 10分鐘，以Xex = Aem進行同步掃描，記錄RRS光譜，并于349nm處分別測量離子締合物的I和 試劑空白的1〇, A 1 = 1-1〇,繪制標準曲線，進一步得線性方程；
[0019] 樣品檢測：將〇 . 4g待測樣品用0.5mol/L的醋酸溶液溶解，定容至100mL，待完全溶 解后離心，取2.5mL上清液，并定容至100mL，作為樣品操作液，取lmL樣品操作液，加入2mL的 pH為1.7的甘氨酸-鹽酸緩沖溶液，再加入lmL的1.0 X l(T5m〇l/L水溶性苯胺藍，用水定容至 10mL，混合均勻后，靜置10分鐘，檢測共振瑞利散射強度，由線性方程計算出待測樣品中殼 聚糖的濃度。
[0020] 與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：
[0021] 本發明研究發現水溶性苯胺藍與殼聚糖結合形成離子締合物，能引起溶液的共振 瑞利散射光(RRS)顯著增強，并出現新的RRS光譜。殼聚糖-水溶性苯胺藍體系在0.01~3.5y g/mL范圍內與殼聚糖濃度呈線性關系，線性方程：AI = 2597.4c-40.584，R2 = 0.9992,檢測 限6.94ng/mL。更重要的是，以水溶性苯胺藍為探針測定殼聚糖含量時，測定結果的準確性 不受殼聚糖分子量的影響，能夠準確測定殼聚糖含量。該方法不僅靈敏高，且選擇性好，能 用于復雜樣品的測定，精密度和加標回收率結果令人滿意。
【附圖說明】
[0022]圖1為復合光譜圖。
[0023] 圖2為CTS-AB締合的機制圖。
[0024]圖 3 為共振瑞利散射圖譜；其中 l.CTS 1.0yg/mL;2.AB 1.0X10-5mol/L;3-7.AB (1 ? 0 X 10-5mol/L)-CTS(0 ? 05,0.5，1.5,2.5,3.5yg/mL)締合物。
[0025]圖4為緩沖溶液種類的影響。
[0026] 圖5為pH的影響。
[0027]圖6為緩沖液用量的影響。
[0028]圖7為染料濃度的影響。
[0029]圖8為溫度的影響。
【具體實施方式】
[0030] 下面結合說明書附圖和具體實施例對本發明作出進一步地詳細闡述，所述實施例 只用于解釋本發明，并非用于限定本發明的范圍。下述實施例中所使用的試驗方法如無特 殊說明，均為常規方法;所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，為可從商業途徑得到的試劑 和材料。
[0031] 水溶性苯胺藍(AB)操作液（1.00 X 10-4m〇l/L):精密稱取0.0184g水溶性苯胺藍，用 水溶解，于250mL容量瓶中定容，搖勻，備用。
[0032] 0.3mol/L甘氨酸-鹽酸緩沖溶液：（22.44g甘氨酸+17.52g NaCl )/L與NaOH或HC1溶 液按不同比例配制調節而成。
[0033] 實施例1
[0034] 一、光譜分析：在10mL的比色管中，加入lmL殼聚糖標準溶液（10.00yg/mL)、pH為 1.7的甘氨酸-鹽酸緩沖溶液2. OOmL、濃度為1.0 X l(T4m〇l/L水溶性苯胺藍操作液1. OOmL，純 水定容至刻度，搖勻。掃描CTS-AB的紫外分光光譜和共振瑞利散射光譜，復合光譜圖見圖1。 圖1(a)和(b)是室溫下和100°C加熱后的CTS、AB以及CTS-AB離子締合物的紫外分光光譜圖。 比較圖1(a)和(b)，無論是室溫下的還是加熱后的AB和CTS-AB締合物均有兩個相同的吸收 峰，分別在Xl = 316nm和A2 = 588nm處，且兩者的吸收強度幾乎相同。但是，與圖1(a)相比，圖 1(b)的AB，CTS-AB締合物的光譜圖均在A = 220nm處有一個很強的吸收峰。這是由于在加熱 以后，AB發生0-31的吸收轉移。圖1(c)和(d)是常溫下和100°C加熱后的共振瑞利散射光譜 的比較。加熱前后的CTS和AB共振瑞利散射光譜幾乎沒有差別，共振瑞利散射強度都很弱。 CTS-AB離子締合物加熱前后最大共振瑞利散射峰均在A = 349nm，但是100°C加熱后的共振 瑞利散射強度大大增強了。當共振瑞利散射特征峰位于或者接近紫外吸收帶，那么散射過 程就會通過共振吸收光能，從而產生再散射，這樣大大的增強了散射的強度，從而產生共振 瑞利散射。比較紫外吸收分光光譜和共振瑞利散射光譜，最大共振瑞利散射峰X = 349nm，正 好在紫外吸收光譜吸收峰316nm附近。因此，共振瑞利散射的強度大大增強。
[0035] CTS-AB離子締合:AB分子中包含3個-S03-和1個-NH2。在強酸性溶液中，-NH 2質子化 成-NH3+，AB就以兩性染料的形式存在強酸性溶液中。當溶液的pH上升，-NH2質子化的水平會 下降。因此，在弱酸性溶液中，AB分子帶的3個-S0廠會完全解離，故AB以AB 3^的形式存在。CTS 在中性的水溶液中的pKa值是6.3，但是當溶液中pH彡6.0，殼聚糖的-NH2會質子化成-NH 3+， 在弱酸性的溶液中溶解性增強。我們的研究發現在pH 1.0~3.0緩沖溶液介質中，AB和CTS 會形成較穩定的締合物且共振瑞利散射的強度與殼聚糖濃度成正比。CTS-AB締合的機制如 圖2,帶正電荷的-NH 3+和帶負電荷-S0廠電中和形成離子締合物。但是，當CTS-AB締合物加熱 后，AB分子中自帶的相鄰的-NH 3+和-SOf可能發生締合，離子締合物締合更加完全更加緊 密，共振瑞利散射強度也大大增強。
[0036]二、共振瑞利散射圖譜:在一系列1 OmL比色管中，依次加入適量的殼聚糖標準溶液 或者樣品操作液、適宜pH的甘氨酸-鹽酸緩沖溶液2.00mL、水溶性苯胺藍操作液1.00mL，以 水定容，搖勻，于l〇〇°C水浴分別10min、3min。在F-2500上，選擇激發和發射狹縫寬度均為 5nm，以Aex = Aem進行同步掃描，記錄共振瑞利散射光譜，并分別于349nm處分別測量殼聚 糖-水溶性苯胺藍體系的共振瑞利散射光強度I，以及試劑空白的1〇，計算△ I = 1-1〇。結果如 圖3所示，由圖3可知，單純的殼聚糖、水溶性苯胺藍存在時，各自的共振瑞利散射光強度都 非常弱，但是，當殼聚糖與水溶性苯胺藍在水浴條件下締合后，其共振瑞利散射大大增強， 且出現特征峰，CTS-AB的共振瑞利散射光譜的特征峰出現在349nm處且與殼聚糖的濃度成 良好的線性關系。
[0037]三、共振瑞利散射法條件優化：
[0038] 1、緩沖溶液:考察了 B-R緩沖溶液、NaAc-HAc緩沖溶液及甘氨酸-鹽酸緩沖溶液對 CTS-AB體系的影響，由圖4可知，CTS-AB離子締合物在甘氨酸-鹽酸緩沖體系中隨著殼聚糖 濃度升高其A I升高的較快且線性關系良好，故后續條件實驗和殼聚糖測定均選用甘氨酸-鹽酸緩沖體系。
[0039] 2、pH的選擇及緩沖用量:在酸性條件下篩選pH，如圖5，發現CTS-AB體系在1.5~ 4.5范圍內A I值較大，進一步篩選可知在PH1.6~1.8時出現A I最大，最終選擇PH1.7作為 最優實驗條件。同時考察了緩沖溶液的用量，如圖6，CTS-AB體系選擇加入2. OmL甘氨酸-鹽 酸緩沖溶液。
[0040] 3、染料濃度：固定其他試劑用量，測定體系在不用濃度染料時的共振瑞利散射強 度I，同時測定對應濃度染料的試劑空白1〇,用A I對染料濃度作圖，結果如圖7。在CTS-AB體 系中，AB濃度為1.0 X l(T5m〇l/L時，體系的A I最大，因此選擇1. 〇 X l(T5m〇l/L為AB的最佳濃 度。
[0041] 4、溫度的影響：考察了反應溫度對共振瑞利散射強度的影響。實驗考察了室溫 (23 ? 5 °C)、30 °C、40 °C、50 °C、60 °C、70 °C、75 °C、80 °C、90 °C 和 100 °C對殼聚糖-染料體系的影 響，結果發現溫度對共振瑞利散射強度有很大影響。圖8顯示，CTS-AB體系的共振瑞利散射 強度隨著溫度的上升急劇上升，故后續實驗均選擇l〇〇°C作為實驗條件。
[0042] 5、反應時間和穩定時間：在優化實驗條件下，考察了反應時間和穩定時間，CTS-AB 體系在水浴100 °C時反應lOmin即反應完全，4.5h內穩定。
[0043] 6、加入次序的影響：在優化實驗條件下，考察了溶液加入次序對共振瑞利散射強 度的影響，有二種加入次序：（1)殼聚糖-緩沖溶液-染料；（2)殼聚糖-染料-緩沖溶液； (3)染料-緩沖溶液-殼聚糖。CTS-AB體系三種加入次序測得三組RRS值用單因素方差分 析，在P>0.05，說明三組加入次序RRS值沒有統計學差異，三種加入次序對共振瑞利散射沒 有影響，后續實驗均使用第三種加入次序。
[0044] 7、離子強度的影響：考察離子強度的影響一般選用NaCl或者KC1。本研究均選用 NaCl作為考察離子強度影響。CTS-AB體系在NaCl濃度低于O.lmol/L時，對共振瑞利散射的 強度幾乎沒有影響。
[0045] 8、線性關系與檢出限：在優化條件下，制備CTS-AB的標準曲線。同時，選取標準曲 線中最低殼聚糖濃度，平行制備13份測試液，同時制備試劑空白（n=13)，測定后，根據標準 差和標準曲線斜率，算得該方法檢出限。結果見表1。
[0046] 表 1
[0048] 9、分子量的影響：從斜率顯著性檢驗結果:CTS-AB體系P = 0.448>0.05，說明這種 方法測定殼聚糖含量時不受殼聚糖分子量的影響。
[0049] 10、共存物質干擾：
[0050] 在選定條件下，實驗考察了多種常見物質對殼聚糖定量分析的影響，結果見表2。 CTS-AB體系對干擾物質的耐受比較好，是一種選擇性很好的方法。對于未知的樣品，很難知 道樣品中是否存在干擾物質。但是，金屬離子的存在與電導率是成正相關的。所以，我們在 3. Oyg/mL殼聚糖標準測試液中分別添加了 Fe3+，Ca2+，Mg2+，Cu2+，Zn 2+，測定其電導率，分別是 433.7±25.54ys/cm，431.7±16.56ys/cm，444.7±5.507ys/cm，427.7±6.351ys/cn^P 535.3±9.451y S/cm。三種殼聚糖樣品（奧利維殼聚糖膠囊、艾得蘭殼聚糖膠囊和殼聚糖負 載鑭除氟水樣）的電導率分別是 490.0 ± 5.196ys/cm，490.7 ± 8.083ys/cm 和 657.3 ± 16.26y s/cm，這說明樣品可能存在某種或某幾種干擾物質。在三種殼聚糖樣品中加入0.0001mol/L 的EDTA掩蔽劑后，三種殼聚糖樣品的電導率均低于200y S/cm。因此，在實際樣品測定時，能 將測定結果的相對誤差控制在低于5% (表3)。
[0051 ] 表2干擾物質的影響（cCTS:2.0yg/mL)
[0053]表3(ccTS:3.0lig/mL)
[0055] 應用例1
[0056] 使用本發明建立的共振瑞利散射法檢測市場上常規使用的兩類殼聚糖藥品，第一 類樣品是殼聚糖膠囊，包括奧利維和艾得蘭兩個品牌的膠囊，第二類樣品是殼聚糖負載鑭 除氟后的水樣品。檢測方法如下：
[0057] 1、樣品預處理：（1)殼聚糖膠囊:分別準確稱取0.0400g殼聚糖膠囊粉末(奧利維和 艾得蘭兩個品牌），用〇. 5mol/L的醋酸溶液溶解，定容至100mL，待完全溶解后于6000r/min 離心15min，取2.5mL上清液，加入O.Olmol/L的EDTA溶液lmL，后以純水定容至lOOmL，作為樣 品操作液。
[0058] (2)殼聚糖復合除氟劑脫氟后水樣:取1.00g殼聚糖，溶于60ml 5 %乙酸溶液，按鑭 與殼聚糖質量比為1:10加入硝酸鑭溶液，用5%氨水調節至pH5.0~6.0,攪拌反應60min，然 后滴加25 %氨水使改性殼聚糖完全析出，過濾，洗滌，70°C烘干，制得鑭改性殼聚糖吸附劑。 采用該吸附劑對8.95mg/L含氟水樣進行靜態除氟實驗，條件為:pH 4~8，140r/min振蕩速 度下于室溫吸附150min，過濾后得除氟后水樣。
[0059] 2、樣品含量測定及加標回收率實驗：于1 OmL比色管中加入一定體積的樣品操作 液，平行6份，同時制備試劑空白和殼聚糖標準曲線。計算樣品中殼聚糖含量，結果見表4。從 實驗結果看出，CTS-AB體系測定奧利維樣品殼聚糖平均含量964.0mg/g，艾得蘭樣品殼聚糖 平均含量為891.2mg/g，殼聚糖負載鑭除氟后水樣殼聚糖平均含量0.6124yg/mL，RSDS〇.94 ~1.26%。同時，進行標準加入法測定加標回收率，得CTS-AB體系三種樣品平均加標回收率 為 100.3~103.2%，RSD為2.7~4.8%。
[0060]表4樣品中殼聚糖測定結果
【主權項】
1. 水溶性苯胺藍在作為定量分析殼聚糖的探針中的應用。2. 以水溶性苯胺藍為探針的定量分析殼聚糖的方法。3. -種以水溶性苯胺藍為探針測定殼聚糖含量的方法，其特征在于，包括如下步驟： 標準曲線的繪制:配置η個成梯度濃度的殼聚糖溶液和1個空白試劑，向η個成梯度濃度 的殼聚糖溶液和1個空白試劑中分別加入2倍體積的甘氨酸-鹽酸緩沖溶液，然后再分別加 入等體積的水溶性苯胺藍，混合均勻后得到稀釋后的成濃度梯度的殼聚糖待測溶液，靜置 反應，檢測殼聚糖待測溶液的共振瑞利散射強度，具體為以Ae X=Aem進行同步掃描，記錄 RRS光譜，并于349nm處分別測量離子締合物的I和試劑空白的io, Δ1 = l-i〇,繪制標準曲 線，進一步得線性方程； 樣品檢測：向經過初步處理后的待測樣品的上清液中，加入2倍體積的甘氨酸-鹽酸緩 沖溶液，然后再加入等體積的水溶性苯胺藍，混合均勻后靜置反應，檢測共振瑞利散射強 度，由上述線性方程計算出待測樣品中殼聚糖的濃度。4. 根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述甘氨酸-鹽酸緩沖溶液的pH值為1.7。5. 根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述水溶性苯胺藍的濃度為1.0 Χ10-4 mol/L〇6. 根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述靜置反應的溫度為100°C，反應時間為 10min〇7. 根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述待測樣品初步處理的步驟如下：將待 測樣品用〇.5mol/L的醋酸溶液溶解，待完全溶解后離心，得上清液，上清液稀釋后用于共振 瑞利散射法檢測。8. 根據權利要求3所述的方法，其特征在于，向待測樣品中加入適量EDTA掩蔽劑降低離 子干擾物對殼聚糖的影響。9. 一種以水溶性苯胺藍為探針測定殼聚糖含量的方法，其特征在于，包括以下步驟： 標準曲線的繪制:在一系列10 . OOmL的比色管中，按先后順序分別加入lmL濃度分別為 0.1、0.5、1、3、5、10、20、30、35yg/mL的殼聚糖溶液，pHl. 7的甘氨酸-鹽酸緩沖溶液2. OOmL， 1.0 X 1(T4 mol/L水溶性苯胺藍1.00mL，以蒸餾水稀釋至刻度線，搖勻得到濃度分別為0.01、 0·05、0·10、0·30、0· 50、1·00、2· 00、3.00、3.5(^8/!1^的殼聚糖待測溶液，靜置反應10分 鐘，以Aex=Aem進行同步掃描，記錄RRS光譜，并于349nm處分別測量離子締合物的I和試劑 空白的Λ，Δ 1 = I-i〇，繪制標準曲線，進一步得線性方程； 樣品檢測：將〇.4g待測樣品用0.5mol/L的醋酸溶液溶解，定容至100mL，待完全溶解后 離心，取2.5mL上清液，并定容至100mL，作為樣品操作液，取lmL樣品操作液，加入2mL的pH為 1.7的甘氨酸-鹽酸緩沖溶液，再加入lmL的1.0 Χ10-4 mol/L水溶性苯胺藍，用水定容至 10mL，混合均勻后，靜置10分鐘，檢測共振瑞利散射強度，由線性方程計算出待測樣品中殼 聚糖的濃度。
【文檔編號】G01N21/63GK106053399SQ201610369656
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年5月27日
【發明人】白研, 蘇政權, 張偉愛, 馬彩娟
【申請人】廣東藥科大學