一種胖大海掃描電鏡樣品的制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種胖大海掃描電鏡樣品的制備方法。所述制備方法包括以下步驟：1)將胖大海對半縱切；2)對半縱切后的胖大海在37～65℃烘干72～168h；3)將步驟2得到的胖大海進行種皮和子葉分離；4)將步驟3得到的樣品放入熏染裝置內進行鋨酸熏染；5)熏染后的樣品在通風廚中通風15～30min使樣品表面殘存鋨酸揮發；6)將步驟5得到的樣品放入真空干燥器干燥2～4h；7)用鑷子輕夾取樣品的側面，保證觀察面向上，使用導電膠按順序將樣品牢固粘在金屬樣品臺上，放入離子濺射儀中進行噴金鍍膜及掃描電鏡觀測采圖。本發明的有益效果：本發明制成的樣品中保持胖大海較完整的外觀形態，掃描電鏡觀察時組織結構清晰，圖像立體感強，具有高效、簡便等優點。
【專利說明】
_種胖大海掃描電鏡樣品的制備方法
技術領域
[0001]本發明涉及掃描電鏡樣品的制備方法，具體是一種胖大海掃描電鏡樣品的制備方法。
【背景技術】
[0002]梧桐科植物干燥成熟種子胖大海具有清熱潤肺，利咽解毒，潤腸通便等作用，是傳統的藥食兩用中藥材。由于其具有較強的吸水膨脹特性，近年來還在滲透活性和推動劑等藥劑學研究領域引起重視。通過對胖大海超微結構的分析研究，對于深度挖掘其在生物醫學研究中的作用具有重要意義。
[0003]由于胖大海具有強的吸水膨脹特性，常規的掃描電鏡樣品制備時使用戊二醛固定液浸泡固定會使胖大海膨脹，外層種皮破裂，剝離脫落，中層和內層種皮剝離，在后續漂洗、脫水等制備過程中容易破損和丟失，影響整體結構的觀察和分析。
[0004]掃描電鏡技術是使用高能電子束對樣品表面進行轟擊，樣品被激發發射二次電子成像，獲得比光學顯微鏡觀察更精細的樣品結構特征，是醫學生物研究的重要手段。傳統的生物樣品掃描電鏡標本制備須使樣品內的游離水分充分置換出來，以免在掃描電鏡觀察時樣品因電子束轟擊產生水蒸氣遭遇高能電子流電離而放電，導致圖像模糊、霧狀，甚至無法成像的現象。因此，樣品的干燥程度成為成功制備掃描電鏡樣品的關鍵因素。
[0005]鋨酸是一種非電解質強氧化劑，作為生物樣品的固定劑，能與各種氨基酸、肽及蛋白質反應，在蛋白質分子間形成交聯，使蛋白質分子固定，還能與不飽和脂肪酸反應，通過形成鋨酸二酯鍵，使脂肪得以固定。鋨酸有較強的電子染色作用，經過鋨酸固定的樣品圖像有較好的反差，是電鏡技術中廣泛使用的優良固定劑，但鋨酸有劇毒且易升華揮發，對眼、鼻、喉粘膜有強烈的刺激作用，容易對人體和環境造成污染傷害。
[0006]由于胖大海獨特的吸水膨脹特性，導致在常規樣品制備過程中需要消耗大量的戊二醛和鋨酸固定液，而戊二醛和鋨酸為揮發性毒性試劑，不僅大大增加了實驗成本，也容易對操作人員和環境造成更大的污染。
[0007]目前，對胖大海顯微結構方面的研究技術尚不成熟，傳統的掃描電鏡樣品制備技術尚難以通過進行常規的固定、漂洗和脫水等而獲得胖大海結構完整的樣品，在掃描電鏡下觀察時存在胖大海結構破損的問題，而不固定和染色的樣品在觀察時則存在圖像不清晰的問題。因此，在國家自然科學基金(N0.81560608)、廣西自然科學基金(N0.2015GXNSFA139123)、廣西醫科大學青年科學基金(N0.GXMUYSF2014022)廣西醫科大學青年科學基金的資助下，本課題組對胖大海掃描電鏡制樣技術進行了改進，使得胖大海較完整的組織超微結構得到更好的呈現，解決了胖大海在常規掃描電鏡制樣過程中固定、漂洗和脫水過程中所出現的結構破壞丟失以及非固定染色樣品采集圖像不清晰等問題。同時也對解決該技術在應用于其他研究領域時所出現的類似問題提供一定的參考。
【發明內容】
[0008]本發明針對現有技術中的缺陷，提供一種胖大海掃描電鏡樣品的制備方法。
[0009]本發明解決上述技術問題的技術方案如下:
[0010]一種胖大海掃描電鏡樣品的制備方法，按以下步驟操作:
[0011]1.將胖大海對半縱切:用長形直鑷或夾片平行胚軸縱向固定胖大海，使用銳利刀片沿胖大海的胚軸垂直縱向對半剖開，避免兩片子葉的破損。
[0012]2.將步驟I縱向對半剖切后的胖大海在37?65°C烘干72?168h。
[0013]3.將步驟2得到的胖大海進行種皮和子葉分離，得到樣品。
[0014]4.將步驟3得到的樣品放入熏染裝置內進行鋨酸熏染，熏染條件:鋨酸溶液的質量濃度為I?2%，熏染條件為在4°C中熏染15?120min或室溫熏染5?60min，得到熏染后的樣品O
[0015]5.將步驟4熏染后的樣品在通風廚中通風15?30min使樣品表面殘存鋨酸揮發，得到無殘存鋨酸的樣品。
[0016]6.將步驟5無殘存鋨酸的樣品放入真空干燥器干燥2?4h，得到干燥無殘存鋨酸的樣品。
[0017]7.用鑷子輕夾取步驟6樣品的側面，保證觀察面向上，使用導電膠按順序將樣品牢固粘在金屬樣品臺上，放入離子濺射儀中進行噴金鍍膜，噴金鍍膜的條件:噴金時間總長3?5min，在總噴金時間內分5?15次噴鍍，噴鍍金屬膜厚度10?20nm。掃描電鏡進行觀測采圖。
[0018]上述步驟3中對步驟2得到的胖大海子葉側沿施加適當壓力，使干燥后的種皮與子葉實現鈍性分離并避免破裂。
[0019]上述步驟4中的熏染裝置能避免樣品直接接觸鋨酸溶液而利用鋨酸揮發蒸汽進行熏染，熏染后可進行鋨酸的回收和再利用。
[0020]本發明的優點或有益效果:
[0021]1.本發明通過將胖大海沿著胚軸縱向對半剖開，并對剖開后的種子進行烘干干燥，能夠使外層種皮包裹下的中層種皮、內層種皮和子葉組織內的水分進一步充分蒸發，利于后續的掃描電鏡樣品制備。
[0022]2.本發明解決了胖大海進行掃描電鏡樣品制備過程中，戊二醛和鋨酸固定液使用量大、毒性揮發性試劑容易揮發對人體和環境造成污染、固定液浸泡導致胖大海吸水膨脹，種皮破裂、剝離以致在后續制備過程中容易缺損和丟失、影響種子整體結構的觀察、樣品脫水不充分在電子束轟擊產生水蒸氣遭遇高能電子流電離放電導致圖像模糊、霧狀，甚至無法成像的現象等問題。
[0023]3.本發明對烘干后的種子進行鋨酸的熏染并在熏染后進行鋨酸的回收，不僅大大減少了劇毒物質鋨酸的使用，減少了其對人體和環境的影響，也通過使用鋨酸熏染對種子含有的蛋白質和脂質等成分進行了固定，有利于組織細胞結構的保存，減少了樣品在處理過程中的變形，增強了種子掃描電鏡成像的反差。
[0024]4.本發明使最后得到的樣品結構完整，無明顯破損、丟失現象，樣品結構清晰可現，圖像立體感強。
【附圖說明】
[0025]圖1是采用本發明制備方法得到的胖大海外層種皮的掃描電鏡圖像。
[0026]圖2是圖1中的掃描電鏡圖像進一步放大后的圖像。
[0027]圖3是采用本發明制備方法得到的子葉內表面的掃描電鏡圖像。
[0028]圖4是圖3中的掃描電鏡圖像進一步放大后的圖像。
【具體實施方式】
[0029]下面結合附圖和具體實施例對本發明作進一步詳細描述。
[0030]一種胖大海掃描電鏡樣品的制備方法，按以下步驟操作:
[0031 ] 1.將胖大海對半縱切:用長形直鑷或夾片平行胚軸縱向固定胖大海，使用銳利刀片沿胖大海的胚軸垂直縱向對半剖開，避免兩片子葉的破損。
[0032]2.將步驟I縱向對半剖切后的胖大海在37?65°C烘干72?168h。
[0033]3.將步驟2得到的胖大海進行種皮和子葉分離，得到樣品。
[0034]4.將步驟3得到的樣品放入熏染裝置內進行鋨酸熏染，熏染條件:鋨酸溶液的質量濃度為I?2%，熏染條件為在4°C中熏染15?120min或室溫熏染5?60min，得到熏染后的樣品O
[0035]5.將步驟4熏染后的樣品在通風廚中通風15?30min使樣品表面殘存鋨酸揮發，得到無殘存鋨酸的樣品。
[0036]6.將步驟5無殘存鋨酸的樣品放入真空干燥器干燥2?4h，得到干燥無殘存鋨酸的樣品。
[0037]7.用鑷子輕夾取步驟6樣品的側面，保證觀察面向上，使用導電膠按順序將樣品牢固粘在金屬樣品臺上，放入離子濺射儀中進行噴金鍍膜，噴金鍍膜的條件:噴金時間總長3?5min，在總噴金時間內分5?15次噴鍍，噴鍍金屬膜厚度10?20nm。掃描電鏡進行觀測采圖，得到的樣品圖像如圖1、圖2、圖3和圖4所示。
[0038]上述步驟3中對步驟2得到的胖大海子葉側沿施加適當壓力，使干燥后的種皮與子葉實現鈍性分離并避免破裂。
[0039]上述步驟4中的熏染裝置能避免樣品直接接觸鋨酸溶液而利用鋨酸揮發蒸汽進行熏染，熏染后可進行鋨酸的回收和再利用。
[0040]總之，以上所述僅為本發明的較佳實施例，凡依本發明申請專利范圍所作的均等變化與修飾，皆應屬本發明專利的涵蓋范圍。
【主權項】
1.一種胖大海掃描電鏡樣品的制備方法，其特征在于:操作步驟如下: 1)將胖大海對半縱切:用長形直鑷或夾片平行胚軸縱向固定胖大海，使用銳利刀片沿胖大海的胚軸垂直縱向對半剖開，避免兩片子葉的破損； 2)將步驟I)縱向對半剖切后的胖大海在37?65°C烘干72?168h; 3)將步驟2)得到的胖大海進行種皮和子葉分離，得到樣品； 4)將步驟3)得到的樣品放入熏染裝置內進行鋨酸熏染，熏染條件:鋨酸溶液的質量濃度為I?2%，熏染條件為在4°C中熏染15?120min或室溫熏染5?60min，得到熏染后的樣品; 5)將步驟4)熏染后的樣品在通風廚中通風15?30min使樣品表面殘存鋨酸揮發，得到無殘存鋨酸的樣品； 6)將步驟5)無殘存鋨酸的樣品放入真空干燥器干燥2?4h，得到干燥無殘存鋨酸的樣品; 7)用鑷子輕夾取步驟6)樣品的側面，保證觀察面向上，使用導電膠按順序將樣品牢固粘在金屬樣品臺上，放入離子濺射儀中進行噴金鍍膜，噴金鍍膜的條件:噴金時間總長3?5min，在總噴金時間內分5?15次噴鍍，噴鍍金屬膜厚度10?20nm，掃描電鏡進行觀測采圖。2.根據權利要求1所述的一種胖大海掃描電鏡樣品的制備方法，其特征在于:所述步驟3)中對步驟2)得到的胖大海子葉側沿施加適當壓力，使干燥后的種皮與子葉實現鈍性分離并避免破裂。3.根據權利要求1所述的一種胖大海掃描電鏡樣品的制備方法，其特征在于:所述步驟4)中的熏染裝置能避免樣品直接接觸鋨酸溶液而利用鋨酸揮發蒸汽進行熏染，熏染后可進行鋨酸的回收和再利用。
【文檔編號】G01N23/22GK106053178SQ201610613599
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年7月28日
【發明人】黃遠潔, 胡艷玲
【申請人】廣西醫科大學