一種基于納米材料自組裝的土霉素sers檢測方法
【專利摘要】本發明提供了一種基于納米材料自組裝的土霉素SERS檢測方法，用于魚粉等水產品中土霉素(OTC)含量的檢測。納米金顆粒(80nm粒徑)通過含OTC適配體的堿基序列與納米金顆粒(15nm粒徑)連接在一起，4?巰基苯甲酸孵育在納米金顆粒表面，由此產生拉曼信號。當OTC接觸檢測體系時,OTC適配體與OTC特異性結合，導致80nm納米金顆粒和15nm納米金顆粒距離縮小，熱點增強，拉曼信號增大，從而實現檢測目的。本檢測體系能夠定量檢測土霉素，線性范圍是0.046?460fg/mL，檢出限為0.004fg/mL。本發明用于土霉素檢測具有靈敏度高、快速簡便的優點,應用于魚粉等樣品的檢測，結果準確可靠。
【專利說明】
一種基于納米材料自組裝的土霉素 SERS檢測方法
技術領域
[0001] 本發明涉及納米材料和分析化學技術領域，具體涉及一種基于納米材料自組裝的 土霉素SERS檢測方法，用于對食品中土霉素進行檢測。
【背景技術】
[0002] 納米材料是指由納米結構單元構成的任何類型的材料，其顆粒尺寸一般為0.1~ 100nm。納米材料具有不同于宏觀材料的物理和化學性質，包括表面效應、小尺寸效應、量子 尺寸效應、宏觀量子隧道效應、催化性質等，這些特性使其在某些方面具有優良的先天應用 優勢。
[0003] 核酸適配體(Aptamer)是通過指數富集配體系統進化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)技術從體外篩選得到的，能與相應配體專一 性緊密結合的一類單鏈寡核苷酸序列。這種寡核苷酸序列形成的高級結構能夠特異性識 另IJ、高親和力結合與之對應的任何類型的蛋白和低分子等靶物質。與抗體相比，適配體的靶 分子范圍廣，篩選在體外進行，易于人工合成和修飾，分子量較小，穩定性好，對溫度不敏 感，容易保存。近年來，適配體作為識別分子已經在臨床診斷、臨床治療、蛋白質組研究和食 品安全檢測中逐漸得到廣泛應用。
[0004] 表面增強拉曼光譜(SERS)是檢測痕量物質的一種分析方法，可以在分子水平上給 出物質的指紋信息。它通常將化合物吸附在粗糙化的貴金屬、金屬納米粒子或者金屬氧化 物納米粒子的表面，使被測定化合物的散射信號具有了極大的增強效應，其增強系數可達 105到1014AERS光譜具有較高靈敏度、高選擇性、可定點研究和無損探測等很多優點，具有 廣闊的應用前景。
[0005] 土霉素（oxytetracycl ine，0TC)，分子式為C22H24N209，分子量460 ? 44，是一種被 廣泛用于治療奶牛乳房炎等疾病的廣譜抗菌藥物，同時土霉素又是一種抗生素和生長促進 劑，常常被用作飼料添加劑。因此，土霉素極易殘留在牛奶和動物組織中。但與此同時，土霉 素能與人體內的鈣結合，導致人體缺鈣，長期使用能產生耐藥菌株，給人體健康造成損害。 世界糧農組織、世界衛生組織、歐盟及我國政府對牛奶中土霉素的殘留都做出了嚴格的規 定，其殘留限量不得高于l〇〇yg/L。因此，控制土霉素的使用，實施對動物性食品中土霉素及 有害代謝產物殘留的檢測就顯得愈發的重要。
[0006] 本發明首先將80nm粒徑納米金顆粒通過含有0TC適配體的莖環結構的堿基序列與 15nm粒徑的納米金顆粒連接在一起，拉曼分子4-疏基苯甲酸以Au-S鍵結合在15nm納米金顆 粒的表面，由此產生拉曼信號。當0TC接觸檢測體系時，堿基序列中的0TC適配體一方面與 0TC發生特異性結合，另一方面與0TC適配體的互補鏈解旋，導致80nm粒徑納米金顆粒和 15nm粒徑納米金顆粒之間的距離縮小，熱點增強，拉曼信號增大，從而實現檢測的目的。在 一定范圍內，0TC濃度與拉曼強度的增強量呈正相關，在632.8nm的激發光源下建立標準曲 線，以達到對土霉素定量檢測的目的。該發明可以用于魚粉、牛奶、肉及肉制品等樣品中土 霉素含量的檢測。
【發明內容】
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[0007] 本發明的目的在于將納米材料與土霉素適配體結合應用于表面增強拉曼對土霉 素進行快速、準確的定量檢測，特別涉及到納米材料與適配體結合應用于土霉素的表面增 強拉曼檢測中應用。
[0008] 為了實現上述目的，本發明采用如下技術方案：
[0009] (1)通過兩步生長法，制備80nm的納米金顆粒。
[0010] (2) 土霉素適配體的活化。
[0011] (3)取lmL 80nm膠體金向其中加入同體積的lyM的土霉素適配體溶液，于37°C搖床 上孵育12h。孵育結束后，使用緩沖液(NaCl 5mM，Tris 5mM)離心清洗3次，分別收集上清和 材料，清洗結束后使用緩沖液將反應體系補齊到初始體積。
[0012] (4)80nm膠體金表面的鈍化。
[0013] (5)利用通過親和素（Avidin)與生物素（Biotin)之間的特異性結合將親和素 (Avidin)與生物素〇3;1〇1:;[11)修飾的土霉素適配體0嫩連接。
[0014] (6)利用親和素(Avidin)與納米金的靜電吸附作用將修飾80nm納米金顆粒的土霉 素適配體與粒徑在15nm左右的納米金顆粒連接。
[0015] (7)利用Au-S鍵的作用將粒徑約為15nm左右的納米金顆粒與拉曼分子4-巰基苯甲 酸結合。
[0016] (8)通過土霉素適配體DNA與土霉素特異性結合，莖環結構的DNA堿基互補配對的 部分發生解旋，使得80nm膠體金和15nm膠體金的距離拉近，熱點增強，拉曼信號強度增大。 [0017] (9)對土霉素標準品進行檢測，建立標準曲線。配制不同濃度的土霉素標準品加入 到納米復合物體系中，37°C孵育lOmin，在632.8nm激光激發下，采集時間為15s，循環次數為 1次，空白組檢測得到的拉曼強度(10)最小，隨著土霉素濃度的增加拉曼強度(I)逐步增加。 根據拉曼強度發光差值(AI = I-I0)與對應的土霉素標準品濃度建立標準曲線，實驗結果 在0.046-460f g/mL區間內得到良好線性關系。
[0018] (10)對土霉素樣品進行檢測：對樣品做簡單的處理，隨后直接加入到上述納米復 合物體系中37 °C孵育lOmin后，在632.8nm激光下得到對應的拉曼光譜，從標準曲線中求得 對應的土霉素的濃度。
[0019] 本發明的優點是：
[0020] (1)利用適配體對被檢測物質實現特異性捕獲，有效提高了檢測的穩定性和準確 性。
[0021] (2)利用適配體與抗體相比較，具有可人工合成，不依賴動物和細胞，周期短、成本 低、批次間差異小，便于化學修飾，穩定性也好，可長期保存。
[0022] (3)本實驗靈敏度高，特異性強，為土霉素的快速定量檢測提供了新方法。
【附圖說明】
[0023]圖1:基于納米材料自組裝的土霉素SERS檢測方法的實驗原理圖；
[0024]圖2:80nm膠體金透射電鏡圖(A) ;15nm膠體金透射電鏡圖（C);
[0025] 80nm膠體金紫外吸收圖（B); 15nm膠體金紫外吸收圖（D);
[0026] 圖3: 土霉素適配體在80nm膠體金表面上孵育前后的紫外吸收圖；
[0027] 圖4:親和素和土霉素適配體孵育前后的紫外吸收圖；
[0028]圖5: 土霉素檢測的拉曼光譜(A)及標準曲線圖(B)
【具體實施方式】
[0029] 本發明包括但不限于以上實施例，凡是在本發明的精神和原則下進行的任何等同 替換或者局部改進，都將視為在本發明的保護范圍之內。
[0030] 實施例1
[0031 ] 通過兩步生長法，制備80nm左右的納米金顆粒包括以下步驟：
[0032] 1)首先，合成15nm左右的納米金顆粒，通過以下步驟:取2.5mL氯金酸溶液(0.2 % ) 加入到50mL水中煮沸，劇烈攪拌下加入2mL檸檬酸鈉（1%，含0.05%檸檬酸），溶液煮沸 5min，自然冷卻，進行紫外和透射電鏡的表征（圖2A、圖2B)。
[0033] 2)其次，進行第一步的生長，具體步驟如下：將3mL納米金顆粒（15nm左右)稀釋至 2 0 m L后加入到圓底燒瓶中，在劇烈攪拌下依次向圓底燒瓶中加入10 m L的氯金酸溶液 (0.04% )和1 OmL的抗壞血酸（1 % )和檸檬酸鈉（1 % )的混合液，劇烈攪拌45min，然后加熱煮 沸30min，自然冷卻，即得一步生長所得納米金溶液。
[0034] 3)最后，進行第二步的生長，也即最后一步的生長。具體步驟如下:將4.5mL第一步 生長所得的納米金顆粒稀釋至20mL后加入到圓底燒瓶中，在劇烈攪拌下依次向圓底燒瓶中 加入1 OmL的氯金酸溶液(0.04 % )和1 OmL的抗壞血酸（1 % )和檸檬酸鈉（1 % )的混合液，劇烈 攪拌45min，然后加熱煮沸30min，自然冷卻，即得80nm左右的納米金顆粒。所得納米金進行 紫外和透射電鏡的表征（圖2C、圖2D)
[0035] 實施例2
[0036] 土霉素適配體的活化，具體步驟如下：
[0037]首先是將適配體的水溶液置于65°C的水浴中退火30min，待其緩慢地自然冷卻至 室溫后，向其加入適配體體積的1 % ImM三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽，室溫下靜置lh，以活化巰基 修飾的莖環DNA。
[0038] 實施例3
[0039]膠體金與土霉素適配體之間的連接，步驟如下：
[0040] 取lmL 80nm膠體金向其中加入同體積的lyM的土霉素適配體溶液，于37°C搖床上 孵育12h。孵育結束后，使用緩沖液(NaCl 5mM，Tris 5mM)3500rpm離心15min，清洗3次，分別 收集上清和材料，進行紫外表征（圖2A)和核酸含量的測定（圖2B)清洗結束后使用緩沖液將 反應體系補齊到初始體積。
[0041 ] 實施例4
[0042] 80nm膠體金表面的鈍化，具體步驟如下：
[0043]向反應體系中加入0.1ml O.lmM 6-巰基-1-正己醇，鈍化lh。鈍化結束后使用緩沖 液(NaCl 5mM，Tris5mM)離心清洗一次，棄去上清，收集材料，方法同實施例3中的步驟。
[0044] 實施例5
[0045] 利用通過親和素（Avidin)與生物素（Biotin)之間的特異性結合將親和素 (Avidin)與生物素(Biotin)修飾的土霉素適配體DNA連接。具體步驟如下：
[0046] 向實施例4中離心清洗去掉上清液的反應體系中加入lml 0.5mg/ml的親和素水溶 液。37 °C搖床上孵育12h。孵育結束后上述的離心條件離心清洗3次，分別收集上清和材料， 進行紫外的表征(圖3)
[0047] 實施例6
[0048]利用親和素(Av i d i n)與納米金的靜電吸附作用將修飾80nm納米金顆粒的土霉素 適配體與粒徑在15nm左右的納米金顆粒連接。具體方法為：
[0049] 向實施例5中經過離心清洗去掉上清的反應體系中，加入lml的納米金顆粒，在37 °C搖床中孵育12h，孵育結束后用水以1 OOOOrpm離心1 Omin，分別收集上清和材料。
[0050] 實施例7
[0051] 利用Au-S鍵的作用將粒徑約為15nm左右的納米金顆粒與拉曼分子4-巰基苯甲酸 結合。具體步驟如下：
[0052] 向實施例6中的材料中加入lml ImM 4-巰基苯甲酸，37°C搖床中孵育12h，3500rpm 離心15min，收集上清和材料，并且向材料中加入lml緩沖液(NaCl 5mM，Tris 5mM)，4°C儲存 備用。
[0053] 實施例8
[0054] 進行土霉素的SERS檢測。通過土霉素適配體DNA與土霉素特異性結合，莖環結構的 DNA堿基互補配對的部分發生解旋，使得80nm膠體金和15nm膠體金的距離拉近，熱點增強， 拉曼信號強度增大。具體方法為:在反應體系與土霉素接觸之前進行一次拉曼信號的檢測。 取lml ImM土霉素加入到(6)中所得的材料，37°C水浴10min，相同的參數條件下進行靶標接 觸后的拉曼檢測。
[0055] 實施例9
[0056]對土霉素標準品進行檢測，建立標準曲線。具體步驟如下：
[0057] 將用超純水依次將土霉素稀釋為如下的濃度梯度：0.046fg/mL，0.46fg/mL， 4.6f g/mL，46f g/mL，460f g/mL，分別取lml的稀釋液加入到同等體積的反應體系中，37 °C水 浴lOmin，在以下的參數設定下進行拉曼多光譜掃描檢測：激發光源為632.8nm，采集時間 15s，循環次數1次，拉曼位移1000-1800cm-l，光柵600gr/min，顯微物鏡x5vis，狹縫200，公 焦針孔600。
[0058]根據拉曼強度值與對應的土霉素標準品濃度建立標準曲線：y = 49.51X+649.66， 其檢測線性范圍為 0 ? 〇46fg/ml ~460fg/ml (R2 = 0 ? 9979)
[0059] 實施例10
[0060]魚粉實際樣品中土霉素的檢測及加標回收率實驗
[0061]以實施例9得到的3組土霉素濃度數據為本底值，分別向其中加入三種不同濃度的 0TC標準品，同樣利用本發明方法再次檢測其中0TC的含量，得到檢測值。回收率％ =(檢測 值-本底值)/添加量X100%。從表一數據可以看到回收率在91.29%~110.98%，說明本發 明穩定，靈敏，準確，適用于魚粉實際樣品中0TC的檢測。
[0062]表一:魚粉實際樣品中土霉素的檢測及加標回收率
【主權項】
1. 一種基于納米材料自組裝的土霉素 SERS檢測方法，其特征在于:此拉曼增強基底為 金屬納米顆粒和堿基序列的自組裝方式，所述的金屬納米顆粒包括直徑在80nm的納米金顆 粒和直徑在15nm的納米金顆粒，所述堿基序列為含有土霉素(OTC)適配體的莖環結構的堿 基序列，納米金顆粒通過含有OTC適配體的莖環結構的堿基序列與納米金顆粒連接在一起， 拉曼分子4-巰基苯甲酸孵育以Au-s鍵結合在納米金顆粒的表面，由此產生拉曼信號，當OTC 接觸檢測體系時，堿基序列中的OTC適配體一方面與OTC發生特異性結合，另一方面與OTC適 配體的互補鏈解旋，導致80nm左右粒徑納米金和13nm左右粒徑納米金顆粒之間的距離縮 小，熱點增強，拉曼信號增大，從而實現檢測的目的。在一定范圍內，OTC濃度與拉曼強度的 增強量呈正相關，在632.8nm的激發光源下建立標準曲線，以達到對土霉素定量檢測的目 的。2. 如權利要求1所述的一種基于納米材料自組裝的土霉素 SERS檢測方法，其特征在于： 合成不同粒徑的納米金應用于土霉素的檢測。3. 如權利要求1所述的一種基于納米材料自組裝的土霉素 SERS檢測方法，其特征在于： 堿基序列以Au-S鍵結合在不同粒徑納米金顆粒的表面。4. 如權利要求1所述的一種基于納米材料自組裝的土霉素 SERS檢測方法，其特征在于： 土霉素的堿基序列為：5'-Biotin-ACC GCA CCA CCG TCA TGA GTG CGA ACT TAC GCA CTC ATG ACG GTG GTG CGG TGG TG-3'，第26個和27個堿基之間修飾巰基。5. 如權利要求1所述的一種基于納米材料自組裝的土霉素 SERS檢測方法，其特征在于： 所述方法能夠用于魚粉等水產品及其制品中土霉素的檢測。
【文檔編號】G01N1/44GK106052872SQ201610382439
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月1日
【發明人】王周平, 孟凡偉, 馬小媛, 段諾, 吳世嘉
【申請人】江南大學