一種糧食樣品中硒形態的測定方法
【專利摘要】本發明涉及一種糧食樣品中硒形態的測定方法，包括如下步驟：1）檢測的前期準備；2）糧食樣品硒形態的提取；3）建立HPLC-HGAFS聯用技術；4）上機測試與結果計算。該方法成本低，操作簡便，提取效率高，可同時準確測定硒代胱氨酸（SeCys2）、甲基硒代半胱氨酸（MeSeCys）、亞硒酸鈉（Na2SeO4）、硒代蛋氨酸（SeMet）和硒酸鈉（Na2SeO4）五種硒形態和含量。
【專利說明】
一種糧食樣品中砸形態的測定方法
技術領域
[0001] 本發明涉及一種糧食樣品中硒形態的測定方法，屬于分析化學領域。
【背景技術】
[0002] 硒是人體必須的微量元素之一，是谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px)的組成成分，具 有清除體內自由基、抗細胞脂膜過氧化、抗衰老、抗癌防癌、拮抗重金屬毒性等生物學功能。 硒缺乏會導致克山病、白肌病、地方性癌癥等疾病的發病率增高。我國有2/3的地區缺硒， 其中1/3地方嚴重缺硒。根據我國13省份普查顯示，人均每日硒攝入量僅為36微克，低于 世界衛生組織推薦的日常攝入量50微克的標準，也達不到中國營養學院建議的50-200微 克的攝入量，我國居民普遍缺硒。提高我國居民的日常硒攝入量，對于改善國民健康有重大 意義。
[0003] 但是，科學、合理地補硒不但要提高人體攝入硒的總量，也要關注人體對于硒的可 吸收利用性。研究表明，不同形態硒的吸收利用性、安全性有較大差異。無機硒的吸收效果 和安全性遠遠不及有機硒。
[0004] 我國居民的膳食結構以植物性食品為主，且植物性食品也是居民攝入硒的主要來 源。因此，測定植物中的硒形態，對于指導居民科學補硒，開發安全高效的富硒食品，具有指 導意義。
[0005] 目前，測試主要硒形態的主要技術為氣相色譜（GC)、電泳（CE)高效液相色譜 (HPLC)等與HGAFS (高壓液相色譜一氫化物發生原子熒光分析)、ICP-MS (電感耦合等離 子體質譜）聯用技術。但是GC對于硒代氨基酸和硒代蛋白等非揮發性的硒化物的檢測 存在較多的困難；CE在與ICP-MS聯用時，所需流速不同，限制其發展應用；現在主要采用 HPLC技術。如：富硒植物材料中硒形態的測定方法（中國專利申請號201110428248. 4)中 利用HPLC-HGAFS檢測富硒植物中硒代胱氨酸（SeCys2)、甲基硒代半胱氨酸（MeSeCys )、 硒代蛋氨酸（SeMet)和亞硒酸鈉（Na2Se04)四種硒態。但由于所用試劑的差異，該方法無 法檢測出硒的六價形態。植物硒形態的檢測方法（中國專利申請號201210215457. 5)中 采用HPLC-ICP-MS聯用技術分析植物樣品中的硒代胱氨酸（SeCys2)、甲基硒代半胱氨酸 (1〇36〇5^)、硒代蛋氨酸（36161:)、亞硒酸鈉（似 236〇4)和硒酸鈉（似236〇4)五種硒態。水 產品中硒形態的檢測方法（中國專利申請號201310376921. 3)利用HPLC-HGAFS聯用技術 分析水產品中的硒代胱氨酸（SeCys2)、硒代蛋氨酸（SeMet)、亞硒酸鈉（Na 2Se04)和硒酸鈉 (Na2Se04)四種硒態，該方法主要用于對水產品中硒形態的測定，沒有探討對糧食樣品中硒 形態測定的適用性。但是，目前ICP-MS價格昂貴，檢測成本高，不易推廣；而采用HGAFS技 術的方法檢測硒形態種類又不完善，并且這些方法中都沒有提到樣品中硒的提取率，有可 能檢出硒僅為樣品中總硒的少部分。
【發明內容】
[0006] 有鑒于此，本發明的目的在于提供一種成本相對較低、硒形態種類檢測完備且操 作簡便、提取效率高的糧食樣品中硒形態的測定方法。
[0007] 為了達到上述目的，本發明的技術方案如下： 本發明所述糧食樣品中硒形態的測定方法，包括如下步驟： 1)檢測的前期準備： i) 設備：HPLC-HGAFS (型號為 LC20AB-SAP-10-AFS9230,色譜柱 Hamilton PRP-X100)、 天平、粉碎機、烘箱、超聲清洗器(型號KQ-610)、搖床、離心機； ii) 試劑：Tris-HCl、蛋白酶K、蛋白酶XIV、纖維素酶、KI、NaOH、NaBH4、鹽酸、甲酸、 (ΝΗ4) 2ΗΡ04、硒代胱氨酸（SeCys2)、甲基硒代半胱氨酸（MeSeCys)、硒代蛋氨酸（SeMet)、亞硒 酸鈉（Na 2Se04)和硒酸鈉（Na2Se04)標準物質、18. 2 ΜΩ水。
[0008] 2)糧食樣品砸形態的提取： i) 稱取供干、粉碎、過篩后的糧食樣品，加入100 mmol/L Tris-HCl進彳丁提取，超聲； ii) 提取后，加入纖維素酶對糧食樣品進行破壁處理，恒溫振蕩； iii) 依次加入蛋白酶K、蛋白酶XIV進行水解提取，恒溫振蕩，在4°C下，10000轉/分， 離心30 min，上清液過0. 22 μ m濾膜，得到待測溶液。
[0009] 3)建立HPLC-HGAFS (高壓液相色譜一氫化物發生原子熒光分析）聯用技術： i) 儀器條件：流動相（40 mmol/L(NH4)2HP04, pH 6. 0);流速 1 mL/min ;進樣體積 100 μ L ;蠕動栗轉速65 rpm ;燈電流/輔陰極：100mA，45mA ;光電倍增管負高壓：300V ;載氣流 速：300mL/min ;屏蔽氣流速：700mL/min ; ii) 氫化物發生條件：還原劑成分：〇. 35wt%Na0H+l. 2wt%NaBH4，流速：6 mL/min ;氧化劑 成分：0· 5wt% NaOH+lwt% KI，流速：6 mL/min ;載流：10wt% HC1，流速：6 mL/min ； iii) 配制硒代胱氨酸（SeCys2)、甲基硒代半胱氨酸（1636〇}^)、亞硒酸鈉（似236〇 4)、硒 代蛋氨酸（SeMet)和硒酸鈉（Na2Se04)混標，建立五種硒形態標準溶液的色譜圖。
[0010] 4)上機測試與結果計算： 樣品中待測物硒代胱氨酸（SeCys2)、甲基硒代半胱氨酸（MeSeCys)、亞硒酸鈉 (Na2Se04)、硒代蛋氨酸（SeMet)和硒酸鈉（Na2Se0 4)的含量可由下式計算得： X=CXVXF/m 式中： X-樣品中待測物質的含量，yg/kg; C一待測液中該物質的濃度，μ g/L; V一測定液體總體積，mL ; F-稀釋倍數； m-稱樣質量，g。
[0011] 作為優選方案，其中所述步驟2)中，稱取樣品質量為0. 1-0. 2 g。
[0012] 作為優選方案，其中所述步驟2)中，樣品與提取液Tris-HCl的固液比為1 : 25-1:100。
[0013] 作為優選方案，其中所述步驟2)中，超聲提取時間為10-30 min，超聲功率600 W， 超聲頻率40 KHZ。
[0014] 作為優選方案，其中所述步驟2)中，纖維素酶與糧食樣品的質量比為1:1-1:10， 破壁處理溫度控制在40-55°C，振蕩轉速150-200 rpm，振蕩時間30 min-2 h。
[0015] 作為優選方案，其中所述步驟2)中，蛋白酶K與糧食樣品的質量比為1 :20-1:100， 水解溫度控制在40-55°C，振蕩轉速150-200 rpm，振蕩時間4 h-12 h。
[0016] 作為優選方案，其中所述步驟2)中，蛋白酶XIV與糧食樣品的質量比為 1:20-1:100,水解溫度控制在30-45°C，振蕩轉速150-200 rpm，振蕩時間4 h-12 h。
[0017] 作為優選方案，其中所述糧食樣品為小麥或玉米。
[0018] 相比現有技術，本發明具有以下有益效果： 1、 采用超聲提取，結合多種酶，硒的提取效率高，提取率可達80%以上，且酶用量少，節 約成本，提取過程操作簡便，易于重復； 2、 相較于現有方法，可以同時準確測定硒代胱氨酸（SeCys2)、甲基硒代半胱氨酸 (MeSeCys)、亞硒酸鈉（Na 2Se04)、硒代蛋氨酸（SeMet)和硒酸鈉（Na2Se04)五種硒形態和含 量，且其最低檢出限相當低。
【附圖說明】
[0019] 圖1為各種硒形態的標準分離譜圖。
【具體實施方式】
[0020] 下面結合【具體實施方式】對本發明作進一步說明。
[0021] 以下實施例用于說明本發明，但不能用來限制本發明的范圍。實施例中采用的實 施條件可以根據具體條件作進一步調整，未說明的實施條件通常為常規實驗中的條件。
[0022] 實例1 :小麥中硒形態的測定 1)檢測的前期準備： i) 設備：HPLC-HGAFS (型號為 LC20AB-SAP-10-AFS9230,色譜柱 Hamilton PRP-X100)、 天平、粉碎機、烘箱、超聲清洗器(型號KQ-610)、搖床、離心機； ii) 試劑：Tris-HCl、蛋白酶K、蛋白酶XIV、纖維素酶、KI、NaOH、NaBH4、鹽酸、甲酸、 (ΝΗ 4) 2ΗΡ04、硒代胱氨酸（SeCys2)、甲基硒代半胱氨酸（MeSeCys)、硒代蛋氨酸（SeMet)、亞硒 酸鈉（Na 2Se04)和硒酸鈉（Na2Se04)標準物質、18. 2 ΜΩ 7K，酶和標準物質均采購于Sigma公 司。
[0023] 2)小麥硒形態的提取： i) 稱取烘干、粉碎、過100目篩后的〇.2g小麥粉于15 mL塑料離心管中，加入5 mL提 取緩沖液100 mm〇l/L Tris-HCl，超聲提取20 min，超聲功率600 W，超聲頻率40 KHZ; ii) 加入纖維素酶40 mg，50°C，恒溫振蕩培養lh，振蕩轉速為180 rpm ; iii) 加入0.5 mg蛋白酶K，50°C，恒溫振蕩培養8 h，振蕩轉速為180 rpm，再加入0.5 mg蛋白酶XIV，37°C，恒溫振蕩培養8 h，振蕩轉速為180 rpm，然后在4°C下，10000轉/ 分，離心30 min，上清液過0. 22 μ m的濾膜后，制備得到上機待測液； 3)建立HPLC-HGAFS (高壓液相色譜一氫化物發生原子熒光分析）聯用技術： i)將液相色譜設置為流動相（40 mmol/L(NH4)2HP04, pH 6. 0);流速1 mL/min ;進樣體 積100 μ L ;蠕動栗轉速65 rpm ;燈電流/輔陰極：100mA，45mA ;光電倍增管負高壓：300V ; 載氣流速：300mL/min ;屏蔽氣流速：700mL/min ;氫化物發生條件設置為：還原劑成分：0. 35 wt %NaOH+l. 2 wt %NaBH4,流速：6 mL/min ;氧化劑成分：0· 5wt% NaOH+lwt% KI，流速：6 mL/ min ;載流：10 wt % HC1，流速：6 mL/min ; ii)配制20、40、60、80、100 ng/g混標，待儀器穩定后，做標準曲線，上機測定待測溶 液；在上述條件下硒代胱氨酸（SeCys2)、硒甲基半胱氨酸（MeSeCys)、Se(IV)、硒代蛋氨酸 (SeMet)和 Se (VI)的保留時間依次為：2. 6 min，3. 2 min，4. 0 min，5. 0 min 和 12. 2 min ; 待測液色譜峰保留時間與標準溶液相比變化范圍在±5%之內即認為其為該待測物質；根 據檢測結果計算得到樣品中各種硒形態含量。
[0024] 結果分析： 1)圖1顯示標準溶液中五種硒形態的色譜圖，表明五種硒形態均能得到有效分離，且 峰形良好。
[0025] 2)儀器的檢出限及精密度，見表1。
[0026] 表1.儀器的檢出限及精密度的要求
從表1中可以看出，五種硒形態均具有良好的線性范圍、相關系數和檢出限，說明本發 明檢測結果準確可靠，重復性好和精確度高。
[0027] 3)小麥中硒形態的結果，見表2。
[0028] 表2.小麥中硒形態的測定結果
從表2中可以看出，小麥中的總硒含量為22. 3 ± 0.025 mg/kg，則小麥硒提取率為 92%。表明本發明硒的提取效率高。
[0029] 4)加標回收實驗結果，見表3。表3結果顯示，五種硒形態的加標回收率在 91. 1-120%之間，回收效果理想。
[0030] 表3五種硒形態加標回收率的測定結果
實例2 :玉米中硒形態的測定 1)檢測的前期準備： i) 設備：HPLC-HGAFS (型號為 LC20AB-SAP-10-AFS9230,色譜柱 Hamilton PRP-X100)、 天平、粉碎機、烘箱、超聲清洗器(型號KQ-610)、搖床、離心機； ii) 試劑：Tris-HCl、蛋白酶K、蛋白酶XIV、纖維素酶、KI、NaOH、NaBH4、鹽酸、甲酸、 (ΝΗ4) 2ΗΡ04、硒代胱氨酸（SeCys2)、甲基硒代半胱氨酸（MeSeCys)、硒代蛋氨酸（SeMet)、亞硒 酸鈉（Na 2Se04)和硒酸鈉（Na2Se04)標準物質、18. 2 ΜΩ 7K，酶和標準物質均采購于Sigma公 司。
[0031] 2)玉米硒形態的提取： i) 稱取烘干、粉碎、過100目篩后的〇.2g玉米粉于15 mL塑料離心管中，加入5 mL提 取緩沖液100 mm〇l/L Tris-HCl，超聲提取20 min，超聲功率600 W，超聲頻率40 KHZ; ii) 加入纖維素酶40 mg，50°C，恒溫振蕩培養lh，振蕩轉速為180 rpm ; iii) 加入0.5 mg蛋白酶K，50°C，恒溫振蕩培養8 h，振蕩轉速為180 rpm，再加入0.5 mg蛋白酶XIV，37°C，恒溫振蕩培養8 h，振蕩轉速為180 rpm，然后在4°C下，10000轉/ 分，離心30 min，上清液過0. 22 μ m的濾膜后，制備得到上機待測液； 3)建立HPLC-HGAFS (高壓液相色譜一氫化物發生原子熒光分析）聯用技術： i) 將液相色譜設置為流動相（40 mmol/L(NH4)2HP04, pH 6. 0);流速1 mL/min ;進樣體 積100 μ L ;蠕動栗轉速65 rpm ;燈電流/輔陰極：100mA，45mA ;光電倍增管負高壓：300V ; 載氣流速：300mL/min ;屏蔽氣流速：700mL/min ;氫化物發生條件設置為：還原劑成分：0. 35 wt %NaOH+l. 2 wt %NaBH4,流速：6 mL/min ;氧化劑成分：0· 5wt% NaOH+lwt% KI，流速：6 mL/ min ;載流：10 wt % HC1，流速：6 mL/min ; ii) 配制20、40、60、80、100 ng/g混標，待儀器穩定后，做標準曲線，上機測定待測溶 液；在上述條件下硒代胱氨酸（SeCys2)、硒甲基半胱氨酸（MeSeCys)、Se(IV)、硒代蛋氨酸 (SeMet)和 Se (VI)的保留時間依次為：2. 6 min，3. 2 min，4. 0 min，5. 0 min 和 12. 2 min ; 待測液色譜峰保留時間與標準溶液相比變化范圍在±5%之內即認為其為該待測物質；根 據檢測結果計算得到樣品中各種硒形態含量。
[0032] 結果分析： 1)玉米中硒形態的測定結果，見表4。表4結果顯示，玉米中的總硒含量為12.81 土 1. 56 mg/kg，則硒的提取率為91%，表明本發明硒的提取效率高。
[0033] 表4.玉米中硒形態的測定結果
2)加標回收實驗結果，見表5。表5結果顯不，五種硒形態的加標回收率在90-107. 4% 之間，回收效果理想。
[0034] 表5.五種硒形態加標回收率的測定結果
上述實例只為說明本發明的技術構思及特點，其目的在于讓熟悉此項技術的人能夠了 解本發明的內容并據以實施，并不能以此限制本發明的保護范圍。凡根據本發明精神實質 所作的等效變換或修飾，都應涵蓋在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 一種糧食樣品中硒形態的測定方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟： 1)糧食樣品砸形態的提取： 1) 稱取供干、粉碎、過篩后的糧食樣品，加入100 mmol/L Tris-HCl進彳丁超聲提取； ii) 提取后，加入纖維素酶對糧食樣品進行破壁處理，恒溫振蕩； iii) 依次加入蛋白酶K、蛋白酶XIV進行水解提取，恒溫振蕩，在4°C下，10000轉/分， 離心30 min，上清液過0. 22 μ m濾膜，得到待測溶液； 2) 建立HPLC-HGAFS聯用技術： i) 儀器條件：流動相：40 mmol/L(NH4)2HP04, pH 6. 0 ;流速 1 mL/min ;進樣體積 100 μ L ;蠕動栗轉速65 rpm ;燈電流/輔陰極：100mA，45mA ;光電倍增管負高壓：300V ;載氣流 速：300mL/min ;屏蔽氣流速：700mL/min ; ii) 氫化物發生條件：還原劑成分：〇. 35wt%NaOH+l. 2wt%NaBH4，流速：6 mL/min ;氧化劑 成分：0· 5wt% NaOH+lwt% KI，流速：6 mL/min ;載流：10wt% HC1，流速：6 mL/min ； iii) 配制硒代胱氨酸SeCys2、甲基硒代半胱氨酸MeSeCys、亞硒酸鈉 Na2Se04J?代蛋氨 酸SeMet和硒酸鈉 Na2Se<Vg#，建立五種硒形態標準溶液的色譜圖； 3) 上機測試與結果計算： 樣品中待測物硒代胱氨酸SeCys2、甲基硒代半胱氨酸MeSeCys、亞硒酸鈉 Na2Se04、硒代 蛋氨酸SeMet和硒酸鈉 Na2Se04的含量由下式計算得： X=CXVXF/m 式中： X-樣品中待測物質的含量，yg/kg; C一待測液中該物質的濃度，μ g/L; V一測定液體總體積，mL ; F-稀釋倍數； m-稱樣質量，g。2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟1)中，稱取樣品的質量為 0. 1-0. 2 g〇3. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟1)中，樣品與提取液Tris-HCl 的固液比為1 :25-1:100。4. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟1)中，超聲提取時間為10-30 min，超聲功率為600 W，超聲頻率40 KHZ。5. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟1)中，纖維素酶與糧食樣品的質 量比為1:1-1:10,破壁處理溫度控制在40-55°C，振蕩轉速150-200 rpm，振蕩時間30 min-2 h〇6. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟1)中，蛋白酶K與糧食樣品的質 量比為1:20-1:100，水解溫度控制在40-55°(：，振蕩轉速150-200印111，振蕩時間4 11-12 11。7. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟1)中，蛋白酶XIV與糧食樣品的 質量比為1:20-1:100,水解溫度控制在30-45°C，振蕩轉速150-200 rpm，振蕩時間4 h-12 h〇8. 根據權利要求1-7任一所述的方法，其特征在于，所述糧食樣品為小麥或玉米。
【文檔編號】G01N30/88GK106033081SQ201510113923
【公開日】2016年10月19日
【申請日】2015年3月16日
【發明人】黃陽, 劉穎, 朱元元
【申請人】中國科學技術大學蘇州研究院