一種土壤共代謝作用的測定方法

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一種土壤共代謝作用的測定方法
【專利摘要】本發明涉及一種土壤共代謝作用的測定方法，其采用微量熱儀監測待測土壤不同時段的微量熱變化，通過監測到的微量熱曲線數據變化判定待測土壤中是否存在共代謝。本發明利用微量熱法從熱力學角度來研究土壤微生物的共代謝作用，為研究土壤微生物的共代謝作用提供了一種更為快捷的檢測方法，能避開繁瑣的試驗過程，快速的判斷出基質間的共代謝關系。微量熱方法研究共代謝還可擴展到其它碳源底物以及其它環境體系，如純培養體系，水體，廢棄物等，對于微生物代謝研究具有推廣價值，具有較佳的社會經濟價值。
【專利說明】
一種土壤共代謝作用的測定方法
技術領域
[0001] 本發明涉及一種土壤共代謝作用的測定方法，具體是涉及一種利用微量熱法測定土壤共代謝作用的方法。
【背景技術】
[0002] 微生物共代謝作用是微生物代謝過程中一種重要的生物過程，普遍存在于有機物的生物降解過程中。共代謝作用最早是由Leadbetter和Foster以共氧化（co-oxidation) 的概念提出，被描述成微生物氧化非生長基質而不利用氧化過程產生的能量的過程。經擴展后，共代謝作用被定義為微生物依賴可利用碳源和能源在正常生長過程中氧化非生長基質的過程；在這一過程中，微生物依賴初級基質的消耗而生長，同時產生降解非生長碳源和能源物質的能力。對于土壤環境而言，存在著易分解和相對難分解的有機物質，當易分解的物質添加到土壤中時，這些物質可以通過微生物的共代謝作用促進土壤中難分解物質的利用，從而促進土壤中有機物質的周轉。有研究表明當添加易降解的葡萄糖質量濃度達到 0.2g/L時，在振蕩培養72h后可以將丁基黃藥的降解率由43. 1 %提高到65. 2%。在草除靈廢水中加入葡萄糖后，可以明顯改善和提高廢水的生物可降解性。
[0003] 微生物共代謝的測定方法目前主要包括三種。第一，通過測定降解產物的累積量來判斷是否存在共代謝。Raymond等利用Nocardia里的3種菌的發酵過程來氧化對二甲苯，通過測定對二甲苯氧化產物的累積量，發現在培養基中加入陰離子交換樹脂后，對二甲苯的氧化產物累積量有顯著的增加，以此得到陰離子交換樹脂和碳水化合物之間存在的共氧化作用。第二，通過檢測底物的消耗或殘留量來驗證共代謝。鞏宗強等通過高效液相色譜技術監測芘含量，用于研究芘單獨添加及額外添加水楊酸、鄰苯二甲酸、琥珀酸鈉作為共代謝底物的情況下芘的降解率的變化。第三，根據酶學機制，通過測定關鍵酶活性的有無或高低驗證共代謝作用。曹曉星通過測定鄰苯二酚2,3_雙加氧酶的活性探討了在共代謝基質混合糊精（MCD)添加后，菌株US6-1對多環芳烴（PAHs)的降解能力的變化。李詠梅等通過測定硝酸還原酶活性來研究在缺氧的條件下，含氮雜環化合物吲哚和吡啶的共代謝作用，得到在適宜條件下，吡啶濃度的提高有利于硝酸還原酶活性的增大。
[0004] 上述三種方法的一個共同點是從物質代謝角度表征微生物的代謝，都避免不了繁瑣的樣品準備或測定程序，其中產物生成和底物消耗的測定往往受限于混合體系中目標物質的分離和純化；酶的測定通常需要培養，過程更加繁復，影響因素眾多。因此，探索一種更加快速、方便的微生物共代謝測定方法是很有必要的。

【發明內容】

[0005] 針對現有技術的缺陷，本發明的目的是提供一種程序簡單，可快速測定土壤共代謝作用的測定方法。
[0006] 為達上述目的，本發明采用了以下技術方案：
[0007] -種土壤共代謝作用的測定方法，采用微量熱儀監測待測土壤的微量熱變化，通過監測到的微量熱曲線數據變化來判定待測土壤中是否存在共代謝。
[0008] 本發明還可采用以下技術方案進一步實現：
[0009] 所述的土壤共代謝作用的測定方法，其中，向待測土壤中分別添加單一葡萄糖、單一 CMC以及同時添加葡萄糖和CMC作為碳源，添加量為每克鮮土添加葡萄糖2mg，添加 CMC 20mg，加鹽溶液并補水至相同土壤含水量，然后分別用微量熱儀監測添加不同碳源后待測土壤的微量熱變化曲線，若同一時間段同時添加葡萄糖與CMC碳源在培養過程中的熱量大于單一添加葡萄糖碳源和單一添加 CMC碳源在培養過程中產生的熱量之和，則說明待測土壤中存在共代謝作用。
[0010] 所述的土壤共代謝作用的測定方法，其中，向待測土壤中添加水補至相同土壤含水量后用微量熱儀測定待測土壤的微量熱變化作為對照組，將待測土壤添加不同碳源培養過程中的熱量減去對照組測得的熱量后獲得待測土壤在不同碳源條件下的凈熱量，若同一時間段同時添加葡萄糖與CMC碳源在培養過程中的凈熱量大于單一添加葡萄糖碳源和單一添加 CMC碳源在培養過程中產生的凈熱量之和，則說明待測土壤中存在共代謝作用。 [0011] 所述的所述的土壤共代謝作用的測定方法，其中，將所述微量熱儀監測出的對照組及不同碳源培養后的微量熱曲線所得數據全部導出，通過下列公式1和公式2進行數據處理：
[0012] Qsubstrate= Q t(GC、G 或 C)-Qt(H20) (1);
[0013] Qco= Q substrate (GC)-Qsubstrate(G)-Q substrate (C) (2);
[0014] 其中Qt(GC)為同時添加葡萄糖和CMC兩種碳源處理培養過程中的熱量、Q t(G)為單獨添加葡萄糖碳源處理培養過程中的熱量，Qt(C)為單獨添加 CMC碳源處理培養過程中的熱量，Qt(H20)為加水對照處理組的熱量；Q substMta(GC)表示同時添加葡萄糖和CMC兩種碳源處理產生的凈熱量，Qsubstrate(G)表示添加葡萄糖處理產生的凈熱量，Q subs&ate(C)表示添加 CMC處理產生的凈熱量；QCc]表示土壤共代謝產生的熱量；當QCc]大于零時即說明土壤中存在共代謝作用。
[0015] 所述的壤共代謝作用的測定方法，其中，所述數據處理還包括通過SPSS16. 0分析軟件對數據進行方差分析和誤差分析。
[0016] 所述的土壤共代謝作用的測定方法，其中，采用微量熱儀測定待測土壤的微量熱變化曲線具體包括如下步驟：
[0017] (1)供試土壤的處理：供試土壤中加入碳源和鹽溶液，補水至田間最大持水量的 60% ；
[0018] (2)供試土壤的培養：將處理后的供試土壤密封放置于微量熱儀內置量熱室內進行培養，培養條件為恒溫27°C，培養時間為16-72小時；
[0019] (3)測定供試土壤微量熱變化：將培養后的供試土壤放入微量熱儀的測量通道內進行熱量監測，獲取供試土壤的微量熱變化曲線。
[0020] 所述的土壤共代謝作用的測定方法，其中，所述供試土壤中加入的鹽溶液包括 0· 072mol/L(NH4)2S04、0. 0643mol/L 1(2冊04和 0· 077mol/L MgSO 4 · 7H20,添加量均為 40uL/ 克鮮土。
[0021] 所述的土壤共代謝作用的測定方法，其中，所述供試土壤的處理前還包括供試土壤前處理步驟：在田間米樣多點混合米樣法，米樣深度〇 _15cm，均勾混合后去除土壤中的根、小石塊等雜質，過2mm篩后即得供試土壤。
[0022] 所述的土壤共代謝作用的測定方法，其中，所述微量熱儀采用美國TA公司生產的 ΤΑΜ III 3101-2型微量熱儀。
[0023] 本發明通過采用微量熱儀監測的土壤微量熱曲線及相關的參數證實了 CMC與葡萄糖之間存在共代謝關系。這一共代謝關系存在的機制在于添加葡萄糖之后，土壤微生物在利用葡萄糖的同時，產生某些可以直接利用CMC的酶，或者促進原有CMC分解酶的活性增加，從而加速了 CMC的代謝。對共代謝作用機制的這一推斷在目前很多研究中都有所體現。鄢恒珍等利用這一理論推斷出，葡萄糖作為丁基黃藥的共代謝基質效果之所以最好，是因為單糖的結構極易被微生物氧化分解，同時為微生物的生長提供碳源和能源，從而誘導出更多的能夠分解丁基黃藥的關鍵酶，而多糖和雙糖結構相對復雜，則需要更多酶的參與才能被徹底分解和被微生物利用。Ruirui Chen等在研究土壤碳氮互作對土壤有機質礦化的效應時發現，添加葡萄糖后的處理比沒有添加葡萄糖的處理，纖維素酶的活性顯著增加。而纖維素酶活性的增加直接使降解纖維素的能力得到增加，從酶活性的角度證實土壤中葡萄糖和CMC存在共代謝關系。
[0024] 鑒于以上分析所得到的葡萄糖和CMC之間存在共代謝關系，表明利用微量熱法從熱力學角度來研究土壤微生物的共代謝作用是可行的。微量熱法本身就是一種原位、實時、無破壞地研究生物/環境樣品熱力學與動力學的重要方法。同時，也有研究表明微量熱法和土壤呼吸強度、土壤微生物生物量、微生物數量以及土壤酶活性有很高的相關性，即微量熱法可準確地表征土壤微生物的生物學特性。微量熱儀監測出的微量熱曲線產生了一系列的熱力學參數，利用這些熱力學參數來研究土壤微生物的共代謝作用具有一些明顯的特點，如微量熱儀對熱能的監測具有極高的靈敏性，內部溫度誤差控制在〇. ooorc以內；對數據點采集的全自動性和高密集性，每10秒即可采集一個數據；試驗操作及樣品準備的過程簡單易行，整個測定過程僅2~3天就可完成。鑒于這些特點得到，利用微量熱法來研究土壤微生物的共代謝作用，相較于現有的方法具有顯著的優勢。
[0025] 本發明為研究土壤微生物的共代謝作用提供了一種更為快捷的檢測方法，能避開繁瑣的試驗過程，快速的判斷出基質間的共代謝關系。微量熱方法研究共代謝還可擴展到其它碳源底物以及其它環境體系，如純培養體系，水體，廢棄物等，對于微生物代謝研究具有推廣價值。
【附圖說明】
[0026] 圖1是0M 土壤中的微量熱變化曲線圖。
[0027] 圖2為CK 土壤中的微量熱變化曲線圖。
[0028] 其中，1為單獨添加水進行處理的土壤微量熱變化曲線，2為單獨添加 CMC進行處理的土壤微量熱變化曲線，3為單獨添加葡萄糖進行處理的土壤微量熱變化曲線，4為同時添加葡萄糖和CMC進行處理的土壤微量熱變化曲線。
【具體實施方式】
[0029] 本發明所用土壤采集自封丘潮土養分平衡長期施肥試驗田，該試驗田設有不施肥對照（CK)、施用有機肥（0M)、有機無機肥配施（1/20MN)、施用化肥（NPK)、施用化肥（NP)、施用化肥（NK)和施用化肥（PK)共7個肥料處理田。本試驗選用其中不施肥對照（CK)組和施用有機肥（0M)組兩組土壤對照處理。
[0030] -、采用微量熱方法測定土壤中的共代謝作用
[0031] (一）土壤處理
[0032] 將選用不施肥對照（CK)組和施用有機肥（0M)組兩組土壤進行測定，每組土壤每一處理四次重復，采樣時，在各小區內采用多點混合采樣法，采樣深度為〇-15cm，均勻混合后去除土壤中的根、小石塊等雜質，過2mm篩后置于4°C冰箱保存備用。所選土壤的基本理化性質見下表1。
[0033] 表1供試土壤基本理化性質
[0034]
[0035] (二）測定方法
[0036] 實施例1 :
[0037] 本實驗采用的儀器為ΤΑΜ III 3101-2型微量熱儀，美國TA公司（原瑞典 Thermometrio ΑΒ 公司）生產。
[0038] 測定時，稱取供試土壤lg，裝入4mL安瓿瓶內，加入葡萄糖作為碳源并加入一定濃度的鹽溶液，共同構成培養體系。具體葡萄糖的添加量為2mg ;添加的鹽溶液包括 0· 072mol/L(NH4)2S04、0. 0643mol/L 1(2冊04和 0· 077mol/L MgSO 4 · 7H20,添加量均為 40uL。然后處理補水至相同土壤含水量，達到田間最大持水量的60 %。再用橡膠塞封住瓶口，放置于微量熱儀內置的量熱室內進行培養，保持恒溫27°C，培養48小時。
[0039] 待儀器完成前基線后，將裝有樣品的安瓿瓶放入測量通道內，保持在平衡位置15 分鐘后，將其放入到測量位置進行測定，測定出安瓿瓶內待測土壤48小時的整體熱量變化。待樣品反應結束后，取出安瓿瓶，還可以設置30分鐘的后基線時間以保護機器使用安全。
[0040] 0M和CK 土壤均采用同樣的方法處理并測量，每組土壤至少做3組平行試驗。
[0041] 實施例2
[0042] 測定方法與實施例1相同，不同之處在于碳源選擇添加羧甲基維生素鈉（CMC)作為單一碳源，添加量為每克鮮土添加20mg CMC。
[0043] 實施例3
[0044] 測定方法與實施例1相同，不同之處在于碳源選擇同時向土壤中添加葡萄糖 (Glucose)和羧甲基維生素鈉（CMC)兩種碳源，添加量為每克鮮土添加2mg葡萄糖和20mg CMC〇
[0045] 實施例4
[0046] 測定方法與實施例1相同，不同之處在于不加入碳源和鹽溶液，直接向土壤中加入水作為對照組。
[0047] (三）數據處理及統計分析
[0048] 1、數據處理方法
[0049] 利用微量熱儀ΤΑΜΠΙ3101-2監測出的樣品微量熱變化曲線，在ΤΑΜ輔助軟件（ΤΑΜ Assistant software)中是一條以絕對時間（Absolute time)(時間單位可調）為橫軸、以熱流（Heat Flow) (μ W)為縱軸的曲線。將實施例1-4中各自所得數據從TAM Assistant software導出到Excel表格中，從輸出的數據中提取出以下熱動力學參數，并進行單位的轉換，其中：
[0050] P。--初始熱功率，即t。時的熱功率，單位μ W ;
[0051 ] Ρ_--培養過程中的最大熱功率，單位μ W ;
[0052] tmax--培養過程中最大熱功率出現的相對時間，單位h ;
[0053] Qt--培養過程中產生的熱量，單位J。
[0054] 上述數據均直接從ΤΑΜ輔助軟件中導出。將導出數據以下列公式進行數據處理：
[0055] Qsubstrate= Q t (GC、G 或 C) _Qt (H20) (1)
[0056] Qsubstrate表不添加碳源后產生的凈熱量，Q t(GC)表不實施例3同時添加葡萄糖和 CMC兩種碳源處理培養過程中的熱量、Qt(G)表示實施例1添加葡萄糖碳源處理培養過程中的熱量，Q t (C)表示實施例2添加 CMC碳源處理培養過程中的熱量，Qt (H20)表示實施例4加水對照處理組的熱量。
[0057] Qco= Q substrate (GC)-Qsubstrate(G)-Q substrate (C) (2)
[0058] Qe。表示共代謝產生的熱量，Q substMte(GC)表示同時添加葡萄糖和CMC兩種碳源處理產生的凈熱量，Qsubstrate(G)表示添加葡萄糖處理產生的凈熱量，Q substMte(C)表示添加 CMC 處理產生的凈熱量。
[0059] 對所得的試驗數據進行方差分析和誤差估計等統計分析，均由SPSS16. 0完成。
[0060] 2數據處理結果
[0061] 2. 1葡萄糖和羧甲基纖維素鈉的共代謝關系
[0062] 供試土壤在添加碳源后的代謝過程，經ΤΑΜ微量熱儀監測熱量變化，形成的微量熱曲線如圖1-2所示，相關參數經數據處理計算后匯總列于下表2。
[0063] 表2利用微量熱曲線參數來測定共代謝
[0064]
[0065] 從表2及圖1-2可以看到0M和CK 土壤在添加水的處理中，微量熱曲線1均基本是一條直線，熱功率分別保持在4. 5 μ W和0. 36 μ W左右，說明在不添加碳源的情況下兩種土壤的本底微生物代謝活性很低，產生的代謝熱很小，接近于0。在單獨添加葡萄糖的處理中，兩種土壤的微量熱曲線3都存在明顯的熱排放峰，Ρ_分別為557. 39±3. 06和 523·01±2· 13yW，分別為 10·42±(λ 12 和 12·25±0· 12h，Qt分別為 14·54±0· 13 和 14. 42±0. 53J，說明微生物能夠迅速利用添加的葡萄糖，同時放熱。與此相反，在添加 CMC 的處理中，0M和CK 土壤的微量熱曲線2近乎直線，沒有明顯的熱量變化，表明兩種土壤中的微生物均無法直接利用CMC，因此無法形成放熱峰。雖然添加 H20和CMC處理的土壤微量熱都呈直線，但添加 CMC后的熱功率值始終高于添加 H20的處理，這一熱量不是源自土壤微生物的活動，而是由于CMC添加到土壤后的物理化學變化引起的，干燥的CMC吸著水分會產生熱量，此熱量稱為吸著熱或潤濕熱。
[0066] 從表2及圖1-2中還可以看出，CMC額外添加葡萄糖后，在兩種土壤（0M和CK)中的微量熱曲線4不再是直線，而都形成了明顯的熱排放峰，相應的P_分別為351. 33±3. 95 和 396.13±5.81以14_分別為15.00±0.17和14.67±0.1511，01分別為17.61±0.85和 15. 67± 1. 26J。將兩種土壤在同時添加兩種碳源后產生的熱排放曲線，與單獨添加葡萄糖所產生的熱排放曲線相比，曲線發生了明顯的變化，包括峰高（P_)變低，峰型（t_)延后，熱量的排放（Q t)變大；表明土壤中微生物對兩種碳源的利用不同于葡萄糖作為單一碳源的利用。將兩種土壤單獨添加葡萄糖和CMC所產生的熱量、以及土壤本底的熱量剔除后，得到表1中列出的Q c。，分別為1. 49和0. 43J。這部分熱量來源于在葡萄糖作為生長基質存在的條件下，土壤微生物進一步利用或分解非生長基質CMC產生的熱量，即說明CMC和葡萄糖之間存在共代謝作用。因此，通過土壤微量熱曲線及相關的參數（P_、t_、Q t、QJ可以證實 CMC與葡萄糖之間存在共代謝關系。
[0067] 這一共代謝關系存在的機制在于添加葡萄糖之后，土壤微生物在利用葡萄糖的同時，產生某些可以直接利用CMC的酶，或者促進原有CMC分解酶的活性增加，從而加速了 CMC 的代謝。鑒于以上分析所得到的葡萄糖和CMC之間存在共代謝關系，表明利用微量熱法從熱力學角度來研究土壤微生物的共代謝作用是可行的。通過微量熱法可準確地表征土壤微生物的生物學特性。
[0068] 此外，根據本研究所獲得的試驗數據不難看出，微量熱儀監測出的微量熱曲線產生了一系列的熱力學參數，微量熱儀對熱能的監測具有極高的靈敏性，內部溫度誤差控制在o.ooorc以內；對數據點采集也是全自動和高密集的，每10s即可采集一個數據；試驗操作及樣品準備的過程也比較簡單，整個測定過程僅2~3天就可完成。
[0069] 2. 2不同處理土壤的碳利用效率及共代謝作用的差異
[0070] 從表2中可以看出單獨添加葡萄糖的0M和CK 土，雖然每克土壤添加的葡萄糖量一致，但微量熱結果顯示放熱過程中所產生的能量卻不同，即Qsubstrato分別為13. 87±0. 13J 和14. 36±0. 53J，表明兩種土壤在添加葡萄糖后，利用底物轉化成熱量的效率存在差異。從熱力學角度分析，在生物體內lmol的葡萄糖徹底氧化分解以后，共釋放出2870kJ的能量，其中有1161kJ左右的能量儲存在ATP中，剩余1709kJ的能量都以熱能的形式散失。 Battley將底物氧化產生C02過程中釋放的熱量定義為' Barros等在此理論基礎上進一步提出，將底物氧化后留在土壤中的底物熱量定義為nsclll。根據上面的理論計算，得到本研究中0M和CK 土壤在添加葡萄糖后，分別為73. 77%和76. 40%，n sclll分別為 26. 22%和23. 59%。0M 土壤中葡萄糖中碳的礦化效率與CK 土壤相比具有減小的趨勢，但未達到顯著（P = 0. 09)，說明留在0M 土壤中的碳多于CK 土壤，即0M 土壤的碳利用效率大于CK 土壤。Jim A. Harris等的研究發現施用有機肥處理的τι ^^直顯著高于單獨施用無機肥的處理，即施用有機肥后土壤對碳的利用效率顯著大于施用無機肥的土壤這與本研究所得到的結果是一致的。
[0071] 另外，表2中列出的0M 土壤的Qc。值（1. 49J)，大于CK 土壤的Q JI (0. 43J);表明在共代謝作用下0M 土壤釋放的熱量大于CK 土壤，從上面的分析得到本研究土壤中釋放的熱量來源于碳源的分解，而葡萄糖在0M土壤中的分解率小于CK 土壤，由此可以推斷出在共代謝作用下，0M 土壤中CMC的分解率大于CK 土壤，也就是說兩種碳源在0M 土壤中的共代謝作用大于CK 土壤。目前國內外研究結果中影響共代謝作用的因素主要包括：1)微生物的選擇和馴化，2)生長基質的選擇，3)生長基質和非生長基質的投加比，4)額外物質的添加及反應條件的控制。在此研究的基礎上，分析得到本發明中兩種土壤共代謝作用的差異主要是和微生物的選擇和馴化相關。本實驗中葡萄糖和CMC的共代謝作用之所以表現出 0M 土壤大于CK 土壤，主要是由于土壤在長期不同施肥處理后微生物的群落結構和活性發生了變化。正是由于這些分異，導致在添加葡萄糖后，0M 土壤中微生物利用葡萄糖進行繁殖以及降解CMC的能力都強于CK 土壤，從而提高了對CMC的利用率。在常規環境條件下，能通過共代謝作用降解難降解物質的微生物存在的數量少且活性低。所以說CK 土壤中即使存在這些降解性能的微生物，它們的數量及活性也比0M 土壤中的這些降解性能的微生物要低。添加有機氮源對分解效果的影響明顯優于單純的無機氮源，表明有機氮源更利于復合微生物菌系發揮降解能力。
[0072] 綜上，利用微量熱方法可以測定出土壤中葡萄糖和CMC之間存在共代謝關系。并且長期施用有機肥料的土壤中微生物的共代謝作用高于不施肥的土壤，本發明的土壤共代謝作用的測定方法是可行的。本發明為研究土壤微生物的共代謝作用提供了一種更為快捷的檢測方法，能避開繁瑣的試驗過程，快速的判斷出基質間的共代謝關系。微量熱方法研究共代謝還可擴展到其它碳源底物以及其它環境體系，如純培養體系，水體，廢棄物等，對于微生物代謝研究具有推廣價值。
[0073] 二、對比試驗
[0074] 使用與上述一中采用微量熱方法測定土壤中的共代謝作用中同批次采集的0M和 CK 土壤，對0M和CK 土壤的試驗處理方式同微量熱處理一致，每個處理設3個平行。每個平行稱取供試土壤5g，裝入20mL玻璃密封瓶內，加入相應量的碳源和鹽溶液，碳源的添加量為 l〇mg 的葡萄糖，鹽溶液包括 0· 072mol/L(NH4)2S04、0. 0643mol/L 1(2冊04和 0· 077mol/L MgS04 · 7H20,添加量均為200uL，后，各處理補水至相同土壤含水量，達到田間最大持水量的 60%，蓋上瓶塞，用針管抽取8mL氣體，作為測定的0點值，用氣相色譜檢測出其中C0 2的濃度。然后打開瓶塞讓氣體同外界空氣充分接觸后再蓋上瓶塞，將其放入27°C培養箱內培養， 48h后取出氣瓶，抽取8mL氣體進行C0 2的濃度測定。
[0075] 供試土壤在添加碳源后的代謝過程中所排放的氣體，經氣相色譜測定出C02的濃度，折算出48h的排放量列于表3。其中：
[0076] Et--C02的排放量，單位 ug/g 土；
[0077] Esubstrate= E t(葡萄糖、CMC、葡萄糖 +CMC)_Et( 7義）（3)
[0078] 其中，Esubstrat，示添加碳源后C0 2的凈排放量，E t(葡萄糖、CMC、葡萄糖+CMC)是指添加碳源后C02的排放量，E t (水）是指對照的0)2排放量。
[0079] Ec〇= E substrate (葡萄糖 +CMC) _Esubstrate (葡萄糖）_Esubstrate (CMC) (4)
[0080] 其中，Ec。表示共代謝作用產生的CO 2排放量，E substrate(葡萄糖+CMC)表示同時添加葡萄糖和CMC處理的C02凈排放量，E substMte (葡萄糖）表示添加葡萄糖處理的C02凈排放量，Esubstrate(CMC)表示添加 CMC處理的C02凈排放量。
[0081] 表3二氧化碳排放量
[0082]
[0083] 從表3中可以看出0M和CK 土壤在添加水的處理中，每克鮮土 (：02的排放量很低；在添加 CMC的處理中，0M和CK 土壤的0)2排放量有所增加，但是增加的幅度比較小。而添加葡萄糖的處理，0M和CK 土壤的C02排放量E t分別增加了 23和43倍；添加葡萄糖和CMC 的處理，兩種土壤的C02排放量E t分別增加了 27和41倍。
[0084] 以測定0)2濃度的方法作為參照，利用表3中的C02排放量E t與表2中Q雇做相關分析得到，兩者的相關系數〇. 997,表現為極顯著相關，表明用微量熱的方法來研究共代謝是可行的。比較表2和表3中的共代謝數值，可以發現表2中0M處理的Q c。為1. 49J/g 土， Q-Strate-CMC 為 1. 58J/g 土，前者是后者的 94. 3% ;表 3 中 Ec。為 100. %ug/g 土，E substrate為 488. 61ug/g，前者為后者的20. 66%，這表明利用微量熱方法來研究共代謝比用氣體排放的方法更加靈敏。
[0085] 以上所述，僅為本發明的較佳實施例而已，并非對本發明做任何形式上的限定。凡本領域的技術人員利用本發明的技術方案對上述實施例做出的任何等同的變動、修飾或演變等，均仍屬于本發明技術方案的范圍內。
【主權項】
1. 一種土壤共代謝作用的測定方法，其特征在于：采用微量熱儀監測待測土壤的微量熱變化，通過監測到的微量熱曲線數據變化來判定待測土壤中是否存在共代謝。2. 根據權利要求1所述的土壤共代謝作用的測定方法，其特征在于：向待測土壤中分別添加單一葡萄糖、單一 CMC以及同時添加葡萄糖和CMC作為碳源，添加量為每克鮮土添加葡萄糖2mg，添加 CMC 20mg，加鹽溶液并補水至相同土壤含水量，然后分別用微量熱儀監測添加不同碳源后待測土壤的微量熱變化曲線，若同一時間段同時添加葡萄糖與CMC碳源在培養過程中的熱量大于單一添加葡萄糖碳源和單一添加 CMC碳源在培養過程中產生的熱量之和，則說明待測土壤中存在共代謝作用。3. 根據權利要求2中所述的土壤共代謝作用的測定方法，其特征在于：向待測土壤中添加水補至相同土壤含水量后用微量熱儀測定待測土壤的微量熱變化作為對照組，將待測土壤添加不同碳源培養過程中的熱量減去對照組測得的熱量后獲得待測土壤在不同碳源條件下的凈熱量，若同一時間段同時添加葡萄糖與CMC碳源在培養過程中的凈熱量大于單一添加葡萄糖碳源和單一添加 CMC碳源在培養過程中產生的凈熱量之和，則說明待測土壤中存在共代謝作用。4. 根據權利要求3所述的所述的土壤共代謝作用的測定方法，其特征在于：將所述微量熱儀監測出的對照組及不同碳源培養后的微量熱曲線所得數據全部導出，通過下列公式1和公式2進行數據處理： ^substrate Qt(GC,Gi^C) -Qt (H20) (1)； Qc〇= Q substrate (GC)-Qsubstrate(G)-Q substrate (C) (2); 其中Qt(GC)為同時添加葡萄糖和CMC兩種碳源處理培養過程中的熱量、Qt(G)為單獨添加葡萄糖碳源處理培養過程中的熱量，Qt(C)為單獨添加 CMC碳源處理培養過程中的熱量， Qt(H20)為加水對照處理組的熱量； QSUbstrato(GC)表示同時添加葡萄糖和CMC兩種碳源處理產生的凈熱量，Q subst*(G)表示添加葡萄糖處理產生的凈熱量，Qsubstrate(C)表示添加 CMC處理產生的凈熱量； Qc。表示土壤共代謝產生的熱量；當Qc。大于零時即說明土壤中存在共代謝作用。5. 根據權利要求4所述的壤共代謝作用的測定方法，其特征在于：所述數據處理還包括通過SPSS16. 0分析軟件對數據進行方差分析和誤差分析。6. 根據權利要求2-5中任一所述的土壤共代謝作用的測定方法，其特征在于：采用微量熱儀測定待測土壤的微量熱變化曲線具體包括如下步驟： (1) 供試土壤的處理：供試土壤中加入碳源和鹽溶液，補水至田間最大持水量的60% ; (2) 供試土壤的培養：將處理后的供試土壤密封放置于微量熱儀內置量熱室內進行培養，培養條件為恒溫27°C，培養時間為16-72小時； (3) 測定供試土壤微量熱變化：將培養后的供試土壤放入微量熱儀的測量通道內進行熱量監測，獲取供試土壤的微量熱變化曲線。7. 根據權利要求5所述的土壤共代謝作用的測定方法，其特征在于：所述供試土壤中加入的鹽溶液包括〇· 〇72mol/L (NH4) 2S04、0· 0643mol/L 1(2即04和 0· 077mol/L MgS04 · 7H20,添加量均為 40uL/ 克鮮土。8. 根據權利要求5所述的土壤共代謝作用的測定方法，其特征在于：所述供試土壤的處理前還包括供試土壤前處理步驟：在田間采樣多點混合采樣法，采樣深度0-15cm，均勻混合后去除土壤中的根、小石塊等雜質，過2mm篩后即得供試土壤。9. 根據權利要求2所述的土壤共代謝作用的測定方法，其特征在于：所述微量熱儀采用美國TA公司生產的ΤΑΜ III 3101-2型微量熱儀。
【文檔編號】G01N25/20GK106033067SQ201510102537
【公開日】2016年10月19日
【申請日】2015年3月9日
【發明人】陳瑞蕊, 林先貴, 魏世平, 井忠旺
【申請人】中國科學院南京土壤研究所

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