一種通過選擇發育潛能良好的胚胎來改善試管嬰兒臨床結局的方法
【專利摘要】本發明公開了一種通過選擇發育潛能良好的胚胎來改善試管嬰兒臨床結局的方法，包括五個步驟：主要根據移植前胚胎培養液中的IL?8來選擇發育潛能良好的移植胚胎，具體用液相芯片高通量的蛋白質分析技術來檢測標本中IL?8的含量，選擇其培養液中IL?8陽性的胚胎結合形態學評估法來進行移植；用移植前人胚胎培養液中IL?8陽性的結合形態學上優質胚胎移植，妊娠率可提高8％以上，達60.76％；較現有的單用形態學方法選擇胚胎來進行移植，妊娠率可提高8?12％以上，用本方法結合現有的形態學方法選擇優質胚胎，或優質胚胎和普通胚胎移植給體外受精者，還可以提高胚胎種植率，增加嬰兒活產數，提高患者臨床妊娠率及降低流產率。
【專利說明】
一種通過選擇發育潛能良好的胚胎來改善試管嬰兒臨床結局 的方法
技術領域
[0001] 本發明是屬于生殖醫學科學，試管嬰兒移植領域，具體涉及在進行試管嬰兒移植 前，通過測定人胚胎移植前培養待移植胚胎的培養液中白細胞介素-8(IL-8)的含量來選擇 發育潛能良好的移植胚胎，以改善妊娠結局。
【背景技術】
[0002] 隨著輔助生殖技術，或者是說試管嬰兒技術在全世界范圍應用增加，既快又非創 傷性地選擇最好的移植胚胎仍然是生殖醫學面臨的一個重要問題。對大多數進行試管嬰兒 的病人而言，為獲得較高的胚胎種植率（IRs)和妊娠率，每次移植需移植多個胚胎，而移植 多個胚胎會導致多胎妊娠。體外受精（IVF/IVSI)所致的多胎妊娠的增加，使社會面臨一系 列重大的健康問題，并加重了衛生部門的負擔。隨著人們對多胎妊娠所帶來的醫學和社會 經濟問題的認識增加，預防多胎妊娠已成為輔助生殖技術的一個中心任務。選擇性單胚胎 移植被認為是防止體外受精周期中多胎妊娠的唯一選擇。既要選擇單胎移植的又不降低妊 娠率，就必須提高胚胎IRs及尋找一種識別移植前最高種植潛能的胚胎的方法。目前，形態 學評估法仍然是評價胚胎質量的主要方法。形態學評估法主要是根據胚胎的細胞數及其形 態學外觀來選擇移植胚胎，這種方法不能夠很好地預測胚胎的種植潛能。由于用形態學評 估法評價評價胚胎質量有一定的局限性，許多研究者一直在尋求評價胚胎生殖潛能的其它 方法。目前正在研究的評價胚胎的方法(胚胎移植)包括測定胚胎培養液中的葡萄糖、乳酸、 丙酮酸或氨基酸的含量;測定胚胎的耗氧量；以及基因組學和蛋白組學等方法。近年來，非 創傷性方法被認為是預測輔助生殖技術后臨床結局最為有希望的方法。已有研究者用非創 傷性方法檢測發育胚胎的數項代謝學指標，而檢測結果表明，胚胎培養液中代謝物與患者 的臨床妊娠結局相關。通過時差顯微鏡(time-lapse device)攝像，非創傷性地觀察胚胎的 發育，是一種評價胚胎質量的較好方法;現有的研究表明，用這種方法選擇胚胎來進行移 植，能夠獲得良好的臨床結局。然而，由于缺乏大樣本及隨機的臨床研究，研究者很難判斷 用動力學參數選擇胚胎法能改善臨床結局，以及很難判斷哪一種動力學參數在評價胚胎質 量上更有價值。
[0003] 細胞因子是細胞分泌的一類蛋白。在生理或病理狀況下，該蛋白作為激素調控器， 在納摩爾至皮摩爾(nano to picomolar)濃度下即可調控細胞和組織的功能。細胞因子的 基本功能是改變大量細胞和組織的性能。細胞因子可以通過自分泌、旁分泌或遠距離分泌 (特定情況下)起作用。細胞因子和細胞膜上特定的受體結合，誘導信號通路的級聯反應，結 果致細胞和組織發生效應。在生殖免疫學，細胞因子不僅參與月經、排卵、分娩和胚胎種植 等生理過程，還參與早產和子宮內膜異位癥等病理過程。
[0004] 多年來，研究者一直企圖用移植前胚胎培養液中的細胞因子來預測胚胎的質量和 妊娠結局。20世紀90年代，學者檢測人胚胎培養液中白細胞介素-1 (I L-1 )、白細胞介素-6 (IL-6)、集落刺激因子-l(CSF-l)、腫瘤壞死因子a(TNF-a)和轉化生長因子0(TGF_i3)的含 量，并提出用胚胎培養液中的這些細胞因子來預測IVF/IVSI病人妊娠結局的可能性。在 2012年，一篇文獻表明，妊娠婦女組與非妊娠婦女比較，人類移植前胚胎培養液中腫瘤壞死 因子a(TNF-a)的濃度在妊娠婦女組較低，而人類移植前胚胎培養液中白血病抑制因子 (LIF)在妊娠婦女組則較高，揭示LIF可能是胚胎種植所需要的因子，而TNF-α可作為預測胚 胎種植失敗的一個指標。而我們用液相芯片高通量的蛋白質分析技術(LHTPA)來檢測人類 移植前胚胎培養液中TNF-a、IL-6、IL-li3及GM-CSF的含量，結果并沒有發現這幾種細胞因子 可以預測胚胎的發育潛能及臨床結局，因此這個資料未發表。本研究者繼續研究測定人胚 胎移植前培養待移植胚胎的培養液中白細胞介素-8 (IL-8)的含量，并分析和研究IL-8的濃 度與胚胎質量和妊娠結局的關系，得到了令人鼓舞成果。
【發明內容】
[0005] 本發明目的是提供了一種評價體外受精受者的移植胚胎質量的新方法。本發明通 過研究得出，測定人胚胎移植前培養待移植胚胎的培養液中IL-8的含量來選擇發育潛能良 好的胚胎的方法，以改善體外受精受者的臨床結局。
[0006] 本方法包括以下步驟：
[0007] (1)在移植的當天，收集每個體外受精受者的每次胚胎移植前的培養待移植胚胎 的培養液。在體外受精后的第一天，在確認受精后，將每個體外受精受者的每個受精卵分別 放置在30-50yL 10 %人血清白蛋白的卵裂液液滴中，置37 °C、5 % C02的培養箱中繼續培養2 天，至胚胎移植前;現在，胚胎在體外已培養至第3天，在進行胚胎移植前的4h-6h，根據以卵 裂率和形態學為基礎的形態學評估法評價每個體外受精受者待移植胚胎的質量，每個體外 受精受者每次移植2-3個胚胎;每個體外受精受者的待移植的胚胎選定后，將待移植的胚胎 移走，即收集已培養待移植胚胎2日的含10%人血清白蛋白的卵裂液液滴，即培養待移植胚 胎的培養液;鑒于每個體外受精受者每次移植2-3個胚胎，每個胚胎在移植前均放置在一個 30-50yL含10 %人血清白蛋白的卵裂液液滴中培養2日，每個體外受精受者的每次胚胎移植 前的培養待移植胚胎的培養液為分別培養2-3個待移植胚胎2日的含10%人血清白蛋白的 卵裂液液滴，收集每個體外受精受者每次胚胎移植前培養待移植胚胎的這2-3個液滴，組成 一份標本，每一份標本含25yL-40yL培養液;收集在同樣條件下培養的沒有放置胚胎的培養 液作為陰性對照；
[0008] (2)用液相芯片高通量的蛋白質分析技術(LHTPA)來檢測每一份標本中白細胞介 素-8(IL_8)的含量；
[0009] (3)根據形態學評估法和標本中白細胞介素-8(IL-8)的含量來選擇移植胚胎，將 選擇的移植胚胎移植給體外受精受者;可用移植胚胎形態學上質量相同或相似，則選擇其 培養液中IL-8陽性，即培養液中IL-8濃度范圍在0.19pg/ml至10.32pg/ml之間的胚胎來進 行移植；
[0010] (4)如果可用移植胚胎與形態學上質量不相同或不相相似，則選擇其培養液中IL-8陽性，即培養液中IL-8濃度范圍在0.19pg/ml至10.32pg/ml之間的胚胎和/或選擇胎形態 學上質量較好的胚胎來進行移植。
[0011] (5)從收集標本到檢測出IL-8的時間為4h_6h，故在胚胎移植的當天即可用該方法 來篩選發育潛能較好的胚胎來進行移植。
[0012] 本發明的有益效果是，根據移植前胚胎培養液中的細胞因子來選擇發育潛能良好 的移植胚胎，以改善妊娠結局。妊娠婦女組與非妊娠婦女比較，人類移植前胚胎培養液中腫 瘤壞死因子a(TNF-a)的濃度在妊娠婦女組較低，而人類移植前胚胎培養液中白血病抑制因 子(LIF)在妊娠婦女組則較高，揭示LIF是胚胎種植所需要的因子，而腫瘤壞死因子a(TNF-α)可作為預測胚胎種植失敗的一個指標。用移植前人胚胎培養液中IL-8陽性的形態學上優 質胚胎移植給IVF/ICSI患者，妊娠率(pregnancy rate)可提高8%以上，達60.76%;用移植 前人胚胎培養液中IL-8陽性的優質胚胎和普通胚胎移植給IVF/ICSI患者，妊娠率可提高 12 %以上，達47.37 %。因而，用本方法結合現有的形態學方法選擇胚胎來進行移植，較現有 的單用形態學方法選擇胚胎來進行移植，妊娠率可提高8-12%以上。用本方法結合現有的 形態學方法選擇優質胚胎，或優質胚胎和普通胚胎移植給IVF/ICSI患者，還可以提高胚胎 種植率，增加患者的嬰兒活產數，提高患者臨床妊娠率及降低患者的流產率。
【附圖說明】
[0013] 圖1.用LHTPA法測定移植前胚胎的培養液中IL-8的濃度（IL-8C〇nCentrati 〇n)〇
[0014] *Ρ = 0·003,0·000和0·000,與陰性對照組（negative control group)、研究組 (study group)和LI-8陰性組（LI_8negative group)比較。★? = 0·000,與LI-8陰性組比較 (LI-8negative group)。根據樣本中檢測到的LI-8的值的高低將研究組分為LI-8陽性組 (LI-8positive group)和LI-8陰性組，在LI-8陽性組中，樣本中檢測到的LI-8的值的均高 于0.19pg/ml，而在LI-8陰性組中，樣本中檢測到的LI-8的值的均低于0.19pg/ml。每一份標 本由每一病人本次新鮮移植周期中所有移植胚胎的培養液組成;收集在同樣條件下培養的 沒有放置胚胎的培養液作為陰性對照。結果以均數±標準誤(mean±SEM)表示。n =總的被 檢測樣本數。
[0015] 圖2.用移植前人胚胎的培養液中的IL-8來預測體外受精受者的臨床結局
[0016] LI-8陽性組（LI_8positive group)和LI-8陰性組（IL_8negative group)間妊娠 率（pregnancy rate)、胚胎種植率（imp lan tation rate)、臨床妊娠率（clinical pregnancy rate)、流產率（abortion rate)、生化妊娠率（chemical pregnancy rate)、與 活產率（live-birth rate)比較。
[0017] ★? = 〇.〇22，*卩=0.020，與1^1-8陰性組比較。
【具體實施方式】
[0018] 實施方法，本方法包括以下步驟：
[0019] (1)在移植的當天，收集每個體外受精受者的每次胚胎移植前的培養待移植胚胎 的培養液。在體外受精后的第一天，在確認受精后，將每個體外受精受者的每個受精卵分別 放置在30 -50yL 10%人血清白蛋白（SAGE In-Vitro Fertilization，Inc.;Trumbull，CT， USA)的卵裂液（ART-1026,SAGE In-Vitro Fertilization，Inc. ;Trumbull，CT,USA)液滴 中，置37 °C、5 % C02的培養箱中繼續培養2天，至胚胎移植前;現在，胚胎在體外已培養至第3 天，在進行胚胎移植前的4h-6h，根據以卵裂率和形態學為基礎的形態學評估法評價每個體 外受精受者待移植胚胎的質量，每個體外受精受者每次移植2-3個胚胎;每個體外受精受者 的待移植的胚胎選定后，將待移植的胚胎移走，即收集已培養待移植胚胎2日的含10%人血 清白蛋白（SAGE In-Vitro Fertilization，Inc ·;Trumbull，CT，USA)的卵裂液（ART-1026， SAGE In-Vitro Fertilization，Inc. ;Trumbull，CT,USA)的液滴(培養待移植胚胎的培養 液）。鑒于每個體外受精受者每次移植2-3個胚胎，每個胚胎在移植前均放置在一個30-50yL 含 10%人血清白蛋白（SAGE In-Vitro Fertilization，Inc ·;Trumbull，CT，USA)的卵裂液 (ART-1026，SAGE In-Vitro Fertilization,Inc. ;Trumbull，CT,USA)液滴中培養2日，每個 體外受精受者的每次胚胎移植前的培養待移植胚胎的培養液為分別培養2-3個待移植胚胎 2 日的含 10%人血清白蛋白（SAGE In-Vitro Fertilization，Inc ·; Trumbull，CT，USA)的卵 裂液(ART-1026，SAGE In-Vitro Fertilization，Inc ·;Trumbull，CT，USA)液滴，收集每個 體外受精受者每次胚胎移植前培養待移植胚胎的這2-3個液滴，組成一份標本，每一份標本 含25yL-40yL培養液;收集在同樣條件下培養的沒有放置胚胎的培養液作為陰性對照。
[0020] 體外受精受者:2014年1月至12月，于我中心進行體外受精治療的不孕夫婦。進行 輔助生殖治療的適應癥包括輸卵管因素、子宮內膜異位癥、男性因素或特發性不孕以及免 疫學因素或前試管嬰兒移植周期不明原因失敗者。
[0021] (2)用液相芯片高通量的蛋白質分析技術(LHTPA)來檢測每一份標本中白細胞介 素-8(IL_8)的含量。
[0022] (3)根據形態學評估法和標本中白細胞介素-8(IL_8)的含量來選擇移植胚胎，將 選擇的移植胚胎移植給體外受精受者;可用移植胚胎形態學上質量相同或相似，則選擇其 培養液中IL-8陽性，即培養液中IL-8濃度范圍在0.19pg/ml至10.32pg/ml之間的胚胎來進 行移植。
[0023] (4)如果可用移植胚胎形態學上質量不相同或不相相似，則選擇其培養液中IL-8 陽性，即培養液中IL-8濃度范圍在0.19pg/ml至10.32pg/ml之間的胚胎和/或選擇胎形態學 上質量較好的胚胎來進行移植。
[0024] (5)從收集標本到檢測出IL-8的時間為4h_6h，故在胚胎移植的當天即可用該方法 來篩選發育潛能較好的胚胎來進行移植。
[0025] 下面結合具體實施例進一步說明本發明，
[0026] 實施例1
[0027] 2714(病歷編號）不孕夫婦女方姓名，陳X，33歲，男方姓名，秦XX，診斷：繼發不孕： 左輸卵管梗阻Lap術后；宮腔粘連宮腔鏡術后；女方于2014年1月17日取卵，于2014年1月20 日行胚胎移植手術;在行胚胎移植手術前測定移植胚胎的培養液中IL8的濃度為0.21pg/ ml，所移植胚胎級別為2/5和2/7;女方行胚胎移植手術后14天測血hCG陽性，于2014年9月25 日剖宮產一活男嬰，體重3.2千克。
[0028] 實施例2
[0029] 5124(病歷編號）不孕夫婦女方姓名，楊XX，30歲，男方姓名，方X，診斷：原發不孕： 盆腔重度粘連分離術后;盆腔腔結核(陳舊性）；女方于2014年1月18日取卵，于2014年1月21 日行胚胎移植手術;在行胚胎移植手術前測定移植胚胎的培養液中IL8的濃度為0.27pg/ ml，所移植胚胎級別為1/5和1/7;女方行胚胎移植手術后14天測血hCG陽性，于2014年10月5 日剖宮產一活男嬰，體重3.1千克。
[0030] 實施例3
[0031] 5120(病歷編號）不孕夫婦女方姓名，柳X，27歲，男方姓名，謝X，診斷：右側輸卵管 妊娠保守治療后；左側輸卵管妊娠保守術后;RSA;丈夫弱畸精子癥;女方于2014年1月19日 取卵，于2014年1月22日行胚胎移植手術;在行胚胎移植手術前測定移植胚胎的培養液中 IL8的濃度為0.55pg/ml，所移植胚胎級別為1/8和1/7;女方行胚胎移植手術后14天測血hCG 陽性，于2014年10月4日剖宮產一活男嬰，體重3.5千克。
[0032] 實施例4
[0033] 5110(病歷編號）不孕夫婦女方姓名，賀XX，男方姓名，龍XX，診斷：原發不孕:右側 輸卵管梗阻Lap術后;雙側卵巢開窗Lap術后;女方于2014年1月19日取卵，于2014年1月22日 行胚胎移植手術;在行胚胎移植手術前測定移植胚胎的培養液中IL-8的濃度為0.52pg/ml， 所移植胚胎級別為1/8和1/8;女方行胚胎移植手術后14天測血hCG陽性，于2014年10月4日 剖宮產一活女嬰，體重3.15千克。
[0034] 實施例5
[0035] 5119(病歷編號）不孕夫婦女方姓名，付XX，男方姓名，陳XX，診斷:繼發不孕:卵巢 儲備功能減退;丈夫弱精子癥；乙肝病毒攜帶者；女方于2014年1月20日取卵，于2014年1月 23日行胚胎移植手術；在行胚胎移植手術前測定移植胚胎的培養液中IL-8的濃度為 6.58pg/ml，所移植胚胎級別為1/8和1/8;女方行胚胎移植手術后14天測血hCG陽性，于2014 年10月9日剖宮產一活女嬰，體重2.9千克。
[0036] 實施例6
[0037] 5769(病歷編號)不孕夫婦女方姓名，徐XX，男方姓名，原發不孕:丈夫弱精子癥；月 經不調；一次AIH術后;女方于2014年7月12日取卵，于2014年7月15日行胚胎移植手術;在行 胚胎移植手術前測定移植胚胎的培養液中IL-8的濃度為0.52pg/ml，所移植胚胎級別為1/8 和1/8;女方行胚胎移植手術后14天測血hCG陽性，于2014年10月9日平產一活女嬰和一活男 嬰，體重分別為1.99千克和1.73千克。
[0038]對于330例的情況作綜合說明效果：
[0039] (1)移植前人胚胎的培養液中可以檢測到IL-8。移植前人胚胎的培養液中LI-8的 陽性率為32.42% (107/330)，而陰性對照組LI-8的陽性率為0% (0/9)，（表1和圖1)。
[0040] 表1.人移植前胚胎培養液中IL-8的濃度
[0042] 注:*P = 0.003，0.000和0.000，與陰性對照組、研究組和LI-8陰性組比較。= 0.000，與LI -8陰性組比較。
[0043] (2)移植前胚胎培養液中的IL-8與體外受精受者結局的關系
[0044] 在LI-8陽性組，妊娠率和胚胎種植率別為54.21 % (58/107)和27.62% (66/239); 在LI-8陰性組，妊娠率和胚胎種植率別為40.81 % (91/223)和19.92% (97/487) ;LI-8陽性 組和在LI-8陰性組間妊娠率和胚胎種植率的比較均有顯著差異性(P = 0.022和0.020);在 LI-8陽性組與LI-8陰性組比較，臨床妊娠率較高，而流產率較低，但兩組間沒有顯著差異性 (P = 0.12和0.17);LI-8陽性組與LI-8陰性組間生化妊娠率與活產率比較，沒有顯著差異性 ((表2和圖2)。結果表明，移植前人胚胎培養液中的IL-8陽性預示體外受精受者患者有較高 的妊娠率和較好的胚胎種植潛能，還預示體外受精受者可能有高的臨床妊娠率和較低的流 產率。移植前人胚胎培養液中IL-8陽性的體外受精受者，雖然其活產率與IL-8陰性的患者 比較沒有顯著差異性，但因其妊娠率增加，結果至其嬰兒活產數增加。如果用移植前人胚胎 培養液中的IL-8的濃度(0.19至10.32pg/ml ((mean+2SD)預測體外受精受者在體外受精后 是否妊娠，則陽性預測值=56.86% (58/(58+49-5))。
[0045] 表2.比較移植前人胚胎培養液中IL-8陽性與陰性的患者的體外受精受者的臨床 結局
[0047] ★P = 0.022，*P = 0.020
[0048] (3)移植前人胚胎培養液中IL-8與移植胚胎的質量和細胞數之間的關系
[0049] LI-8陽性組和LI-8陰性組間移植胚胎的平均細胞數(mean土SEM)沒有明顯的差異 (P = 0.32)(表3)。移植前人胚胎培養液中IL-8陽性與陰性的患者，根據移植胚胎質量分為 三組：優質胚胎組（good quality embryo group)優質和普通胚胎組（good and ordinary quality embryo group)及普通胚胎組（ordinary quality embryo group)。在優質胚胎 組，所有患者移植的胚胎均為優質胚胎;在優質和普通胚胎組，每位患者移植的胚胎中既有 優質胚胎，又有普通胚胎;在普通胚胎組，每位患者移植的胚胎均為普通胚胎。結果表明， LI-8陽性組和LI-8陰性組間移植胚胎的質量沒有顯著差異性(P = 0.71)(表3)。從普通胚胎 組、優質和普通胚胎組至優質胚胎組，LI-8陽性組和LI-8陰性組間妊娠率（pregnancy rate)比較，差異性逐漸增加，但沒有顯著性(P=l.00,0.18和0.07)(表4)。結果顯示，當移 植相同質量的胚胎時，移植前人胚胎培養液中IL-8陽性較IL-8陰性者的妊娠率(pregnancy rate)高，移植前人胚胎培養液中IL-8陽性者移植優質胚胎(good quality embryo)時，妊 娠率(pregnancy rate)可高達60 · 76% (表4)。
[0050]表3. LI -8陽性組和LI -8陰性組間移植胚胎的質量和細胞數比較
[0052]表4. LI-8陽性組和LI-8陰性組間移植胚胎的質量和妊娠率的關系
[0054]用移植前人胚胎培養液中IL-8陽性的形態學上優質胚胎移植給體外受精受者，妊 娠率(pregnancy rate)可提高8%以上，達60.76% ;用移植前人胚胎培養液中IL-8陽性的 優質胚胎和普通胚胎移植給體外受精受者，妊娠率可提高12%以上，達47.37%。因而，用本 方法結合現有的形態學方法選擇胚胎來進行移植，較現有的單用形態學方法選擇胚胎來進 行移植，妊娠率可提高8-12%以上。
[0055] (4)分析:為什么用本方法可以選擇發育潛能良好的移植胚胎和改善體外受精受 者的妊娠結局
[0056] 胚胎的植入為成功妊娠所必需，大約有一半的胚胎在植入后發生流產。在臨床上， 胚胎植入失敗與復發性流產和體外受精受者的低成功率密切相關，如何使胚胎成功植入仍 然是輔助生殖技術面臨的一個關鍵技術難題。在胚胎植入時，植入部位的微環境中含有大 量的趨化因子和前炎癥細胞因子。
[0057] 趨化因子是一類小分子細胞因子或細胞分泌的信號蛋白，趨化因子的主要功能是 參與白細胞迀移。在生殖醫學領域，趨化因子在排卵、月經、胚胎植入及分娩過程中起著重 要的作用。
[0058]眾所周知，母胎界面的趨化因子是胚胎植入所必需得因子。有研究表明，人的子宮 內膜中有9種趨化因子高度表達:單核趨化蛋白-3、嗜酸細胞活化趨化因子、ractalkine、巨 細胞炎性蛋白_10、6〇^116、11^-8、!161]1〇;1^11:瓜七6(^趨化因子-1、!161]1〇;1^11:抑七6(^趨化因 子-4和巨噬細胞起源趨化因子。在子宮內膜容受期和妊娠早期，趨化因子mRNA的表達上調。 [0059] 在移植早期，移植部位有高水平的Thl型前炎癥細胞因子和IL-6，IL-8，TNF_a等前 炎癥細胞因子。這些前炎癥細胞因子主要由子宮內膜細胞和移植部位募集而來的免疫細胞 分泌。實際上，胚胎植入過程、胎盤形成過程、早孕和中期妊娠早期更象一個開放傷，該開放 傷需要強有力的炎癥應答。在妊娠早期，為了植入，胚胎必需突破子宮的上皮層，破壞子宮 內膜組織而侵入，繼之，滋養細胞代替子宮內膜和母體血管平滑肌，以便使胎盤胎兒單位獲 得充足的營養。為了確保充分修復子宮內膜和清除細胞碎片，需要一個炎癥環境。因此早期 妊娠可以稱為前炎癥細胞相。
[0060] 近來的研究表明，胚胎的成功種植可能繼發于損傷誘導的炎癥反應;胚胎植入部 位的趨化因子和前炎癥細胞因子水平與IVF/ICSI患者的臨床結局成正相關;胚胎植入部位 的趨化因子和前炎癥細胞因子是胚胎成功種植的關鍵。
[0061] IL-8是趨化因子家族的一員，主要由單核細胞、成纖維細胞、上皮細胞和內皮細胞 分泌。IL-8有兩個主要的功能，一是趨化功能，二是參與與炎癥相關的固有免疫應答，稱為 前炎癥細胞因子。
[0062]在整個月經周期，IL-8主要定位在腔上皮、腺上皮和內皮細胞;在子宮內膜容受前 期和容受期，IL-8的表達明顯增高。因IL-8既是趨化因子，又是前炎癥細胞因子，故在早孕 和中期妊娠早期，母胎界面和植入部位的IL-8在維持妊娠方面起著極為重要的作用。
[0063]總之，我們的研究結果表明，移植前胚胎培養液中的IL-8是可以檢測到的。來自移 植前胚胎的IL-8作為趨化因子和前炎癥細胞因子，可能在胚胎植入部位起作用。移植前人 胚胎培養液中IL-8陽性，預示IVF/ICSI患者較高的妊娠率和胚胎種植率，及患者的嬰兒活 產數增加，并預示IVF/ICSI患者可能有高的臨床妊娠率和較低的流產率。移植前人胚胎培 養液中的IL-8不但可以通過預測移植胚胎的質量來提高IVF/ICSI患者的妊娠率，還可以作 為一個獨立的指標來預測IVF/ICSI患者的臨床結局。IL-8可以作為IVF/ICSI病人移植前評 價胚胎發育潛能的一個指標用本方法結合現有的形態學方法選擇胚胎來進行移植，較現有 的單用形態學方法選擇胚胎來進行移植，妊娠率可提高8-12%以上。按照本方法選擇的形 態學上的優質移植胚胎及優質和普通移植胚胎移植給體外受精受者，則妊娠率分別為 60.76%及47.37%，如不按本方法選擇的形態學上的優質移植胚胎及優質和普通移植胚胎 移植給IVF/ICSI患者，則妊娠率分別為52.59%及34.85%。用本方法結合現有的形態學方 法選擇胚胎來進行移植，較現有的單用形態學方法選擇胚胎來進行移植，妊娠率可提高8-12%以上。
【主權項】
1. 一種通過選擇發育潛能良好的胚胎來改善試管嬰兒臨床結局的方法，其特征是這種 方法包括以下步驟： (1) 在移植的當天，收集每個體外受精受者的每次胚胎移植前的培養待移植胚胎的培 養液;在體外受精后的第一天，在確認受精后，將每個體外受精受者的每個受精卵分別放置 在30-50yL 10 %人血清白蛋白的卵裂液液滴中，置37°C、5% C02的培養箱中培養至胚胎移 植前;胚胎在體外培至第3天，在進行胚胎移植前的4h-6h，根據以卵裂率和形態學為基礎的 形態學評估法評價每個體外受精受者待移植胚胎的質量，每個體外受精受者每次移植2-3 個胚胎;每個體外受精受者的待移植的根據形態學評估法胚胎選定后，將待移植的胚胎移 走，即收集已培養待移植胚胎2日的含10%人血清白蛋白的卵裂液液滴，即培養待移植胚胎 的培養液；鑒于每個體外受精受者每次移植2-3個胚胎，每個胚胎在移植前均放置在一個 30-50yL含10 %人血清白蛋白的卵裂液液滴中培養2日，每個體外受精受者的每次胚胎移植 前的培養待移植胚胎的培養液為分別培養2-3個待移植胚胎2日的含10%人血清白蛋白的卵 裂液液滴，收集每個體外受精受者每次胚胎移植前培養待移植胚胎的這2-3個液滴，組成一 份標本，每一份標本含25yL -40yL培養液;收集在同樣條件下培養的沒有放置胚胎的培養 液作為陰性對照； (2) 用液相芯片高通量的蛋白質分析技術(LHTPA)來檢測每一份標本中白細胞介素-8,即IL-8的含量； (3) 根據形態學評估法和標本中白細胞介素-8的含量來選擇移植胚胎，將選擇的移植 胚胎移植給體外受精受者;可用移植胚胎形態學上質量相同或相似，則選擇其培養液中IL-8陽性，即培養液中IL-8濃度范圍在0.19 pg/ml至10.32 pg/ml之間的胚胎來進行移植； (4) 如果可用移植胚胎與形態學上質量不相同或不相相似，則選擇其培養液中IL-8陽 性，即培養液中IL-8濃度范圍在0.19 pg/ml至10.32 pg/ml之間的胚胎和/或選擇胎形態 學上質量較好的胚胎來進行移植； (5) 從收集標本到檢測出IL-8的時間為4h-6h，故在胚胎移植的當天即可用該方法來 篩選發育潛能較好的胚胎來進行移植。
【文檔編號】G01N33/68GK106018825SQ201610341493
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月23日
【發明人】黃官友
【申請人】黃官友