一種用于食品中腸產毒性大腸桿菌檢測的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種用于食品中腸產毒性大腸桿菌檢測的試劑盒。腸產毒性大腸桿菌(ETEC)性腸炎主要通過污染的水源、食品、牛奶、飲料等傳播。現有技術的檢測方法耗時耗力，檢測不便，而本發明提供了特異性檢測腸產毒性大腸桿菌的試劑盒，試劑盒中含有特異性結合腸產毒性大腸桿菌的適配子，所述適配子為單鏈DNA。本發明試劑盒具有檢測時間短、研發周期短、質量穩定、操作簡單等優點，在食品與衛生安全檢測中得到廣泛應用。
【專利說明】一種用于食品中腸產毒性大腸桿菌檢測的試劑盒 發明領域
[0001] 本發明屬于食品檢測技術領域，具體涉及一種用于食品中腸產毒性大腸桿菌檢測 的試劑盒。
【背景技術】
[0002] 腸產毒性大腸桿菌(ETEC)性腸炎主要通過污染的水源、食品、牛奶、飲料等傳播， 產毒性大腸桿菌(ETEC)產生的毒素分為不耐熱腸毒素(LT)和耐熱腸毒素(ST)，根據其來源 不同，耐熱腸毒素又可分為豬源性（STp)和人源性（STa)，它們分別由位于質粒上的三種毒 力基因編碼，產毒性大腸桿菌(ETEC)-般含有三個毒力基因中的一個或幾個基因。腸產毒 性大腸桿菌(ETEC)檢測以LT檢測為主，但是約有5~10%腸產毒性大腸桿菌不具有LT基因， 容易漏檢。
[0003] 在中國，腸產毒性大腸桿菌(EnterotoxigenicE.coli，ETEC)是由致瀉性大腸桿 菌引起的腹瀉疾病的最常見病原菌。國內不同省市地區關于由DEC引起的腹瀉疾病的流行 病學調查顯示，ETEC無論在地區覆蓋范圍還是在出現頻率上，在引起腹瀉的病原菌中始終 處于最顯著地位。國際上對于ETEC的相關報道也說明，它是在發展中國家引起嬰幼兒腹瀉 和旅游者腹瀉的最主要病原菌。
[0004] 據不完全統計，發展中國家每年受ETEC感染的5歲以下兒童約有2.8_4億人次，5-14歲兒童大約1億人次，15歲以上成年人大約4億人次之多;在非洲、亞洲和拉丁美洲所出現 過的旅游者腹瀉事件中有1/5-1/3都是由ETEC所引起的；世界上每年都有30-50萬人死于 ETEC引起的腹瀉，其中大部分為嬰幼兒。
[0005] 目前，國內外在食品中大腸桿菌檢測時常用的檢測方法因其檢測手段、識別對象 各有不同而各具優缺點。傳統檢測大腸桿菌的方法需要先分離再培養，然后用經典的方法 鑒定，耗時、不靈敏是這些方法普遍存在的問題。免疫學方法簡單、方便、迅速、特異性較好， 但是仍有交叉反應比較嚴重、假陽性多、靈敏度偏低等不足之處。聚合酶鏈式反應(PCR)技 術雖具有準確、靈敏、快速的特點，但其在檢測數目較多的樣品時操作比較繁雜，因此在聚 合酶鏈式反應(PCR)技術的基礎上又衍生出很多新型聚合酶鏈式反應(PCR)技術，如多重 PCR技術，然而多重PCR雖簡化了PCR實驗的操作，但是由于該技術需數對引物同時進行擴 增，很容易產生非特異性條帶或假陽性，影響檢測結果。
[0006] 通過指數富集配體的系統進化（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)技術篩選獲得的寡核苷酸序列稱為適配子(aptamer)。其 原理就是利用分子生物學技術，構建人工合成的單鏈隨機寡核苷酸文庫，其隨機序列長度 在20-100個堿基左右，將隨機寡核苷酸文庫與靶分子相互作用，保留結合的寡核苷酸配基， 經反復擴增、篩選數個循環，即可使與該靶子特異結合的寡核苷酸序列得到富集，最終獲得 靶分子的特異寡核苷酸配基。該技術具有庫容量大、靶分子范圍廣、親和力高、特異性強等 優點。在臨床檢測方面，特別是對一些未知的致病性細菌或病毒的研究，雖然不知道其內部 結構、功能以及這些物質的表位，但將其作為靶物質，通過SELEX技術篩選到其相應的適配 子，以檢測靶物質，已成為該領域的研究熱點。
[0007] 利用SELEX技術篩選獲得的適配子識別分子的模式與蛋白抗體類似，但與蛋白類 抗體相比，核酸類配基具有更多的優越性，如不受免疫條件和免疫源性限制，可體外人工合 成，變性與復性可逆，可修飾并有利于長期保存和室溫運輸等。更重要的是，適配子的靶分 子更為廣泛，包括金屬離子、有機染料、氨基酸、細胞因子、輔因子、氨基糖苷、抗生素、堿基 類似物、核苷酸和多肽等。其中蛋白質類靶分子最多，包括酶、生長因子、抗體、轉錄因子、細 胞粘附分子和選擇素等。完整的病毒顆粒和細菌病原體，甚至完整的細胞也可以通過復合 靶子SELEX技術或消減SELEX技術篩選出高親和力的寡核苷酸配基。適配子比抗體具有更高 的特異性和精確識別能力，甚至能識別單抗不能區分的蛋白質分子。這些特性使得適配子 在生物醫藥和食品衛生研究領域得到廣泛應用，成為不可缺少的有力工具。
【發明內容】
[0008] 本發明公開了一種高特異高敏感檢測腸產毒性大腸桿菌ETEC的方法，提高了它的 檢測和診斷效率。
[0009] 為了解決現有大腸氏菌檢測中存在的檢測周期長、靈敏度低、假陽性多等問題，本 發明提供一種特異識別腸產毒性大腸桿菌ETEC的試劑盒及其應用。
[0010] 上述試劑盒，適配子可以采用生物素標記。
[0011] 本發明中，所述的核酸適配體能夠特異結合腸產毒性大腸桿菌。
[0012] 本發明另外提供一種腸產毒性大腸桿菌ETEC適配子的篩選方法。
[0013] 隨機單鏈DNA文庫和引物由上海生物工程有限公司合成。
[0014] 隨機單鏈DNA文庫:5'_
[0015] TTGGACAGTGGACGTGAAGC(N36)GACCAAGTGACAGTGACGAG-3 '（注：n36代表36個A、T、C、 G堿基中任意一種的36個集合）。
[0016] 引物1:5 ' -TTGGACAGTGGACGTGAAGC-3 '
[0017] 引物 Π : 5 ' -CTCGTCACTGTCACTTGGTC-3 '
[0018]
[0019]引物1￥:5'-生物素-(：1^611^(^611^(：11^61'(：-3'。
[0020] 2. SELEX篩選獲得腸產毒性大腸桿菌ETEC特異的寡核苷酸適配子
[0021] 1) SELEX 篩選過程：
[0022] a.首輪篩選，取合成的隨機單鏈DNA 10yg加入到400ul IX結合緩沖液，95度變性 5min，然后迅速置于冰上lOmin;
[0023] b.加入lmL腸產毒性大腸桿菌ETEC菌懸液2.0 X 108，于37°C搖床lOOrpm結合1.2小 時，使單鏈DNA文庫與菌充分作用；
[0024] c.更換離心管，以去除與管壁結合的單鏈DNA，室溫下離心10 OOOrpm離心10min分 離未與菌結合的單鏈DNA文庫；
[0025] d.棄上清，加入600yL 1 X沖洗緩沖液，離心10 OOOrpm離心10min，重復此過程4 次，目的是洗去未與菌結合的核酸片段；
[0026] e ·接上步離心后去上清，加入100yL去離子水99°C加熱3min，高速離心18 OOOrpm 離心15min棄沉淀，換管留上清(核酸片段存于上清中），-20°C保存備用。
[0027] 2)PCR富集與腸產毒性大腸桿菌ETEC特異結合的寡核苷酸適配子：
[0028] 每輪篩選后獲得的與腸產毒性大腸桿菌ETEC特異結合的寡核苷酸適配子文庫通 過PCR擴增得到富集；
[0029] a.以上述上清為模板，通過引物I和引物IV擴增產生一端帶生物素標記的雙鏈 DNA；
[0030] b. PCR擴增條件:95 °C預變性3min，然后進行30循環95 °C變性35s，60 °C退火37s，72 °C延伸33s，最后72°C延伸lOmin;
[0031] c. PCR產物純化后，一端帶生物素標記的雙鏈DNA通過生物素-鏈親合素之間的作 用與鏈親合素交聯的磁珠結合，經過IX連接（the standard Binding and Washing Buffer，B&W)緩沖液洗滌3次，用lOOmM的新鮮NaOH 37°C變性30min，使不帶生物素的單鏈 DNA從鏈親合素交聯的磁珠上洗脫下來，測定其單鏈DNA的濃度，用作下一輪篩選的富集庫。 [0032] 3)重復篩選:重復上述SELEX篩選過程和PCR擴增富集過程，共進行14輪篩選，其中 第6、10輪分別用克雷伯菌、腸出血性大腸桿菌進行反篩。
[0033]特異識別腸產毒性大腸桿菌ETEC的寡核苷酸適配子的核苷酸序列如下：
[0057] 本發明通過SELEX技術的篩選過程，獲得高親和性特異識別腸產毒性大腸桿菌 ETEC的寡核苷酸適配子(適配體），用于快速、準確檢測腸產毒性大腸桿菌ETEC。
[0058] 以上述核酸適配子篩選文庫為基礎，可對文庫兩端的固定序列的個別核苷酸進行 替換、顛倒、移位，或對其長度進行小幅延長或縮短，或對文庫中間的隨機序列進行延長或 縮短，或對擴增文庫的引物作相應的簡單改造，然后制備簡單改造后的文庫和引物進行核 酸適配子的篩選、PCR擴增和分析與應用。
[0059] 本發明的有益效果:本發明設計出了一個性能優秀的隨機單鏈寡核苷酸文庫。文 庫具有接近長度下限的短固定序列和較長的隨機序列，充分保證了文庫中單鏈寡核苷酸的 多樣性。文庫固定序列（引物序列）的獨特設計能使用高退火溫度進行PCR擴增，既能有效獲 得目的產物，又能有效抑制非特異性產物。本文庫及引物應用于腸產毒性大腸桿菌ETEC的 核酸適配子篩選獲得成功，所述的適配子可以用于制備檢測試劑盒，從而用于食品中的腸 產毒性大腸桿菌ETEC的檢測。本方法具有檢測時間短、研發周期短、質量穩定、操作簡單等 優點，在食品與衛生安全檢測中能夠得到廣泛應用。
【具體實施方式】
[0060] 實施例1腸產毒性大腸桿菌ETEC菌液的制備
[00611 將大腸桿菌ETEC-STa+菌株，在LB液體培養基試管中，37攝氏度，180r/min搖動過 夜，備用。
[0062]實施例2適配子的獲得
[0063] 1、隨機單鏈DNA文庫和引物由上海生物工程有限公司合成。
[0064] 隨機單鏈DNA文庫：5'_
[0065] TTGGACAGTGGACGTGAAGC (N36)GACCAAGTGACAGTGACGAG-3 '（注：n36代表36個A、T、C、 G堿基中任意一種的36個集合）。
[0066] 引物1:5 ' -TTGGACAGTGGACGTGAAGC-3 '
[0067] 引物 Π : 5 ' -CTCGTCACTGTCACTTGGTC-3 '
[0068]
[0069]引物IV: 5' -生物素-CTCGTCACTGTCACTTGGTC-3'。
[0070] 2. SELEX篩選獲得腸產毒性大腸桿菌ETEC特異的寡核苷酸適配子 [0071] 1)SELEX 篩選過程：
[0072] a.首輪篩選，取合成的隨機單鏈DNA 10yg加入到400ul IX結合緩沖液，95度變性 5min，然后迅速置于冰上lOmin;
[0073] b ·加入lmL腸產毒性大腸桿菌ETEC菌懸液2 · 0 X 108，于37°C搖床lOOrpm結合1 · 2小 時，使單鏈DNA文庫與菌充分作用；
[0074] c.更換離心管，以去除與管壁結合的單鏈DNA，室溫下離心10 OOOrpm離心10min分 離未與菌結合的單鏈DNA文庫；
[0075] d.棄上清，加入600yL 1 X沖洗緩沖液，離心10 OOOrpm離心10min，重復此過程4 次，目的是洗去未與菌結合的核酸片段；
[0076] e ·接上步離心后去上清，加入100yL去離子水99°C加熱3min，高速離心18 OOOrpm 離心15min棄沉淀，換管留上清(核酸片段存于上清中），-20°C保存備用。
[0077] 2)PCR富集與腸產毒性大腸桿菌ETEC特異結合的寡核苷酸適配子：
[0078] 每輪篩選后獲得的與腸產毒性大腸桿菌ETEC特異結合的寡核苷酸適配子文庫通 過PCR擴增得到富集；
[0079] a.以上述上清為模板，通過引物I和引物IV擴增產生一端帶生物素標記的雙鏈 DNA；
[0080] b. PCR擴增條件:95 °C預變性3min，然后進行30循環95 °C變性35s，60 °C退火37s，72 °C延伸33s，最后72 °C延伸lOmin;
[0081] c. PCR產物純化后，一端帶生物素標記的雙鏈DNA通過生物素-鏈親合素之間的作 用與鏈親合素交聯的磁珠結合，經過IX連接（the standard Binding and Washing Buffer，B&W)緩沖液洗滌3次，用lOOmM的新鮮NaOH 37°C變性30min，使不帶生物素的單鏈 DNA從鏈親合素交聯的磁珠上洗脫下來，測定其單鏈DNA的濃度，用作下一輪篩選的富集庫。 [0082] 3)重復篩選:重復上述SELEX篩選過程和PCR擴增富集過程，共進行14輪篩選，其中 第6、10輪分別用克雷伯菌、腸出血性大腸桿菌進行反篩。
[0083] 4)富集寡核苷酸適配子與菌結合率的測定：
[0084]第7、12、14輪SELEX篩選的產物，以標記地高辛的引物ΙΠ和標記生物素的引物IV進 行PCR擴增，純化的PCR產物與鏈親和素標記的磁珠充分反應并用NaOH解鏈，地高辛標記的 單鏈DNA游離在上清中；
[0085] 5)富集寡核苷酸適配子文庫的測序結果與分析：
[0086] a.將最后的富集文庫擴增為雙鏈，連接pEGM-T載體，轉化E. coli DH5a，隨機挑取 60個陽性克隆進行DNA序列測定，其中23個為可用序列，見SEQ ID NO: 1-23所示；
[0087] 實施例3結合特性驗證
[0088] 將適配子分別取1.5yg，用牛小腸堿性磷酸酶(CIP)37°C消化lh，純化回收去磷酸 化的DNA;通過T4多核苷酸激酶標記[γ-32P]ATP于去磷酸化的DNA分子末端。lOnmol放射性 標記的DNA適配子分別與不同濃度的菌體37°C孵育30min，各組反應液經硝酸纖維素膜濾 過，洗滌濾膜，干燥濾膜，液閃計數儀測定濾膜上殘留的放射量，同一樣品平行做兩次測定。 計算各個適配子與菌體的解離常數。結果如下：
[0090] 從以上結果可以看出，本發明的23個適配子具有非常強的結合特性，現有技術中 也沒有所述結合特性的適配子能夠結合所述的菌體。
[0091] 實施例5菌體的鑒定
[0092]寡核苷酸適配子SEQ ID N0:1-23的序列送上海生物工程有限公司合成并在5'端 標記羥基熒光素(FAM)。
[0093] 取5'FAM熒光標記的寡核苷酸適配子SEQ ID N0:l-23(100nM)各300yL，分別與腸 產毒性大腸桿菌ETEC，腸侵襲性大腸桿菌，腸致病性大腸桿菌，腸出血性大腸桿菌、化膿性 鏈球菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌（1.5 X 108)于37 °C孵育lh，用1XBB(50mM Tri s-HCl (pH 7.4)，5mM KCl，I00mM NaCl，ImMMgC12)洗滌2次后，將菌體重懸于500yL 1XB B，用BD FACSC alibur流式細胞分析儀檢測結合上FAM標記的適配子的菌體百分率(測三次取平均 值），結果顯示腸產毒性大腸桿菌ETEC寡核苷酸適配子競爭結合腸產毒性大腸桿菌ETEC的 能力為100%，而針對腸侵襲性大腸桿菌，腸致病性大腸桿菌，腸出血性大腸桿菌、化膿性鏈 球菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌菌沒有結合率。
[0094] 這充分說明，本發明的適配子具有較好的特異性和穩定性。
[0095] 以上僅為本發明的優選實施例而已，并不用于限制本發明，對于本領域的技術人 員來說，凡在本發明的精神和原則之內所做的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本 發明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 一種用于食品中腸產毒性大腸桿菌檢測的試劑盒，其含有能特異性結合腸產毒性大 腸桿菌的核酸適體。2. 如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述核酸適體序列如SEQ ID No: 1-23任一 所示。3. -種檢測食品中腸產毒性大腸桿菌的方法，其特征在于利用權利要求1-2任一項所 述的試劑盒。
【文檔編號】G01N33/569GK106018802SQ201610483756
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年6月27日
【發明人】楊國林
【申請人】楊國林