一種檢測t-2毒素的熒光免疫層析試紙的制作方法

一種檢測t-2毒素的熒光免疫層析試紙的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種檢測T?2毒素的熒光免疫層析試紙，包括支撐體和固定在支撐體上的吸附層，吸附層從測試端開始依次為吸附纖維層、熒光抗體纖維層、纖維素膜層及吸水材料層，所述的纖維素膜層上設有用偶聯T?2的載體蛋白溶液印制的隱形檢測印跡和用羊抗小鼠IgG、兔抗小鼠IgG或羊抗兔IgG抗體溶液印制的隱形對照印跡；所述的熒光抗體纖維層采用吸附熒光抗體的玻璃纖維棉制成，熒光抗體為氧化石墨烯熒光納米材料、NaYF4:Yb,Tm納米顆粒或NaGd(WO4)2：Eu3+納米顆粒標記的T?2單克隆抗體或者多克隆抗體。本發明的試紙條具有特異性強、靈敏度高、穩定性高、安全性好、簡便、快速的特點，在便攜式熒光讀數儀下可實現現場定量檢測，能滿足不同層次人員的需要。
【專利說明】
一種檢測T-2毒素的熒光免疫層析試紙
技術領域
[0001] 本發明涉及一種免疫層析試紙，特別是涉及一種檢測Τ-2毒素的熒光免疫層析試 紙。
【背景技術】
[0002] Τ-2毒素(T-2toxin，稱Τ-2)是單端孢霉烯族毒素之一，主要產生菌是鐮孢菌屬，如 iSi(Fusariumsporotrich-oides) IMI (Fusariumspor otrichiella) 等。T-2毒素作為一種常見的真菌毒素，在自然界中廣泛存在，主要污染小麥、大麥、玉米等 糧食作物及其制品，對人類健康及畜牧業構成了較大危害。T-2毒素可引起機體過氧化損 傷，動物實驗表明，其毒性因使用劑量分為急性、亞急性和慢性。T-2毒素還具有致畸性和弱 的致癌性，但不具有致突變性。T-2毒素中毒后的一般臨床癥狀為厭食、嘔吐、腹瀉、生長停 滯、繁殖和神經機能障礙等。此外，T-2毒素可能還與我國某些地區大骨節病、食管癌和克山 病的高發病率有關。1997年聯合國糧農組織(FAQ)和世界衛生組織(WHO)在日內瓦召開的聯 席會議上，把T-2毒素同黃曲霉毒素一起作為自然存在的最危險的食品污染源。因此針對Τ-2 開展有效的快速檢測很有意義。目前，用于 T-2 的檢測方法主要有生物鑒定法、化學分析 法、儀器分析法和免疫分析法4大類。生物鑒定法的優點是待檢樣品不需很純，缺點是靈敏 度低、實驗周期較長。化學分析法的優點是經濟實用，但不能準確定量，且分析結果的可重 復性和再現性差。儀器分析法具有高分離、高檢測效能及快速分析能力等優勢，但對樣品的 前處理要求高，對操作人員技術要求高，且儀器設備價格昂貴，不適于快速檢測。免疫分析 法操作簡單，成本低，而且具有較好的準確性和靈敏性，同時能進行定性和半定量或一定定 量的檢測，適合于對大量樣品的篩查，是目前優先發展的檢測技術。
[0003] 未修飾的氧化石墨烯表現出很弱的熒光，在紫外光照射下用肉眼基本上觀察不到 熒光。這是由于氧化石墨烯納米片表面有很多含氧基團，例如納米片表面上的環氧鍵和羥 基，納米片側面的羧基，這些基團通常能誘導電子-空穴對的非輻射復合，從而導致氧化石 墨烯的熒光很弱。經過正丁胺修飾以后，氧化石墨烯納米片表面的環氧鍵和羧基都被反應 掉，這將極大地降低其非輻射復合能力。因此修飾后，氧化石墨烯表現出很強的熒光可作為 新型標記物在生物檢測領域應用。雖然膠體金試紙在此方面應用較廣，但其不能做到定量 檢測，作為更敏感、穩定、靈活、安全的氧化石墨烯熒光層析試紙的研究，是膠體金免疫檢測 技術的有力補充，丞待加強該方面的研究和探討。
[0004] 上轉換熒光納米顆粒經過表面修飾與活化后，作為新型標記物在生物檢測等領域 進行應用。因其獨特的物理結構和光學特性，使上轉換熒光免疫試紙法與理化檢測與微生 物檢測技術相比，具有靈敏度高，操作過程簡單，成本低及能進行大批量現場檢測的特點； 與膠體金試紙相比，具備定量檢測的特色，作為更敏感、穩定、靈活、安全的UPT-LF的研究， 是膠體金免疫檢測技術的有力補充。但是目前上轉換熒光材料的制備和試紙的研究仍存在 發光效率不夠，熒光材料種類少等缺陷，丞待加強該方面的研究和探討。
[0005] 下轉換熒光納米顆粒具有高靈敏度，是一種完全惰性的無機發光材料，具有獨特 物理結構和光學特性，可作為新型標記物應用在生物檢測領域。將其與生物學、免疫學、材 料學相結合而開發的用于T-2快速檢測的下轉換熒光納米顆粒標記免疫層析方法，在靈敏、 穩定、靈活方面顯示了優異的特性，是膠體金免疫檢測技術的有利補充，亟待加強該方面的 研究和探討。

【發明內容】

[0006] 本發明所要解決的技術問題是提供一種檢測T-2毒素的熒光免疫層析試紙，該試 紙具有特異、靈敏、快速、簡便等特點，能定量檢測食品、飼料、中草藥中的T-2毒素。
[0007] 為了實現上述目的，本發明所采用的技術方案是：
[0008] 一種檢測T-2毒素的熒光免疫層析試紙，包括支撐體和固定在支撐體上的吸附層， 吸附層從測試端開始依次為吸附纖維層、熒光抗體纖維層、纖維素膜層及吸水材料層，所述 的纖維素膜層上設有用偶聯T-2的載體蛋白溶液印制的隱形檢測印跡和用羊抗小鼠IgG、兔 抗小鼠IgG或羊抗兔IgG抗體溶液印制的隱形對照印跡;所述的熒光抗體纖維層采用吸附熒 光抗體的玻璃纖維棉制成，焚光抗體為氧化石墨稀焚光納米材料、NaYF4:Yb，Tm納米顆粒或 他6(1(1〇4)2 4113+納米顆粒標記的1'-2單克隆抗體或者多克隆抗體。
[0009] 所述的支撐體包括設置在吸附層底面的底層和設置在吸附層頂面的面層。
[0010] 所述的支撐體包括透明的中空管體，吸附層填充在中空管體內部，吸附層從測試 端開始依次為吸附纖維層、熒光抗體纖維層、纖維素膜層及吸水材料層。
[0011]所述的中空管體的上端裝有連接頭，連接頭上端設置有輔助吸附裝置，所述的輔 助吸附裝置包括與所述連接頭呈密封連接的連接套和設置在所述連接套上部的氣囊，氣囊 的出氣口依次經連接套上部的進氣通道、連接頭的內腔與中空管體的上口部相連通，進氣 通道所在的連接套側壁上設置有只能向外排氣無法向內吸氣的單向出氣裝置。
[0012]所述的單向出氣裝置包括設置在進氣通道所在的連接套側壁的換氣腔，換氣腔內 設置有圓球形的密封球，換氣腔的底面上開有與密封球相對應的第一出氣口，第一出氣口 經出氣通道與進氣通道相連通，換氣腔側面設置有與外界大氣相連通的第二出氣口，構成 只能向外排氣、無法向進氣通道吸氣的單向出氣結構。
[0013 ] 所述的第一出氣口為圓形，其直徑小于密封球的直徑。
[0014] 所述的連接頭為上下開口的中空結構，其下端與中空管體的上端呈密封連接，連 接頭上部的外壁上設置有外螺紋，連接套的下部設置有與連接頭相對應的盲孔，盲孔內壁 上設置有與外螺紋相對應的內螺紋，連接頭通過外螺紋和內螺紋旋裝在連接套下部的盲孔 內，連接頭的頂部與盲孔頂部之間在連接套上設置有防止漏氣的密封圈。
[0015] 所述的隱形檢測印跡和隱形對照印跡呈相間設置在纖維素膜層的表面，間距為5-15mm〇
[0016] 所述的中空管體的內腔為長方形。
[0017] 所述的氧化石墨烯熒光納米材料是一種以氧化石墨烯為基質通過酰氯化反應和 烷基胺來修飾后，用銀納米顆粒進行表征后得到的熒光納米材料。
[0018] 所述的氧化石墨烯熒光納米材料標記的T-2單克隆抗體或者多克隆抗體的制備方 法，包括以下步驟：
[0019] (1)氧化石墨烯熒光材料修飾：
[0020] 取20mg氧化石墨磨碎，加入到5mL DMF中，超聲混勻后，加入20mL二氯亞砜，80°C下 加熱回流48h后離心，得到中間體酰氯化氧化石墨烯，用四氫呋喃洗滌兩次后，干燥;再在抽 真空氮氣保護的條件下，將酰氯化氧化石墨烯和lmL正丁胺混合，60°C反應72h，冷卻至室 溫，得到烷基胺修飾的氧化石墨稀，分散于20mL雙蒸水中，8000r/min離心，除去未反應的正 丁胺，將剩余的反應液通過旋轉蒸發儀蒸干，蒸干后的干物質重新分散在雙蒸水中，配制成 濃度為lmg/mL的修飾的氧化石墨稀焚光材料水溶液；
[0021 ] (2)表面標記T-2抗體銀納米顆粒溶液的制備：
[0022] (a)將100mg硝酸銀溶解于250mL超純水中，加熱沸騰，加入10mL質量分數1%的檸 檬酸鈉溶液，80°C加熱回流lh后攪拌0.5h，4°C條件下過夜;取lmL過夜后的溶液，加入ImM的 巰基乙酸l〇yL，攪拌24h后離心，除去未反應的巰基乙酸，超純水洗滌3次，用旋轉蒸發儀蒸 干，加超純水配制成濃度為lmg/mL疏基乙酸包覆的銀納米顆粒溶液；
[0023] (b)取O.lmM的EDC 10yL和O.lmM的NHS 10yL，逐步加入到lmL巰基乙酸包覆的銀納 米顆粒溶液中，反應lh，得到羧基活化的銀納米顆粒溶液；
[0024] (c)取0.1 mM的T-2單克隆抗體或多克隆抗體20yL，加入到羧基活化的銀納米顆粒 溶液中，4 °C反應過夜，得到表面標記T-2抗體銀納米顆粒溶液；
[0025] (3)氧化石墨烯熒光納米材料T-2抗體的標記：
[0026]取修飾的氧化石墨烯熒光材料水溶液5mL，加入2mL戊二醛，室溫反應3h，離心，除 去未反應的戊二醛，將剩余的反應液分散在0.01mol/L、pH7.4的PBS緩沖溶液中，加入表面 標記T-2抗體銀納米顆粒溶液，4°C反應3h，經離心，收集氧化石墨烯熒光納米材料標記的T-2單克隆抗體或者多克隆抗體，0.01mol/L、pH7.4的PBS緩沖液洗滌，保存備用。
[0027] 所述他￥?4:丫13，1'111納米顆粒是以似￥?4為基質、￥133+為敏化劑，由￥13和1'111共摻雜形成 的直徑為60~80nm的發藍色熒光的納米顆粒。
[0028]所述的NaYF4: Yb，Tm納米顆粒標記的T-2單克隆抗體或者多克隆抗體的制備方法， 包括以下步驟：
[0029] (1)采用水熱合成法制備NaYF4: Yb，Tm納米顆粒：
[0030] 分別取濃度均為0.5mo 1 /L的 Y (N〇3) 3溶液5.5mL、Yb (N〇3) 3溶液0.5mL和Tm (N〇3) 3溶 液0.5mL，混合均勻，再加入0.4mol/L的檸檬酸鈉溶液2mL，25 °C條件下避光充分反應lh;加 入1.5mo 1/L NH4F溶液7mL，25 °C條件下避光攪拌0.5h，用HN〇3調節pH值至7.4，靜置0.5h，加 雙蒸水稀釋至30mL;再在220 °C下反應24h，冷卻到室溫，經過濾、雙蒸水洗滌、干燥，得到發 藍色光的NaYF4: Yb，Tm熒光納米顆粒；
[0031] (2)熒光納米顆粒的表面硅化：
[0032] 將NaYF4: Yb，Tm熒光納米顆粒加入0.01mol/L、pH7.4的roS緩沖液中，配制成濃度 為lmg/mL的NaYF4: Yb，Tm熒光納米顆粒溶液，再將5mL濃氨水滴入5mL NaYF4: Yb，Tm熒光納米 顆粒溶液中，充分攪拌反應20min，再加入2.5mL正硅酸四乙酯，4°C避光條件下反應4h; 6000r/min離心10min，得到表面硅化的熒光納米顆粒，用乙醇洗滌4次，分散在甲醇中，配制 成濃度為10mg/mL的熒光納米顆粒甲醇溶液；
[0033] (3)熒光納米顆粒的表面氨基化：
[0034] 取3mL焚光納米顆粒甲醇溶液，加入5mL的丙酮，密封后磁力攪拌20min，再用超聲 波均勻分散，加入3yL的APTSA，密封后在40 °C反應30min，再在70 °C水浴反應lh，6000r/min 離心5min，得到表面氨基化的熒光納米顆粒，用乙醇反復洗滌4次，真空干燥后，4°C密封保 存；
[0035] (4)Τ_2抗體的標記：
[0036]用0.01mol/L、pH7.4的PBS緩沖溶液將表面氨基化的熒光納米顆粒溶解，配制成濃 度為10mg/mL的表面氨基化的熒光納米顆粒溶液;取10mL表面氨基化的熒光納米顆粒溶液 與5.6mg NHS和15mg EDC混合，室溫避光反應3h，6000r/min離心5min，取上清液；將lmg/mL 的T-2單克隆抗體或者多克隆抗體加入上清液中，T-2單克隆抗體或者多克隆抗體和上清液 的體積比為1:100,4°C避光反應4h，離心，雙蒸水洗滌后分散在PBS緩沖溶液中，4°C條件下 透析3d，離心，收集沉淀，得到NaYF4: Yb，Tm納米顆粒標記的T-2單克隆抗體或多克隆抗體， 置于PBS緩沖溶液中，4°C保存。
[0037] 所述的NaGd(W〇4)2:Eu3+納米顆粒是以氧化釓(Gd203)、鎢酸鈉(Na 2W〇4 · 2H20)為基 質，銪離子(Eu3+)為敏化劑，在條件反應下形成100~200nm的納米顆粒。
[0038] 所述的NaGd(W〇4)2:Eu3+納米顆粒標記的T-2單克隆抗體或者多克隆抗體的制備方 法，包括以下步驟：
[0039] (1)采用水熱合成法制備NaGd(W〇4)2 :Eu3+納米顆粒
[0040] 稱取7g Gd2〇3和7g Eu2〇3,分別加入至50mL的HN〇3中，加熱至80°C，保溫濃縮至全部 結晶，制得Gd(N03)3和Eu(N03)3;將Na 2W〇4 · 2H20溶于去離子水中，配制成濃度為0.2mol/L的 Na2W〇4溶液；將制得的Gd (N〇3) 3和Eu (N〇3) 3用去離子水溶解，分別制備質量分數為80 %的Gd (N〇3)3溶液和質量分數為15 %的Eu(N〇3)3溶液，吸取配制的5mL Gd(N〇3)3溶液、1 OmL Na2W〇4 溶液和5mL Eu(N03)3溶液，加入到反應爸中，用稀硝酸、氫氧化鈉調節pH=5，攪拌均勻，封閉 反應釜，200°C恒溫加熱24h后，自然降至室溫;將反應釜中溶液倒出靜置，待溶液中粉體沉 淀后，去除上清液，用蒸餾水洗滌粉體3次，每次靜置3h;將洗好的粉體加熱至80 °C干燥12h， 得到NaGd(W〇4)2 :Eu3+納米顆粒；
[0041 ] (2)T-2抗體的標記
[0042] 將Τ-2單克隆抗體或多克隆抗體溶液10000r/min離心30min，除去雜質；用去離子 水溶解NaGd(W〇4)2:Eu3+納米顆粒，配制成濃度為0. lmg/mL的NaGd(W〇4)2:Eu3+納米顆粒溶液， 然后用〇.lmol/L K2C03溶液調節NaGd(W〇4)2:Eu3+納米顆粒溶液至pH 8.2;
[0043] 取10mL NaGd(W〇4)2:Eu3+納米顆粒溶液，在攪拌狀態下，加入T-2單克隆抗體或多 克隆抗體溶液1〇〇μ1，T-2單克隆抗體或多克隆抗體溶液濃度lmg/mL，混勻，室溫溫育30min， 4°C、10000r/min離心30min，棄上清，將沉淀用0.02mol/L Na2B4〇7溶液稀釋至 10mL，10000r/ min離心30min，沉淀用0.02mol/L Na2B4〇7溶液稀釋至lmL，4°C保存備用。
[0044] 所述的吸附纖維層由玻璃纖維棉、尼龍膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜制成。
[0045] 所述的吸水材料層由吸水濾紙制成。
[0046] 所述的纖維素膜層由硝酸纖維素膜、純纖維素膜或羧化纖維素膜制成。
[0047] 所述的偶聯T-2的載體蛋白為牛血清白蛋白、雞卵清蛋白或血藍蛋白。
[0048] 所述隱形檢測印跡和隱形對照印跡還可以為"十十"字型排列印跡、"π"字型排 列印跡、字型排列印跡、"卜卜"字型排列印跡或十'字型排列印跡。
[0049] 所述的面層覆蓋在吸附纖維層、熒光抗體纖維層及吸水材料層上，在吸附纖維層 與熒光抗體纖維層交界處對應的面層上印制有樣品標記線，該樣品標記線偏向吸附纖維層 一偵[JO · 3 ~Ο · 7cm。
[0050] 本發明的試紙條具有特異性強、靈敏度高、穩定性高、安全性好、簡便、快速、結果 顯示形象、直觀、適用范圍廣、攜帶方便的特點。在便攜式熒光讀數儀下可實現現場定量檢 測。能滿足不同層次人員的需要，包括專業化驗、海關檢疫、衛生檢疫、質量監測、畜產品加 工、養殖戶以及消費者個人等。本發明在保障食品安全、保護消費者健康方面具有極其重要 的意義，將具有明顯的經濟效益和社會效益。
【附圖說明】
[0051] 圖1為實施例4的試紙的主視圖，圖中，2為吸附纖維層，3為熒光抗體纖維層，4為纖 維素膜層，7為吸水材料層，14為面層，15為底層。
[0052] 圖2為實施例4的試紙的俯視圖，圖中，4為纖維素膜層，5為隱形檢測印跡，6為隱形 對照印跡，14為面層，15為底層，16為樣品標記線。
[0053] 圖3為實施例5的試紙的主視圖，圖中，1為中空管體，2為吸附纖維層，3為熒光抗體 纖維層，4為纖維素膜層，5為隱形檢測印跡，6為隱形對照印跡，7為吸水材料層，8為連接頭， 9為連接頭的內腔，10為密封圈，11為單向出氣裝置，12為氣囊，13為連接套。
[0054] 圖4為圖3的A-A向剖視圖，圖中，1為中空管體，4為纖維素膜層，6為隱形對照印跡。
[0055] 圖5為圖3中的連接頭的主視圖，圖中，1為中空管體，8為連接頭。
[0056] 圖6為圖3中的連接頭的俯視圖，圖中，8為連接頭，9為連接頭的內腔。
[0057] 圖7為圖3中的連接套的剖視圖，圖中，10為密封圈，12為氣囊，13為連接套，111為 換氣腔，112為第二出氣口，113為密封球，114為第一出氣口，115為出氣通道，131為盲孔， 132為進氣通道。
【具體實施方式】
[0058] 以下結合實施例對本發明的【具體實施方式】作進一步詳細說明。
[0059] 實施例1
[0060]檢測T-2毒素的熒光免疫層析試紙的制備，主要包括:T-2人工抗原的制備、T-2單 克隆抗體或多克隆抗體的制備、氧化石墨烯熒光納米材料標記T-2抗體的制備、纖維素膜層 的制備以及免疫層析試紙的組裝等步驟。
[0061] 1、偶聯T_2載體蛋白的制備
[0062] 將T-2與載體蛋白進行偶聯，制備人工合成抗原。
[0063] (1)Τ-2毒素中間產物的制備:稱取10mg T-2毒素溶解于5mL吡啶中，加入200mg琥 珀酸酐，蒸氣浴下回流反應3_4h，室溫下磁力攪拌過夜，旋轉蒸發儀將溶劑旋干，加入4mL去 離子水，用4mL氯仿萃取4次，合并有機相，然后再將其旋轉蒸干，得到的固態物質即是T-2HS 中間產物，用lmL的二甲基甲酰胺將產物溶解備用。
[0064] (2)人工抗原的合成
[0065] 采用碳二亞胺(EDC)法合成人工抗原，方法如下:取0.5mL步驟（1)產物的二甲基甲 酰胺溶液記為A液;稱取10mg BSA、4mg EDC加入到3mL超純水中溶解，記為B液;在攪拌的情 況下將A液逐滴加入到B液中，4°C避光條件下磁力攪拌18h，反應產物在PBS溶液中透析72h， 期間換液9次。將透析液4000r/min離心1 Omin，棄沉淀，將上清分裝于小管中，20 °C冰箱冷凍 保存備用。
[0066] 2、抗T-2抗體的制備
[0067] (1)單克隆抗體的制備
[0068]動物免疫：用制備的T-2載體蛋白偶聯物以30yg~50yg/只的用量免疫6~8周齡 Balb/C小鼠3~4次，每次免疫間隔時間3~5周，確定抗體效價符合要求后進行超強免疫，并 在融合之前檢測其抑制價。
[0069] 細胞融合:超強免疫后3~4天，將免疫小鼠眶下竇采血，分離陽性血清;脫頸致死， 用75%的酒精浸泡小鼠5~lOmin消毒體表，無菌取其脾臟，將脾臟剪碎并研磨，經120目尼 龍紗布過濾，l〇〇〇r/min離心10min，收集脾細胞。將1 X 108的脾細胞與NSo骨髓瘤細胞按10:1 的比例混合，l〇〇〇r/min離心10min棄上清，將細胞沉淀物于37°C水浴中緩緩加入0.7~ 1 · OmL的50%PEG4000，lmin內加完，前30s加0 · 1 ~0 · 3mL，中間 15s加0 · 2~0 · 4mL，最后 15s加 完;然后緩緩加入無血清1640培養基15mL，以終止PEG的作用，37°C水浴5~10min，1000r/ min離心10min棄上清，將細胞沉淀物重懸于HAT選擇培養基中，并加入96孔細胞培養板中（8 ~10塊），100yL~200yL/孔，置于37°C、5%的C0 2培養箱中培養。
[0070] 單克隆抗體的篩選:培養10~14天，用間接ELI SA法進行陽性孔篩選，選擇強陽性、 抑制率高、細胞生長旺盛的孔進行3~6次有限稀釋克隆化(直到細胞克隆為單克隆，檢測各 個克隆孔效價、抑制價基本一致），而后擴大培養，建立雜交瘤細胞株。所制備的雜交瘤細胞 分泌的單克隆抗體可特異地與T-2反應，親和力常數達到10 1()~1012,輕鏈亞型為κ或λ，重鏈 亞型為]^61、]^623、]^621 )、]^63，針對1'-2特異抗原決定簇的單克隆抗體，用于制備氧化石墨 烯熒光納米材料標記抗體的玻璃纖維棉。
[0071] (2)多克隆抗體的制備
[0072]用Τ-2載體蛋白偶聯物免疫新西蘭白兔，免疫劑量為200yg~500yg/次，背部皮下 分4~6點注射。首免，用無菌PBS溶解制備的T-2載體蛋白偶聯物，與等量弗氏完全佐劑 (FCA)混合，充分乳化;加強免疫，用無菌PBS溶解T-2載體蛋白偶聯物，與等量弗氏不完全佐 劑(FIA)混合，充分乳化，首免后2~3周進行，連續免疫4~5次，每次間隔2~3周，最后一次 免疫后10~15天，以ELISA法測其定效價達到10 5以上時，采血并分離收集高免血清。
[0073]以飽和硫酸銨鹽析法提取IgG抗體，即取1份高免血清加2份PBS(pH7.2)混勻，加等 體積飽和硫酸銨溶液混勻，置4°C冰箱12h，4°C、2500r/min離心15min，棄上清，再以適量PBS (ρΗ7·2)溶解沉淀，加飽和硫酸銨溶液至終濃度33%，置4°C冰箱2h，4°C、2500r/min離心 15min，棄上清，以適量PBS (pH7.2)溶解沉淀，置4 °C冰箱內用PBS (pH7.2)透析48~72h，中間 換液數次，4°C、12000r/min離心15min，收集上清，得純化的抗T-2多克隆抗體，-20°C凍存， 用于制備氧化石墨稀焚光納米材料標記抗體玻璃纖維棉。
[0074] 3、氧化石墨烯熒光納米材料標記的T-2單克隆抗體或者多克隆抗體的制備
[0075] (1)氧化石墨烯熒光材料修飾：
[0076] 取20mg氧化石墨磨碎，加入到5mL二甲基甲酰胺(DMF)中，超聲混勾后，加入20mL二 氯亞砜，80°C下加熱回流48h后離心，得到中間體酰氯化氧化石墨烯，用四氫呋喃洗滌兩次 后，干燥;再在抽真空氮氣保護的條件下，將酰氯化氧化石墨烯和lmL正丁胺混合，60°C反應 72h，冷卻至室溫，得到烷基胺修飾的氧化石墨稀，分散于20mL雙蒸水中，8000r/min離心，除 去未反應的正丁胺，將剩余的反應液通過旋轉蒸發儀蒸干，蒸干后的干物質重新分散在雙 蒸水中，配制成濃度為lmg/mL的修飾的氧化石墨烯熒光材料水溶液；
[0077] (2)表面標記T-2抗體銀納米顆粒溶液的制備：
[0078] (a)將100mg硝酸銀溶解于250mL超純水中，加熱沸騰，加入10mL質量分數1%的檸 檬酸鈉溶液，80°C加熱回流lh后攪拌0.5h，4°C條件下過夜;取lmL過夜后的溶液，加入ImM的 巰基乙酸l〇yL，攪拌24h后離心，除去未反應的巰基乙酸，超純水洗滌3次，用旋轉蒸發儀蒸 干，加超純水配制成濃度為lmg/mL疏基乙酸包覆的銀納米顆粒溶液；
[0079] (b)取 O.lmM 的 1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺(EDC)lOyL 和 O.lmM 的 NHSlOy L，逐步加入到lmL巰基乙酸包覆的銀納米顆粒溶液中，反應lh，得到羧基活化的銀納米顆粒 溶液；
[0080] (C)取0.1 mM的T-2單克隆抗體或多克隆抗體20yL，加入到羧基活化的銀納米顆粒 溶液中，4 °C反應過夜，得到表面標記T-2抗體銀納米顆粒溶液；
[0081 ] (3)氧化石墨烯熒光納米材料T-2抗體的標記：
[0082]取修飾的氧化石墨烯熒光材料水溶液5mL，加入2mL戊二醛，室溫反應3h，離心，除 去未反應的戊二醛，將剩余的反應液分散在0.01mol/L、pH7.4的PBS緩沖溶液中，加入表面 標記T-2抗體銀納米顆粒溶液，4°C反應3h，經離心，收集氧化石墨烯熒光納米材料標記的T-2單克隆抗體或者多克隆抗體，0.01mol/L、pH7.4的PBS緩沖液洗滌，保存備用。
[0083] 4、熒光抗體纖維層的制備
[0084]將1:100~1:500稀釋的氧化石墨烯熒光納米材料標記的T-2抗體吸附于精制玻璃 纖維棉中，4°C低溫真空干燥，制備氧化石墨烯熒光納米材料標記抗體的玻璃纖維棉。
[0085] 5、吸附纖維素膜層的制備：
[0086]纖維素膜層由硝酸纖維素制成，用點樣儀在纖維素膜層的不同位置分別噴點T-2 人工抗原檢測印跡和兔抗鼠IgG抗體(或羊抗鼠IgG抗體、羊抗兔IgG抗體)對照印跡，于37°C 烘干備用。
[0087] 6、免疫層析試紙的組裝
[0088]將吸附纖維層、熒光抗體纖維層、纖維素膜層、吸水材料層從測試端開始依次貼在 帶有粘合劑的底層上，再在覆蓋上面層，并切成3-4cm寬的試紙即可。
[0089] 7、檢測反應原理
[0090] 當試紙測試端插入待測樣品溶液后，在虹吸作用帶動下，待測溶液中T-2和熒光抗 體纖維層中的熒光抗體一起向纖維素膜層擴散，直至到吸水材料層。
[0091] 在擴散過程中，待測T-2可與吸附在氧化石墨烯上的T-2抗體-銀納米顆粒相結合， 因抗原-抗體作用和靜電吸引作用，導致T-2抗體-銀納米顆粒從氧化石墨烯上剝離出來，進 而釋放氧化石墨烯所散發的熒光，并和偶聯T-2的載體蛋白結合。而羊抗鼠抗體則能與T-2 抗原結合，在350nm紫外線激發下隱形檢測印跡線(T線）和隱形對照印跡線（C線）都會出現 吸收峰，通過熒光讀條儀讀取T線峰值定量檢測待測樣品中T-2中的含量。反之，樣品中無T-2時，則T線和C線不會出現紫外吸收峰。
[0092] 實施例2
[0093]實施例2中免疫層析試紙的制備和實施例1基本相同，主要不同之處在于：熒光抗 體為NaYF4: Yb，Tm納米顆粒標記的T-2單克隆抗體或者多克隆抗體。
[0094]所述的NaYF4: Yb，Tm納米顆粒標記的T-2單克隆抗體或者多克隆抗體的制備方法， 包括以下步驟：
[0095] (1)采用水熱合成法制備NaYF4: Yb，Tm納米顆粒：
[0096] 分別取濃度均為 0.5mol/L 的 Y(N03)3 溶液 5.5mL、Yb(N03)3 溶液 0.5mL 和 Tm(N03)3 溶 液0.5mL，混合均勻，再加入0.4mol/L的檸檬酸鈉溶液2mL，25 °C條件下避光充分反應lh;加 入1.5mo 1/L NH4F溶液7mL，25 °C條件下避光攪拌0.5h，用HN〇3調節pH值至7.4，靜置0.5h，加 雙蒸水稀釋至30mL;再在220 °C下反應24h，冷卻到室溫，經過濾、雙蒸水洗滌、干燥，得到發 藍色光的NaYF4: Yb，Tm熒光納米顆粒；
[0097] (2)熒光納米顆粒的表面硅化：
[0098] 將NaYF4: Yb，Tm熒光納米顆粒加入0.01mol/L、pH7.4的roS緩沖液中，配制成濃度 為lmg/mL的NaYF4: Yb，Tm熒光納米顆粒溶液，再將5mL濃氨水滴入5mL NaYF4: Yb，Tm熒光納米 顆粒溶液中，充分攪拌反應20min，再加入2.5mL正硅酸四乙酯，4°C避光條件下反應4h; 6000r/min離心10min，得到表面硅化的熒光納米顆粒，用乙醇洗滌4次，分散在甲醇中，配制 成濃度為10mg/mL的熒光納米顆粒甲醇溶液；
[0099] (3)熒光納米顆粒的表面氨基化：
[0?00] 取3mL焚光納米顆粒甲醇溶液，加入5mL的丙酮，密封后磁力攪拌20min，再用超聲 波均勻分散，加入3yL的N-(2-氨乙基)-3-氨丙基三甲氧基硅烷(APTSA)，密封后在40°C反應 30min，再在70°C水浴反應lh，6000r/min離心5min，得到表面氨基化的焚光納米顆粒，用乙 醇反復洗滌4次，真空干燥后，4 °C密封保存；
[0101] (4)T-2抗體的標記：
[0102]用0.01mol/L、pH7.4的PBS緩沖溶液將表面氨基化的熒光納米顆粒溶解，配制成濃 度為10mg/mL的表面氨基化的熒光納米顆粒溶液;取10mL表面氨基化的熒光納米顆粒溶液 與5.6mg NHS和15mg EDC混合，室溫避光反應3h，6000r/min離心5min，取上清液；將lmg/mL 的T-2單克隆抗體或者多克隆抗體加入上清液中，T-2單克隆抗體或者多克隆抗體和上清液 的體積比為1:100,4°C避光反應4h，離心，雙蒸水洗滌后分散在PBS緩沖溶液中，4°C條件下 透析3d，離心，收集沉淀，得到NaYF4: Yb，Tm納米顆粒標記的T-2單克隆抗體或多克隆抗體， 置于PBS緩沖溶液中，4°C保存。
[0103] 檢測反應原理
[0104] 當試紙測試端插入待測樣品溶液后，在虹吸作用帶動下，待測溶液中T-2和熒光抗 體纖維層中的熒光抗體一起向纖維素膜層擴散，直至到吸水材料層。
[0105] 在擴散過程中，待測T-2可與熒光抗體相結合，進而封閉熒光抗體上T-2的抗原結 合點，阻止熒光抗體與纖維素膜上的T-2人工抗原的檢測印跡結合，不能顯示檢測印跡，而 羊或兔抗小鼠IgG(或羊抗兔IgG)抗體則可與熒光抗體結合，在紅外線激發下通過熒光讀條 儀T線處就不會出現吸收峰，C線處會出現吸收峰。反之樣品溶液中無T-2時，則不能阻止熒 光抗體與纖維素膜上偶聯T-2載體蛋白的檢測印跡結合，通過熒光讀條儀T線處就會出現吸 收峰，同樣羊抗或兔抗小鼠IgG(或羊抗兔IgG)抗體也能與熒光標記抗體結合，通過熒光讀 條儀C線處也會出現吸收峰。如果纖維素膜上沒有T線和C線吸收峰，則表明試紙條已失效。
[0106] 實施例3
[0107] 實施例3中免疫層析試紙的制備和實施例1基本相同，主要不同之處在于：熒光抗 體為他6(1(￥〇4)2 4113+納米顆粒標記的1'-2單克隆抗體或多克隆抗體。
[0108] 所述的似6(1(￥〇4)2 4113+納米顆粒標記的1'-2單克隆抗體或者多克隆抗體的制備方 法，包括以下步驟：
[0109] (1)采用水熱合成法制備NaGd(W〇4)2 :Eu3+納米顆粒
[0110] 稱取7g Gd2〇3和7g Eu2〇3,分別加入至50mL的HN〇3中，加熱至80°C，保溫濃縮至全部 結晶，制得Gd(N03)3和Eu(N03)3;將Na 2W〇4 · 2H20溶于去離子水中，配制成濃度為0.2mol/L的 Na2W〇4溶液；將制得的Gd (N〇3) 3和Eu (N〇3) 3用去離子水溶解，分別制備質量分數為80 %的Gd (N〇3)3溶液和質量分數為15 %的Eu(N〇3)3溶液，吸取配制的5mL Gd(N〇3)3溶液、1 OmL Na2W〇4 溶液和5mL Eu(N03)3溶液，加入到反應爸中，用稀硝酸、氫氧化鈉調節pH=5，攪拌均勻，封閉 反應釜，200°C恒溫加熱24h后，自然降至室溫;將反應釜中溶液倒出靜置，待溶液中粉體沉 淀后，去除上清液，用蒸餾水洗滌粉體3次，每次靜置3h;將洗好的粉體加熱至80 °C干燥12h， 得到NaGd(W〇4)2 :Eu3+納米顆粒；
[0111] (2)T-2抗體的標記
[0112] 將Τ-2單克隆抗體或多克隆抗體溶液10000r/min離心30min，除去雜質；用去離子 水溶解NaGd(W〇4)2:Eu3+納米顆粒，配制成濃度為0. lmg/mL的NaGd(W〇4)2:Eu3+納米顆粒溶液， 然后用〇.lmol/L K2C03溶液調節NaGd(W〇4)2:Eu3+納米顆粒溶液至pH 8.2;
[0113] 取10mL NaGd(W〇4)2:Eu3+納米顆粒溶液，在攪拌狀態下，加入T-2單克隆抗體或多 克隆抗體溶液1〇〇μ1，T-2單克隆抗體或多克隆抗體溶液濃度lmg/mL，混勻，室溫溫育30min， 4°C、10000r/min離心30min，棄上清，將沉淀用0.02mol/L Na2B4〇7溶液稀釋至 10mL，10000r/ min離心30min，沉淀用0.02mol/L Na2B4〇7溶液稀釋至lmL，4°C保存備用。
[0114] 檢測反應原理
[0115] 當試紙測試端插入待測樣品溶液后，待測溶液通過虹吸作用帶動待測T-2及熒光 納米顆粒標記抗體玻璃纖維棉中的下轉換焚光納米顆粒NaGd (W〇4) 2: Eu3+標記抗體一起向 纖維素膜層擴散，并最終滲入手柄端的吸水材料層。在擴散過程中，待測T-2可與熒光納米 顆粒標記抗體纖維層中的下轉換熒光納米顆粒標記抗體相結合，進而封閉下轉換熒光納米 顆粒標記抗體上T-2的抗原結合點，阻止下轉換熒光納米顆粒標記抗體與纖維素膜上偶聯 T-2載體蛋白的檢測印跡結合，試紙上無法顯示檢測印跡，而羊或兔抗小鼠IgG(或羊抗兔 IgG)抗體則可與下轉換熒光納米顆粒標記抗體結合，在紅外線激發下通過熒光讀條儀T線 處就不會出現吸收峰，C線處會出現吸收峰。反之樣品溶液中若無T-2,則不能阻止下轉換熒 光納米顆粒標記抗體與纖維素膜上偶聯T-2載體蛋白的檢測印跡結合，通過熒光讀條儀T線 處就會出現吸收峰，同樣羊抗或兔抗小鼠IgG(或羊抗兔IgG)抗體也能與下轉換熒光納米顆 粒標記抗體結合，通過熒光讀條儀C線處也會出現吸收峰。如果纖維素膜上沒有T線和C線吸 收峰，則表明試紙條已失效。
[0116]以下結合其他實施例具體說明免疫層析試紙的結構和檢測方法
[0117] 實施例4
[0118] 本實施例的檢測T-2毒素的熒光免疫層析試紙，參照圖1-2,包括支撐體和固定在 支撐體上的吸附層，吸附層從測試端開始依次為吸附纖維層2、熒光抗體纖維層3、纖維素膜 層4及吸水材料層7,所述的纖維素膜層上設有用偶聯T-2的載體蛋白溶液印制的隱形檢測 印跡5和用羊抗小鼠IgG、兔抗小鼠IgG或羊抗兔IgG抗體溶液印制的隱形對照印跡6;所述的 熒光抗體纖維層采用吸附熒光抗體的玻璃纖維棉制成，熒光抗體為氧化石墨烯熒光納米材 料標記的T-2單克隆抗體或者多克隆抗體。
[0119] 所述的支撐體包括設置在吸附層底面的底層15和設置在吸附層頂面的面層14。
[0120] 所述的面層覆蓋在吸附纖維層、熒光抗體纖維層及吸水材料層上，在吸附纖維層 與熒光抗體纖維層交界處對應的面層上印制有樣品標記線16,該樣品標記線偏向吸附纖維 層一側0 · 3 ~0 · 7cm。
[0121] 為了更好的技術效果，所述的隱形檢測印跡5和隱形對照印跡6呈相間設置在纖維 素膜層4的表面，即兩條印跡帶平行排列成"| |"，間距為5~15_。
[0122] 覆蓋在吸附纖維層和熒光抗體纖維層上面的面層為白色，覆蓋在吸水材料層上面 的面層為其它顏色(如黃色），測試樣品標記線位于吸附纖維層與熒光抗體纖維層交界處對 應的白色面層偏向吸附纖維層一側約0.5cm處，在標記線右側面層上印有箭頭及max字樣。 [0123] (1)待測樣品的制備及檢測步驟：
[0124] 檢測肉樣:將樣品剪碎、細磨，用生理鹽水稀釋制成l:10(m/v)的樣品懸液。
[0125] 操作方法:將T-2試紙測試端插入待測樣品中，插入深度不超過標記線，約10~20 秒鐘取出試紙，5min后放入熒光讀條儀直接讀值。
[0126] 結果判定：
[0127] (a)陽性判定:通過熒光讀條儀T線和C線處都出現吸收峰，表示檢測結果為陽性， 說明在待測樣品中含有T-2毒素；
[0128] (b)陰性判定：通過熒光讀條儀T線和C線處都不出現吸收峰，表示檢測結果為陰 性，說明在待測樣品中不含T-2毒素；
[0129] (c)失效判定:通過熒光讀條儀T線不出現吸收峰，C線處出現吸收峰，或T線處出現 吸收峰，C線處不出現吸收峰，則表明試紙已失效。
[0130] (2)本實施例免疫層析試紙的靈敏性、特異性檢測
[0131]靈敏性的檢測：用磷酸鹽緩沖液PBS(pH 7.4)或雙蒸水分別配制濃度為1、2、4、5、 10、20、301^/1^的1'-2標準品，在本實施例的免疫層析試紙上上樣80~10(^1^，反應51^11后， 通過讀條儀讀取T線掃描面積光密度的相對光密度值(relative optical density，R0D)。 以不同濃度標準品與空白標準品相對光密度值的百分率為縱坐標，以不同標準品濃度的常 用對數值為橫坐標，繪制標準曲線，進行相關回歸分析，計算該試紙對T-2的IC 5Q和最低檢測 限。經測定，該試紙T-2對的曲線回歸方程為:y = -0.610x+l. 023，相關系數為R2 = 0.990，根 據回歸方程計算出該試紙對T-2的IC5Q為7.2ng/mL，當ROD X pixe 1 % = 90 %時，曲線方程對 應的T-2濃度為1.59ng/mL，即機讀靈敏度，考慮到實際檢測工作的需要和用戶操作方面的 誤差，其機讀檢測限確定為2ng/mL。目測敏感度為8ng/mL，表明免疫層析試紙對T-2具有較 高的靈敏度。
[0132] 特異性的檢測：以其他真菌毒素作為競爭物，配制上述標準品不同濃度，用免疫層 析試紙檢測其抑制率，以該試紙對T-2的與IC 5Q各競爭物IC5Q的百分比作為其交叉反應率。 測定結果見表1。由表1可看出，該免疫層析試紙的特異性較好，與其他真菌毒素均無交叉反 應。
[0133] 表1免疫層析試紙與其他真菌毒素的交叉反應

[0135] 本實施例的試紙條具有以下優點：
[0136] (1)特異性強，靈敏度高。本實施例的試紙條以氧化石墨烯熒光納米材料標記的T-2抗體為基礎制成，由于經修飾過的氧化石墨烯熒光材料具有非凡光學特性和良好的生物 相容性，同時氧化石墨烯電子傳遞效率高，使得這種新型免疫方法靈敏度高，檢測極限低， 最低僅為2ng/mL。
[0137] (2)穩定性高，安全性好。本實施例的試紙條氧化石墨烯熒光納米材料標記的T-2 抗體為基礎制成，納米銀顆粒表面與蛋白質帶有相反的電荷基團，因靜電吸附而牢固結合； 石墨烯比表面積大，能與多種蛋白質生物分子通過化學反應結合，而對其生物活性影響很 小，穩定性高，靈活性好。
[0138] (3)本實施例的氧化石墨烯熒光免疫層析試紙可對玉米、DDGS、飼料等進行檢測。 通過銀納米和氧化石墨烯共同作用，檢測信號增強，降低抗體用量，節省抗體成本。
[0139] 實施例5
[0140] 本實施例的檢測T-2毒素的熒光免疫層析試紙，參照圖3-7,包括支撐體和固定在 支撐體上的吸附層，所述的支撐體包括透明的中空管體1，吸附層填充在中空管體內部，吸 附層從測試端開始依次為吸附纖維層、熒光抗體纖維層、纖維素膜層及吸水材料層，所述的 纖維素膜層上設有用偶聯T-2的載體蛋白溶液印制的隱形檢測印跡5和用羊抗小鼠IgG、兔 抗小鼠IgG或羊抗兔IgG抗體溶液印制的隱形對照印跡6;所述的熒光抗體纖維層采用吸附 熒光抗體的玻璃纖維棉制成，熒光抗體為NaYF4:Yb，Tm納米顆粒標記的T-2單克隆抗體或者 多克隆抗體。
[0141]所述的中空管體1的上端裝有連接頭8,連接頭8上端設置有輔助吸附裝置，所述的 輔助吸附裝置包括與所述連接頭呈密封連接的連接套13和設置在所述連接套上部的氣囊 12,氣囊12的出氣口依次經連接套13上部的進氣通道132、連接頭8的內腔9與中空管體1的 上口部相連通，進氣通道所在的連接套側壁上設置有只能向外排氣無法向內吸氣的單向出 氣裝置11。
[0142] 所述的單向出氣裝置包括設置在進氣通道所在的連接套側壁的換氣腔111，換氣 腔111內設置有圓球形的密封球113，換氣腔111的底面上開有與密封球相對應的第一出氣 口 114,第一出氣口經出氣通道115與進氣通道132相連通，換氣腔111側面設置有與外界大 氣相連通的第二出氣口 112，構成只能向外排氣、無法向進氣通道吸氣的單向出氣結構。
[0143] 為了更好的技術效果，所述的第一出氣口 114為圓形，其直徑小于密封球的直徑。 這樣的設置能夠使第一出氣口與圓球形的密封球更加緊密的結合，保證空間的密封性。
[0144] 所述的連接頭8為上下開口的中空結構，其下端與中空管體1的上端呈密封連接， 連接頭上部的外壁上設置有外螺紋，連接套13的下部設置有與連接頭相對應得盲孔131，盲 孔131內壁上設置有與外螺紋相對應的內螺紋，連接頭通過外螺紋和內螺紋旋裝在連接套 下部的盲孔131內，連接頭的頂部與盲孔頂部之間在連接套上設置有防止漏氣的密封圈10。
[0145] 所述的隱形檢測印跡5和隱形對照印跡6呈相間設置在纖維素膜層4的表面，間距 為5~15mm〇
[0146] 所述的中空管體1的內腔為長方形。
[0147] 測試樣品標記線位于吸附纖維層與熒光抗體纖維層交界處對應的透明中空管體 上偏向吸附纖維層一側約〇.5cm處，在標記線右側的透明中空管體上印有箭頭及max字樣。
[0148] 使用時，將連接套和連接頭通過內外螺紋連接在一起，輕輕擠壓氣囊，氣囊中的氣 體通過進氣通道、連接頭的內腔和連接套側壁的換氣腔向外排出，此時換氣腔內的圓球形 密封球被從氣囊中擠壓出的氣體抬起，氣囊中的氣體通過第一出氣口順利向外排出；將試 紙插入待測樣品溶液中，然后松開氣囊，此時，中空管體的內腔、連接頭的內腔和進氣通道 內產生負壓，在負壓的吸引下，密封球緊緊吸附在換氣腔的底面上的第一出氣口上，將其封 閉，從而幫助樣品溶液更加快速的浸潤試紙，從而減少樣品溶液浸潤試紙條的時間，提高檢 測效率。
[0149] 由上述情況可以清楚的看出，本實施例結構新穎獨特，簡單合理，通過將支撐體整 體修改為密閉結構，同時在支撐體的頂部增加氣囊，使吸收更加迅速，從而有效提高檢測的 速度和準確度，同時氣囊部分和支撐體部分為密封拆裝式連接，檢測完畢后只需更換支撐 體部分即可，拆裝方便，易操作，使用效果好，是檢測試紙上的創新。
[0150] (1)待測樣品的制備及檢測步驟：
[0151] 檢測奶樣:將樣品用無水乙醇稀釋制成l:10(V/v)的樣品懸液。
[0152] 操作方法:擠壓氣囊，將氣囊內的氣體排出，將T-2試紙測試端插入待測樣品中，插 入深度不超過標記線，松開氣囊，約3-5秒鐘取出試紙，4min后放入熒光讀條儀直接讀值。
[0153] 結果判定：
[0154] (a)陽性判定:通過熒光讀條儀T線處不出現吸收峰，C線處出現吸收峰，表示檢測 結果為陽性，說明在待測樣品中含有T-2毒素；
[0155] (b)陰性判定:通過熒光讀條儀T線和C線處都出現吸收峰，表示檢測結果為陰性， 說明在待測樣品中不含T-2毒素；
[0156] (c)失效判定:通過熒光讀條儀T線和C線處都不出現吸收峰，則表明試紙已失效。
[0157] (2)本實施例免疫層析試紙的靈敏性、特異性檢測
[0158] 靈敏性的檢測：用磷酸鹽緩沖液roS(pH 7.4)或雙蒸水分別配制濃度為1、2、4、5、 10、20、301^/1^的1'-2標準品，在本實施例的免疫層析試紙上上樣80~10(^1^，反應41^11后， 通過讀條儀讀取T線掃描面積光密度的相對光密度值(relative optical density，R0D)。 以不同濃度標準品與空白標準品相對光密度值的百分率為縱坐標，以不同標準品濃度的常 用對數值為橫坐標，繪制標準曲線，進行相關回歸分析，計算該試紙對T-2的IC 5Q和最低檢測 限。經測定，該試紙T-2對的曲線回歸方程為:y = -0.539x+0.901，相關系數為R2 = 0.993，根 據回歸方程計算出該試紙對T-2的IC5Q為5.55ng/mL，當ROD X pixel % = 90 %時，曲線方程對 應的T-2濃度為Ing/mL，即機讀靈敏度，考慮到實際檢測工作的需要和用戶操作方面的誤 差，其機讀檢測限確定為1.5ng/mL。目測敏感度為6ng/mL，表明免疫層析試紙對T-2具有較 高的靈敏度。
[0159] 特異性的檢測：以其他真菌毒素作為競爭物，配制上述標準品不同濃度，用免疫層 析試紙檢測其抑制率，以該試紙對T-2的與IC5Q各競爭物IC5Q的百分比作為其交叉反應率。 測定結果見表2。由表2可看出，該免疫層析試紙的特異性較好，與其他真菌毒素均無交叉反 應。
[0160]表2免疫層析試紙與其他真菌毒素的交叉反應
[0163] 本實施例的試紙條具有以下優點：
[0164] (1)特異性強，靈敏度高。本實施例上轉換熒光免疫層析試紙以發藍色光譜的上轉 換熒光納米材料NaYF 4: Yb，Tm標記的T-2抗體為基礎制成，由于NaYF4: Yb，Tm納米顆粒發光效 率尚，能有效消除樣品檢測背景光，靈敏度大幅提尚，最低僅為到1.5ng/mL。
[0165] (2)穩定性高，安全性好。本實施例的試紙中上轉換熒光納米材料NaYF4: Yb，Tm能 有效發射藍色光譜，完全避免了其他條件引起的發光淬滅。NaYF4:Yb，Tm材料具有無機惰 性、紅外光激發、可見光發射的特點，使用該試紙進行檢測對于周圍人員與環境無任何危 害。
[0166] (3)簡便、快速。利用熒光讀條儀，該試紙可直接讀值，實現現場快速定量檢測。只 要將試紙插入被檢樣品3~5秒鐘，4分鐘后即可讀取結果，在T線處無吸收峰表示被檢樣品 中含有T-2;反之，不含T-2。結果直觀、準確，簡單明了，最大限度的避免了人為誤判。
[0167] (4)本實施例的試紙制備時，焚光抗體采用NaYF4:Yb，Tm納米顆粒標記的T-2單克 隆抗體或多克隆抗體，即將氨基化的NaYF4: Yb，Tm納米顆粒直接與抗體相連，標記過程簡 單，偶聯率高，從而有效提高基于NaYF4: Yb，Tm材料的免疫試紙的靈敏度。
[0168] 實施例6
[0169] 本實施例的檢測T-2毒素的熒光免疫層析試紙的結構同實施例4,不同之處在，本 實施例的熒光抗體為NaGd(W〇4)2:Eu 3+納米顆粒標記的T-2單克隆抗體或者多克隆抗體。
[0170] (1)待測樣品的制備及檢測步驟：
[0171] 檢測尿樣:將樣品用無水乙醇稀釋制成l:10(v/v)的樣品懸液。
[0172] 操作方法:將T-2試紙測試端插入待測樣品中，插入深度不超過標記線，約10~20 秒鐘取出試紙，5min后放入熒光讀條儀直接讀值。
[0173] 結果判定：
[0174] (a)陽性判定:通過熒光讀條儀T線處不出現吸收峰，C線處出現吸收峰，表示檢測 結果為陽性，說明在待測樣品中含有T-2毒素；
[0175] (b)陰性判定:通過熒光讀條儀T線和C線處都出現吸收峰，表示檢測結果為陰性， 說明在待測樣品中不含T-2毒素；
[0176] (c)失效判定:通過熒光讀條儀T線和C線處都不出現吸收峰，則表明試紙已失效。
[0177] (2)本實施例免疫層析試紙的靈敏性、特異性檢測
[0178] 靈敏性的檢測：用磷酸鹽緩沖液roS(pH 7.4)或雙蒸水分別配制濃度為1、2、4、5、 10、20、301^/1^的1'-2標準品，在本實施例的免疫層析試紙上上樣80~10(^1^，反應51^11后， 通過讀條儀讀取T線掃描面積光密度的相對光密度值(relative optical density，R0D)。 以不同濃度標準品與空白標準品相對光密度值的百分率為縱坐標，以不同標準品濃度的常 用對數值為橫坐標，繪制標準曲線，進行相關回歸分析，計算該試紙對T-2的IC 5Q和最低檢測 限。經測定，該試紙T-2對的曲線回歸方程為:y = -0.580x+0.955，相關系數為R2 = 0.992，根 據回歸方程計算出該試紙對T-2的IC5Q為6.09ng/mL，當ROD X pixel % = 90 %時，曲線方程對 應的T-2濃度為1.24ng/mL，即機讀靈敏度，考慮到實際檢測工作的需要和用戶操作方面的 誤差，其機讀檢測限確定為2ng/mL。目測敏感度為7ng/mL，表明免疫層析試紙對T-2具有較 高的靈敏度。
[0179] 特異性的檢測：以其他真菌毒素作為競爭物，配制上述標準品不同濃度，用免疫層 析試紙檢測其抑制率，以該試紙對T-2的與IC 5Q各競爭物IC5Q的百分比作為其交叉反應率。 測定結果見表3。由表3可看出，該免疫層析試紙的特異性較好，與其他真菌毒素均無交叉反 應。
[0180] 表3免疫層析試紙與其他真菌毒素的交叉反應
[0182] 本實施例的試紙條具有以下優點：
[0183] (1)特異性強，靈敏度高。本實施例下轉換熒光納米顆粒標記免疫層析試紙是以氧 化釓(Gd 2〇3)、鎢酸鈉(Na2W〇4 · 2H20)為基質，銪離子(Eu3+)為敏化劑形成的100~200nm納米 顆粒，具有良好的光學特性，使T-2的檢測消除了背景光的干擾，靈明度大大提高，最低可檢 測到 2ng/mL。
[0184] (2)穩定性高。NaGd(W〇4)2:Eu3+納米顆粒屬于完全惰性的無機發光材料，這些性質 使得其具有非常好的光穩定性，在紫外燈的照射下不發生光漂白，使得讀值穩定。
[0185] (3)簡便、快速。使用本實施例試紙可與熒光讀條儀結合使用，直接讀值，實現現場 定量檢測，只需將試紙條插入被檢樣品中10~20秒鐘，取出后5分鐘內即可判定檢測結果。
[0186] (4)結果顯示形象、直觀、準確。本實施例熒光納米顆粒標記免疫層析試紙是以T線 是否出現吸收峰作為檢測陽性和陰性的標準。若T線處無吸收峰則表示被檢樣品中含有T-2,反之則表示被檢樣品中不含T-2。結果直觀、準確，不易出現假陽性和假陰性等人為誤判。
【主權項】
1. 一種檢測T-2毒素的熒光免疫層析試紙，包括支撐體和固定在支撐體上的吸附層，吸 附層從測試端開始依次為吸附纖維層(2)、熒光抗體纖維層(3)、纖維素膜層(4)及吸水材料 層(7)，其特征在于，所述的纖維素膜層上設有用偶聯Τ-2的載體蛋白溶液印制的隱形檢測 印跡(5)和用羊抗小鼠 IgG、兔抗小鼠 IgG或羊抗兔IgG抗體溶液印制的隱形對照印跡(6);所 述的熒光抗體纖維層采用吸附熒光抗體的玻璃纖維棉制成，熒光抗體為氧化石墨烯熒光納 米材料、NaYF4:Yb，Tm納米顆粒或NaGd(W〇4)2:Eu 3+納米顆粒標記的T-2單克隆抗體或者多克 隆抗體。2. 根據權利要求1所述的檢測T-2毒素的熒光免疫層析試紙，其特征在于，所述的支撐 體包括設置在吸附層底面的底層（15)和設置在吸附層頂面的面層（14)。3. 根據權利要求1所述的檢測T-2毒素的熒光免疫層析試紙，其特征在于，所述的支撐 體包括透明的中空管體（1 )，吸附層填充在中空管體內部，吸附層從測試端開始依次為吸附 纖維層、熒光抗體纖維層、纖維素膜層及吸水材料層。4. 根據權利要求3所述的檢測T-2毒素的熒光免疫層析試紙，其特征在于，所述的中空 管體(1)的上端裝有連接頭(8)，連接頭(8)上端設置有輔助吸附裝置，所述的輔助吸附裝置 包括與所述連接頭呈密封連接的連接套（13)和設置在所述連接套上部的氣囊（12)，氣囊 (12)的出氣口依次經連接套（13)上部的進氣通道（132)、連接頭(8)的內腔(9)與中空管體 (1)的上口部相連通，進氣通道所在的連接套側壁上設置有只能向外排氣無法向內吸氣的 單向出氣裝置(11); 所述的單向出氣裝置包括設置在進氣通道所在的連接套側壁的換氣腔（111)，換氣腔 (111)內設置有圓球形的密封球（113)，換氣腔（111)的底面上開有與密封球相對應的第一 出氣口（114)，第一出氣口經出氣通道（115)與進氣通道（132)相連通，換氣腔（111)側面設 置有與外界大氣相連通的第二出氣口（112)，構成只能向外排氣、無法向進氣通道吸氣的單 向出氣結構。5. 根據權利要求4所述的檢測T-2毒素的熒光免疫層析試紙，其特征在于，所述的第一 出氣口（114)為圓形，其直徑小于密封球的直徑。6. 根據權利要求4所述的檢測T-2毒素的熒光免疫層析試紙，其特征在于，所述的連接 頭(8)為上下開口的中空結構，其下端與中空管體（1)的上端呈密封連接，連接頭上部的外 壁上設置有外螺紋，連接套（13)的下部設置有與連接頭相對應的盲孔（131)，盲孔（131)內 壁上設置有與外螺紋相對應的內螺紋，連接頭通過外螺紋和內螺紋旋裝在連接套下部的盲 孔(131)內，連接頭的頂部與盲孔頂部之間在連接套上設置有防止漏氣的密封圈（10)。7. 根據權利要求1所述的檢測T-2毒素的熒光免疫層析試紙，其特征在于，所述的隱形 檢測印跡(5)和隱形對照印跡(6)呈相間設置在纖維素膜層(4)的表面，間距為5-15mm; 所述的中空管體(1)的內腔為長方形。8. 根據權利要求1所述的檢測T-2毒素的熒光免疫層析試紙，其特征在于，所述的氧化 石墨烯熒光納米材料標記的T-2單克隆抗體或者多克隆抗體的制備方法，包括以下步驟： (1)氧化石墨烯熒光材料修飾： 取20mg氧化石墨磨碎，加入到5mL DMF中，超聲混勻后，加入20mL二氯亞砜，80°C下加熱 回流48h后離心，得到中間體酰氯化氧化石墨烯，用四氫呋喃洗滌兩次后，干燥;再在抽真空 氮氣保護的條件下，將酰氯化氧化石墨烯和lmL正丁胺混合，60°C反應72h，冷卻至室溫，得 到烷基胺修飾的氧化石墨烯，分散于20mL雙蒸水中，8000r/min離心，除去未反應的正丁胺， 將剩余的反應液通過旋轉蒸發儀蒸干，蒸干后的干物質重新分散在雙蒸水中，配制成濃度 為lmg/mL的修飾的氧化石墨稀焚光材料水溶液； (2) 表面標記T-2抗體銀納米顆粒溶液的制備： (a) 將lOOmg硝酸銀溶解于250mL超純水中，加熱沸騰，加入10mL質量分數1%的檸檬酸 鈉溶液，80 °C加熱回流1 h后攪拌0.5h，4°C條件下過夜;取lmL過夜后的溶液，加入ImM的巰基 乙酸l〇yL，攪拌24h后離心，除去未反應的巰基乙酸，超純水洗滌3次，用旋轉蒸發儀蒸干，加 超純水配制成濃度為lmg/mL疏基乙酸包覆的銀納米顆粒溶液； (b) 取0.1 mM的EDC 10yL和0.1 mM的NHS 10yL，逐步加入到lmL巰基乙酸包覆的銀納米顆 粒溶液中，反應lh，得到羧基活化的銀納米顆粒溶液； (c) 取0.1 mM的T-2單克隆抗體或多克隆抗體20yL，加入到羧基活化的銀納米顆粒溶液 中，4°C反應過夜，得到表面標記T-2抗體銀納米顆粒溶液； (3) 氧化石墨烯熒光納米材料T-2抗體的標記： 取修飾的氧化石墨稀焚光材料水溶液5mL，加入2mL戊二醛，室溫反應3h，離心，除去未 反應的戊二醛，將剩余的反應液分散在0.01mol/L、pH7.4的roS緩沖溶液中，加入表面標記 T-2抗體銀納米顆粒溶液，4°C反應3h，經離心，收集氧化石墨稀焚光納米材料標記的T-2單 克隆抗體或者多克隆抗體，〇. 01mol/L、pH7.4的PBS緩沖液洗滌，保存備用。9.根據權利要求1所述的檢測T-2毒素的熒光免疫層析試紙，其特征在于，所述的NaYF4: Yb，Tm納米顆粒標記的T-2單克隆抗體或者多克隆抗體的制備方法，包括以下步驟： (1) 采用水熱合成法制備NaYF4: Yb，Tm納米顆粒： 分別取濃度均為0.5111〇1/1的￥(觀3)3溶液5.511^、￥13(^)3) 3溶液0.511^和1'111(^)3)3溶液 0.5mL，混合均勻，再加入0.4mol/L的檸檬酸鈉溶液2mL，25 °C條件下避光充分反應lh;加入 1.5mol/L NH4F溶液7mL，25°C條件下避光攪拌0.5h，用HN〇3調節pH值至7.4，靜置0.5h，加雙 蒸水稀釋至30mL;再在220°C下反應24h，冷卻到室溫，經過濾、雙蒸水洗滌、干燥，得到發藍 色光的NaYF4: Yb，Tm熒光納米顆粒； (2) 熒光納米顆粒的表面硅化： 將NaYF4: Yb，Tm熒光納米顆粒加入0.01mol/L、pH7.4的PBS緩沖液中，配制成濃度為lmg/ mL的NaYF4: Yb，Tm熒光納米顆粒溶液，再將5mL濃氨水滴入5mL NaYF4: Yb，Tm熒光納米顆粒溶 液中，充分攪拌反應20min，再加入2.5mL正娃酸四乙酯，4°C避光條件下反應4h; 6000r/min 離心10min，得到表面硅化的熒光納米顆粒，用乙醇洗滌4次，分散在甲醇中，配制成濃度為 1 Omg/mL的焚光納米顆粒甲醇溶液； (3) 熒光納米顆粒的表面氨基化： 取3mL熒光納米顆粒甲醇溶液，加入5mL的丙酮，密封后磁力攪拌20min，再用超聲波均 勻分散，加入3yL的APTSA，密封后在40 °C反應30min，再在70 °C水浴反應lh，6000r/min離心 5min，得到表面氨基化的熒光納米顆粒，用乙醇反復洗滌4次，真空干燥后，4°C密封保存； (4) T-2抗體的標記： 用0.01mol/L、pH7.4的PBS緩沖溶液將表面氨基化的熒光納米顆粒溶解，配制成濃度為 10mg/mL的表面氨基化的熒光納米顆粒溶液；取10mL表面氨基化的熒光納米顆粒溶液與 5 · 6mg NHS和15mg EDC混合，室溫避光反應3h，6000r/min離心5min，取上清液；將lmg/mL的 T-2單克隆抗體或者多克隆抗體加入上清液中，T-2單克隆抗體或者多克隆抗體和上清液的 體積比為1:100，4°C避光反應4h，離心，雙蒸水洗滌后分散在PBS緩沖溶液中，4°C條件下透 析3d，離心，收集沉淀，得到NaYF4: Yb，Tm納米顆粒標記的T-2單克隆抗體或多克隆抗體，置 于PBS緩沖溶液中，4°C保存。10.根據權利要求1所述的檢測T-2毒素的熒光免疫層析試紙，其特征在于，所述的NaGd (W〇4)2:Eu3+納米顆粒標記的T-2單克隆抗體或者多克隆抗體的制備方法，包括以下步驟： (1) 采用水熱合成法制備NaGd(W〇4)2 :Eu3+納米顆粒 稱取7g Gd2〇3和7g Eu2〇3,分別加入至50mL的HN〇3中，加熱至80°C，保溫濃縮至全部結 晶，制得Gd(N03)3和Eu(N03)3;將Na 2W〇4 · 2H20溶于去離子水中，配制成濃度為0.2mol/L的 Na2W〇4溶液；將制得的Gd (N〇3) 3和Eu (N〇3) 3用去離子水溶解，分別制備質量分數為80 %的Gd (N〇3)3溶液和質量分數為15 %的Eu(N〇3)3溶液，吸取配制的5mL Gd(N〇3)3溶液、1 OmL Na2W〇4 溶液和5mL Eu(N03)3溶液，加入到反應爸中，用稀硝酸、氫氧化鈉調節pH=5，攪拌均勻，封閉 反應釜，200°C恒溫加熱24h后，自然降至室溫;將反應釜中溶液倒出靜置，待溶液中粉體沉 淀后，去除上清液，用蒸餾水洗滌粉體3次，每次靜置3h;將洗好的粉體加熱至80 °C干燥12h， 得到NaGd(W〇4)2 :Eu3+納米顆粒； (2) T-2抗體的標記 將Τ-2單克隆抗體或多克隆抗體溶液10000r/min離心30min，除去雜質；用去離子水溶 解NaGd(W〇4)2:Eu3+納米顆粒，配制成濃度為0. lmg/mL的NaGd(W〇4)2:Eu3+納米顆粒溶液，然后 用O.lmol/L K2C03溶液調節NaGd(W〇4)2:Eu3+納米顆粒溶液至pH 8.2; 取10mL NaGd(W〇4)2:Eu3+納米顆粒溶液，在攪拌狀態下，加入T-2單克隆抗體或多克隆抗 體溶液1 〇〇μ 1，T-2單克隆抗體或多克隆抗體溶液濃度lmg/mL，混勻，室溫溫育30miη，4 °C、 10000r/min離心30min，棄上清，將沉淀用0.02mol/L Na2B4〇7溶液稀釋至 10mL，10000r/min 離心30min，沉淀用0.02mo 1/L Na2B4〇7溶液稀釋至lmL，4°C保存備用。
【文檔編號】G01N33/533GK106018794SQ201610415407
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年6月14日
【發明人】職愛民, 賈國超, 張培蕾, 李鎂娟, 王自良, 宋蓮軍, 邱國慶
【申請人】焦作百奧泰科生物科技有限公司