一種用于雙酚a檢測的電化學免疫分析方法
【專利摘要】本發明提供了一種用于雙酚A檢測的電化學免疫分析方法，包括如下步驟，1)競爭反應：向封閉電極表面滴加5～20μL等體積混合的梯度稀釋好的待測物樣溶液或樣品提取液和磷酸鹽緩沖溶液稀釋的酶標抗原溶液，置于20～35℃條件下孵育0.5～1.5h之后，沖洗并吹干；2)檢測還原峰電流值：將步驟1)洗好的電極浸入2～6mL0.2～1.5mM二茂鐵甲醇溶液中，同時加入20～60μL5～15mM雙氧水，以飽和甘汞電極為參比電極、鉑電極為對電極，進行循環伏安法測定還原峰電流值。使用本發明建立的免疫分析方法對待測物進行檢測。本發明克服了傳統酶聯免疫分析方法檢測耗時的缺點，降低了酶聯免疫檢測所需時間。
【專利說明】
一種用于雙酚A檢測的電化學免疫分析方法
技術領域
[0001]本發明屬于小分子化合物免疫化學和殘留分析技術領域，尤其是涉及一種用于雙酸A檢測的電化學免疫分析方法。
【背景技術】
[0002]雙酚-A是來源于工業化學品的內分泌干擾素。作為重要的有機化工原料，雙酚A主要用于生產聚碳酸酯、環氧樹脂等多種高分子材料和增塑劑、阻燃劑、涂料等精細化工產品。從礦泉水瓶、醫療器械到食品包裝，大多都含有雙酸A。然而，由于其成品在強洗滌劑，酸性或高溫液體作用下表面易降解，所以在環境水體，飲用水，水產品，蔬菜，水果和罐裝食品中均有殘留。毒理學實驗表明，雙酚A能夠通過模擬雌激素激動劑和雄激素拮抗劑作用，影響人體正常細胞功能，阻礙生殖系統發育，增加造血系統患癌幾率。
[0003]目前，比較常見的高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(GC)、氣相色譜-質譜聯用法(GC-MS)、液相色譜-質譜聯用法(LC-MS)和酶聯免疫吸附法(ELISA)都有被用來檢測雙酚A殘留。傳統儀器方法存在前處理復雜，儀器和相應配套費用昂貴，無法大規模進行平行樣同時檢測等缺點。而酶聯免疫的檢測往往較為耗時。因此迫切需要開發更加簡便、快速、靈敏的分析技術。
[0004]電化學生物傳感器是一類結合生物識別元件(例如:酶，抗體，核酸適配體，人工受體和分子印記等)和電化學傳輸元件的集成檢測裝置，它將傳統免疫分析方法的高特異性和電化學測量系統的低成本和低檢測限相結合。相比儀器檢測法和酶聯免疫檢測法，該方法具有操作簡便、結果易讀、對環境和設備要求低，體積小巧等優點，是一種極具應用潛力的快速檢測技術。
【發明內容】
[0005]有鑒于此，本發明旨在提出一種用于雙酚A檢測的電化學免疫分析方法，以克服傳統儀器檢測和酶聯免疫分析方法檢測時間長，儀器昂貴，難以實現實時實地檢測等問題。
[0006]為達到上述目的，本發明的技術方案是這樣實現的:
[0007]—種用于雙酸A檢測的電化學免疫分析方法，包括如下步驟，
[0008]I)競爭反應:向封閉電極表面滴加5?20yL等體積混合的梯度稀釋好的待測物樣溶液或樣品提取液和磷酸鹽緩沖溶液稀釋的酶標抗原溶液，置于20?35°C條件下孵育0.5?1.5h之后，沖洗并吹干；
[0009]2)檢測還原峰電流值:將步驟I)洗好的電極浸入2?6mL0.2?1.5mM 二茂鐵甲醇溶液中，同時加入20?60yL5?15mM雙氧水，以飽和甘汞電極為參比電極、鈾電極為對電極，進行循環伏安法測定還原峰電流值。
[0010]本發明將樣品的還原峰電流值檢測參數與標準品的還原峰電流值檢測參數圖比較而獲得樣品中雙酸A的含量。
[0011 ]進一步，所述酶標抗原溶液制備包括如下步驟:
[0012]I)雙酸A半抗原的制備，稱取0.5?2.0g雙酸A和0.5?2.5g碳酸鉀溶于5?15mL無水二甲基甲酰胺中，并加入0.5?1.5g 4-溴丁酸乙酯，反應體系在在65?80°C溫度下攪拌8?16h;隨后反應混合物利用乙酸乙酯萃取、硫酸鈉干燥、減壓旋干；生成物用體積比為I/198?2/98的甲醇與二氯甲烷的混合液做為展開劑，進行過硅膠柱分離純化，得到雙酚A中間產物al;將1.0?2.5g al溶解在3?7mL甲醇中，然后將其加入到I?5mL 3?5mol/L的氫氧化鈉水溶液中，20?30°C下攪拌8?16h;用乙酸乙酯洗滌后，水相用28?35%HCl酸化至pH2?4，酸化后的水相用乙酸乙酯萃取;接著，合并萃取所得的有機相，用硫酸鈉對所合并的有機相進行干燥，并減壓濃縮，得到雙酸A半抗原；
[0013]2)將0.5?2.0g雙酚A半抗原，0.5?2.0g N，N’-二環己基碳二亞胺和0.3?I.0gN-羥基琥珀酰亞胺溶解在15?25mL無水四氫呋喃中，將混合物在20?30°C下攪拌8?16h，離心取上清液，并利用體積比為1/9?2/98的甲醇與二氯甲烷的混合液做為展開劑對上清液進行過硅膠柱分離純化，得到黃色油狀物即為雙酚A半抗原活化酯；隨后將5?15mg雙酚A半抗原活化酯溶于0.5?1.5mL無水二甲基甲酰胺中制得甲液；
[0014]3)準確稱量11?12mg辣根過氧化酶，加入到3?5mL的碳酸氫鈉緩沖液中，緩沖溶液的PH為6?8，待完全溶解，得乙液，在冰浴條件下將甲液緩慢加入到乙液中，待完全加入后，3?6°C避光攪拌8?12h，然后將反應液在3?6 °C、pH為6?8的磷酸鹽緩沖溶液中透析2?4天，即得到酶標抗原溶液。
[0015]進一步，所述封閉電極封閉方法包括如下步驟:
[0016]I)納米金顆粒在玻碳電極表面沉積:電極經Al2O3粉末打磨洗凈沖干后，置于0.1?0.5mM HAuC14^0.05?0.15M NaNO3溶液中，以飽和氯化鉀(KCL)甘汞電極電極作為參比電極，鉑絲電極為對電極，加O?2V恒電壓5?25s ；
[0017]2)雙酚A抗體在玻碳電極表面的自組裝修飾:電極洗凈沖干后，浸入0.2?1.5mL5?15mM硫辛酸的乙醇溶液中，室溫靜置2?6h，隨后電極用50?90 %乙醇水溶液沖洗并吹干，浸在0.2?1.5mL含5?15mM EDC和5?15mM NHS的50?90%乙醇水溶液中，室溫靜置0.5?2h ；之后，電極用50?90%乙醇水溶液沖洗，經吹干后浸在5?15yL 0.2?1.5mgmL—1的抗體溶液(磷酸緩沖鹽溶液PBS\，pH=5?9)中，2?6 °C靜置過夜；
[0018]3)電極表面封閉:電極浸在0.5?2%的BSA溶液中15?45min。
[0019]本發明中合成了小分子目標分析物的半抗原，并與載體蛋白質偶聯，制備有效的酶標抗原。該技術研究的關鍵是半抗原的分子設計、合成和酶標抗原的制備。其中半抗原的設計、合成是影響免疫分析成敗的關鍵。
[0020]雙酚A結構中不具有合適的基團，因此要對雙酚A的結構進行改造，在雙酚A的羥基上引入羧基，形成可以與載體蛋白連接的臂。因此，本發明在設計合成雙酚A人工半抗原時，采用雙酚A與4-溴丁酸乙酯反應，來引入活性側鏈，合成雙酚A半抗原，這樣既保持了雙酚A半抗原與雙酸A在結構上的相似性，又使半抗原分子具有了與載體蛋白連接的合適結構。
[0021]相對于現有技術，本發明所述的一種用于雙酚A電化學免疫分析的酶標抗原及分析方法，具有以下優勢:
[0022](I)本發明所述的分析方法使檢測時間縮短30min以上。
[0023](2)本發明所述的分析方法使樣品用量縮小為傳統酶聯免疫方法的五分之一。
[0024](3)本發明所述的人工半抗原合成方法不僅簡便，且所用主要原料4-溴丁酸乙酯價格較為低廉、容易獲得，在一般化學試劑公司都可購買。由于合成效率高、反應步驟少，從而提高了反應的可控性。
【附圖說明】
[0025]構成本發明的一部分的附圖用來提供對本發明的進一步理解，本發明的示意性實施例及其說明用于解釋本發明，并不構成對本發明的不當限定。在附圖中:
[0026]圖1為本發明實施例一所述的雙酸A電化學免疫分析方法標準曲線。
【具體實施方式】
[0027]需要說明的是，在不沖突的情況下，本發明中的實施例及實施例中的特征可以相互組合。
[0028]下面將參考附圖并結合實施例來詳細說明本發明創造。
[0029]實施例一
[0030]雙酸A的合成
[0031 ] 稱取0.5?2.0g雙酸A和0.5?2.5g碳酸鉀溶于5?15mL無水二甲基甲酰胺中，并加入0.5?1.5g 4-溴丁酸乙酯。反應體系在在65?80°C溫度下攪拌8?16h。隨后反應混合物利用乙酸乙酯萃取、硫酸鈉干燥、減壓旋干。生成物用體積比為1/198?2/98的甲醇與二氯甲烷的混合液做為展開劑，進行過硅膠柱分離純化，得到雙酚A中間產物al。將1.0?2.5gal溶解在3?7mL甲醇中，然后將其加入到I?5mL 3?5mol/L的氫氧化鈉水溶液中。20?30°C下攪拌8?16h。反應混合物用乙酸乙酯洗滌后，水相用28?35%HC1酸化至pH 2?4。然后酸化后的水相用乙酸乙酯萃取。接著，合并有機相，硫酸鈉干燥，并減壓濃縮，得到雙酚A半抗原。
[0032]酶標抗原的合成
[0033]I)將0.5?2.0ga2，0.5?2.0g N，N’_二環己基碳二亞胺和0.3?1.0g N-羥基琥珀酰亞胺溶解在15?25mL無水四氫呋喃中。將混合物在20?30°C下攪拌8?16h，離心取上清液，并利用體積比為1/9?2/98的甲醇與二氯甲烷的混合液做為展開劑對生成物進行過硅膠柱分離純化，得到黃色油狀物即為雙酸A半抗原活化酯。隨后將5?15mg雙酚A半抗原活化酯溶于0.5?1.5mL無水二甲基甲酰胺中制得甲液；
[0034]2)準確稱量11?12mg辣根過氧化酶，加入到3?5mL的碳酸氫鈉緩沖液中，緩沖溶液的PH為6?8，待完全溶解，得乙液，在冰浴條件下將甲液緩慢加入到乙液中，待完全加入后，3?6°C避光攪拌8?12h，然后將反應液在3?6 °C、pH為6?8的磷酸鹽緩沖溶液中透析2?4天，即得到酶標抗原溶液。
[0035]用于雙酸A電化學免疫分析的電極封閉方法包括如下步驟:
[0036]I)納米金顆粒在玻碳電極表面沉積:電極經Al2O3粉末打磨洗凈沖干后，置于0.1?
0.5mM HAuC14^0.05?0.15M NaNO3溶液中，以飽和氯化鉀(KCL)甘汞電極電極作為參比電極，鉑絲電極為對電極，加O?2V恒電壓5?25s。
[0037]2)抗體在玻碳電極表面的自組裝修飾:電極洗凈沖干后，浸入0.2?1.5mL5?15mM硫辛酸的乙醇溶液中，室溫靜置2?6h。隨后電極用50?90 %乙醇水溶液沖洗并吹干，浸在
0.2?1.5mL含5?15mM EDC和5?15mM NHS的50?90%乙醇水溶液中，室溫靜置0.5?2h。之后，電極用50?90%乙醇水溶液沖洗，經吹干后浸在5?15yL 0.2?1.5mgmL—1的抗體溶液(PBS，pH=5?9)中，2?6°C靜置過夜。
[0038]3)電極表面封閉:電極浸在0.5?2%的BSA溶液中15?45min。
[0039]雙酸A電化學免疫分析方法檢測步驟:
[0040]I)競爭反應:向封閉電極表面滴加5?20yL等體積混合的梯度稀釋好的待測物樣溶液或樣品提取液和磷酸鹽緩沖溶液稀釋的酶標抗原溶液，置于20?35°C條件下孵育0.5?1.5h之后，沖洗并吹干。
[0041 ] 2)檢測還原峰電流值:將上一步洗好的電極浸入2?6mL0.2?1.5mM 二茂鐵甲醇溶液中，同時加入20?60yL5?15mM雙氧水，以飽和甘汞電極為參比電極、鈾電極為對電極，進行循環伏安法測定還原峰電流值。
[0042]根據還原峰電流值建立雙酸A的電化學免疫分析方法標準曲線，如圖1所示。
[0043]以上所述僅為本發明創造的較佳實施例而已，并不用以限制本發明創造，凡在本發明創造的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明創造的保護范圍之內。
【主權項】
1.一種用于雙酸A檢測的電化學免疫分析方法，其特征在于:包括如下步驟， 1)競爭反應:向封閉電極表面滴加5?20yL等體積混合的梯度稀釋好的待測物樣溶液或樣品提取液和磷酸鹽緩沖溶液稀釋的酶標抗原溶液，置于20?35°C條件下孵育0.5?1.5h之后，沖洗并吹干； 2)檢測還原峰電流值:將步驟I)洗好的封閉電極浸入2?6mL0.2?1.5mM二茂鐵甲醇溶液中，同時加入20?60yL5?15mM雙氧水，以飽和甘汞電極為參比電極、鈾電極為對電極，進行循環伏安法測定還原峰電流值。2.根據權利要求1所述的一種用于雙酚A檢測的電化學免疫分析方法，其特征在于:所述酶標抗原溶液制備包括如下步驟: 1)雙酸A半抗原的制備，稱取0.5?2.0g雙酸A和0.5?2.5g碳酸鉀溶于5?15mL無水二甲基甲酰胺中，并加入0.5?1.5g 4-溴丁酸乙酯，反應體系在在65?80°C溫度下攪拌8?16h;隨后反應混合物利用乙酸乙酯萃取、硫酸鈉干燥、減壓旋干;生成物用體積比為1/198?2/98的甲醇與二氯甲烷的混合液做為展開劑，進行過硅膠柱分離純化，得到雙酚A中間產物al;將1.0?2.5g al溶解在3?7mL甲醇中，然后將其加入到I?5mL 3?5mol/L的氫氧化鈉水溶液中，20?30°C下攪拌8?16h;用乙酸乙酯洗滌后，水相用28?35 % HCl酸化至pH2?4，酸化后的水相用乙酸乙酯萃取;接著，合并萃取所得的有機相，用硫酸鈉對所合并的有機相進行干燥，并減壓濃縮，得到雙酸A半抗原； 2)將0.5?2.0g雙酚A半抗原，0.5?2.0gN，N’-二環己基碳二亞胺和0.3?1.0g N-羥基琥珀酰亞胺溶解在15?25mL無水四氫呋喃中，將混合物在20?30°C下攪拌8?16h，離心取上清液，并利用體積比為1/9?2/98的甲醇與二氯甲烷的混合液做為展開劑對上清液進行過硅膠柱分離純化，得到黃色油狀物即為雙酚A半抗原活化酯;隨后將5?15mg雙酸A半抗原活化酯溶于0.5?1.5mL無水二甲基甲酰胺中制得甲液； 3)準確稱量11?12mg辣根過氧化酶，加入到3?5mL的碳酸氫鈉緩沖液中，緩沖溶液的pH為6?8，待完全溶解，得乙液，在冰浴條件下將甲液緩慢加入到乙液中，待完全加入后，3?6°C避光攪拌8?12h，然后將反應液在3?6°C、pH為6?8的磷酸鹽緩沖溶液中透析2?4天，即得到酶標抗原溶液。3.根據權利要求1所述的一種用于雙酚A檢測的電化學免疫分析方法，其特征在于:所述封閉電極封閉方法包括如下步驟: 1)納米金顆粒在玻碳電極表面沉積:電極經Al2O3粉末打磨洗凈沖干后，置于0.1?.0.5mM HAuCl4的0.05?0.15M NaNO3溶液中，以飽和氯化鉀甘汞電極電極作為參比電極，鉑絲電極為對電極，加O?2對旦電壓5?25s ； 2)雙酚A抗體在玻碳電極表面的自組裝修飾:電極洗凈沖干后，浸入0.2?1.5mL5?.15mM硫辛酸的乙醇溶液中，室溫靜置2?6h，隨后電極用50?90%乙醇水溶液沖洗并吹干，浸在0.2?1.5mL含5?15mM EDC和5?15mM NHS的50?90%乙醇水溶液中，室溫靜置0.5?.2h;之后，電極用50?90%乙醇水溶液沖洗，經吹干后浸在5?15yL 0.2?1.5mgmL—1的抗體溶液中，2?6°C靜置過夜； 3)電極表面封閉:電極浸在0.5?2%的BSA溶液中15?45min。
【文檔編號】G01N27/48GK106018779SQ201610315662
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月12日
【發明人】陸旸, 丁敏玲, 李夢娟, 張燕, 劉國珍, 李翔, 王碩
【申請人】天津科技大學, 江南大學, 華中師范大學, 中國特種設備檢測研究院