含酶偶聯核酸-銀納米探針的胃癌檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種含酶偶聯核酸?銀納米探針的胃癌檢測試劑盒，包括如下組分：酶偶聯核酸?銀納米探針，試劑a和試劑b；所述酶偶聯核酸?銀納米探針是用下述方法制成：(1)分別用磷酸鹽緩沖溶液為溶劑配制寡聚核苷酸溶液，硝酸銀溶液和硼氫化鈉溶液；(2)取寡聚核苷酸溶液和硝酸銀溶液，混勻，加磷酸鹽緩沖溶液，攪拌，加入硼氫化鈉溶液，攪拌，(3)向步驟(2)獲得的液體中加入FeSO4水溶液，加入D?氨基酸氧化酶水溶液，震勻；試劑a為3?100mM的AgNO3水溶液；試劑b為三氟乙酸。用本發明的試劑盒，可實現胃癌患者早期標記物的D?氨基酸有效、準確、經濟和快捷的檢測；樣品無需衍生化，操作簡單、成本低。
【專利說明】
含酶偶聯核酸-銀納米探針的胃癌檢測試劑盒
技術領域
[0001 ]本發明屬于生物檢測技術領域，具體涉及一種含酶偶聯核酸-銀納米探針的胃癌檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002]氨基酸是蛋白質的基本組成單元，與生命活動密切相關。大部分氨基酸均存在手性對映異構體，L-氨基酸和D-氨基酸(甘氨酸除外)ο絕大多數存在于地球上的生命體均以L-氨基酸合成蛋白質，僅少數細菌細胞內存在L-氨基酸的肽鏈。雖然D-氨基酸不參與人體蛋白質的合成，但其具有特殊的生理功能，少而適量的D-氨基酸是生命所必需的。過量的D-氨基酸可被D-氨基酸氧化酶消除。否則，D-氨基酸的大量進入，將可能引起生命活動的異常甚至死亡。例如，在肌萎縮性側索硬化癥患者的神經膠質細胞中含濃度較高的D-絲氨酸。因此，生物體中D-氨基酸的分析檢測在臨床檢測中極為重要，近年來，相關研究結果表明，D-丙氨酸和D-脯氨酸與胃癌、老年癡呆等疾病和腎病等疾病具有明顯的正相關性(AminoAcids,2007,32:137-140,Clinical Science，1987，73:105-108.)，因此，二者可作為胃癌的標記物為臨床檢測提供基礎理論和關鍵技術。
[0003]目前，手性異構體的分析，尤其是小分子異構體氨基酸的檢測仍然較為繁瑣。D-氨基酸檢測方法主要包括高壓液相色譜法，氣相色譜法，圓二色譜法，電化學檢測法，酶法和微流控芯片法等。但上述方法步驟繁瑣、操作復雜、成本高、需要大型設備及專業人員等不足。生化分析中熒光法分析法具有分析靈敏度高、選擇性強和使用簡便等優點，并且以納米銀為熒光探針檢測D-氨基酸的工作尚未報道。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是克服現有技術的不足，提供了含酶偶聯核酸-銀納米探針的胃癌檢測試劑盒。
[0005]本發明的技術方案概述如下:
[0006]—種含酶偶聯核酸-銀納米探針的胃癌檢測試劑盒，包括如下組分:
[0007]酶偶聯核酸-銀納米探針，試劑a和試劑b;
[0008]所述酶偶聯核酸-銀納米探針是用下述方法制成:
[0009]I)分別用磷酸鹽緩沖溶液為溶劑配制0.1-0.5mM寡聚核苷酸溶液，配制0.7-3.5mM的硝酸銀溶液和配制0.7-3.5mM硼氫化鈉溶液；
[0010]2)取50yL所述寡聚核苷酸溶液和50yL硝酸銀溶液，混合均勻，加入4.85mL的磷酸鹽緩沖溶液，攪拌15-25min，加入50yL硼氫化鈉溶液，攪拌50_90min;所述寡聚核苷酸、硝酸銀和硼氫化鈉的摩爾比為:1:7:7；
[0011 ] 3)向步驟(2)獲得的液體中加入0.56mL的0.5-5.0mM的FeSO4水溶液，加入25_40yL的100000U/L D-氨基酸氧化酶水溶液，震蕩混勻，得到酶偶聯核酸-銀納米探針;所述磷酸鹽緩沖溶液的濃度為20mM，pH為6.8;
[0012]試劑a為3-100mM的AgNO3水溶液；
[0013]試劑b為三氟乙酸。
[0014]本發明的優點:
[0015](I)用本發明的試劑盒，可實現胃癌患者早期標記物的D-氨基酸的有效、準確、經濟和快捷的檢測；
[0016](2)與傳統的檢測方法相比，樣品無需進行衍生化，操作簡單、成本低，實現胃癌檢測。
【附圖說明】
[0017]圖1為本發明的試劑盒中酶偶聯核酸-銀納米探針的熒光照片；
[0018]圖2為本發明的試劑盒中酶偶聯核酸-銀納米探針的熒光光譜圖；
[0019]圖3為用本發明的試劑盒對胃癌標記物D-丙氨酸檢測的熒光譜圖；
[0020]圖4為用本發明的試劑盒對胃癌標記物D-脯氨酸檢測的熒光譜圖。
【具體實施方式】
[0021 ]下面結合具體實施例對本發明作進一步的說明。
[0022]本發明的實施例是為了使本領域的技術人員能夠更好地理解本發明，若在本申請寡聚核苷酸5 ~CCCTTAATCCCC-3 z的基礎上進行改進，并與D-氨基酸氧化酶結合用于制備酶偶聯核酸-銀納米探針，也屬于本發明的范圍。
[0023]實施例1
[0024]—種酶偶聯核酸-銀納米探針，用下述方法制成:
[0025](I)分別用磷酸鹽緩沖溶液為溶劑配制0.3mM寡聚核苷酸溶液，配制2.1mM的硝酸銀溶液，和配制2.1mM硼氫化鈉溶液；
[0026](2)取50yL所述寡聚核苷酸溶液和50yL硝酸銀溶液，混合均勻，加入4.85mL磷酸鹽緩沖溶液，攪拌20min，加入50yL硼氫化鈉溶液，攪拌70min;
[0027](3)向步驟(2)獲得的液體中加入0.56mL的I.0mM的FeSO4水溶液，加入35yL的100000U/L D-氨基酸氧化酶水溶液，震蕩混勻;寡聚核苷酸為5'CCCTTAATCCCC-3z。
[0028]所述磷酸鹽緩沖溶液的濃度為20mM，pH為6.8。
[0029]酶偶聯核酸-銀納米的探針的熒光照片見圖1。
[0030]熒光譜圖為圖2。
[0031]實施例2
[0032]—種酶偶聯核酸-銀納米探針，用下述方法制成:
[0033](I)分別用磷酸鹽緩沖溶液為溶劑配制0.1mM寡聚核苷酸溶液，配制0.7mM的硝酸銀溶液，和配制0.7mM硼氫化鈉溶液；
[0034](2)取50yL所述寡聚核苷酸溶液和50yL硝酸銀溶液，混合均勻，加入4.85mL的磷酸鹽緩沖溶液，攪拌15min，加入50yL硼氫化鈉溶液，攪拌50min;
[0035](3)向步驟(2)獲得的液體中加入0.56mL的0.5mM的FeSO4水溶液，加入25yL的100000U/L D-氨基酸氧化酶水溶液，震蕩混勻;寡聚核苷酸為5'CCCTTAATCCCC-3z。
[0036]所述磷酸鹽緩沖溶液的濃度為20mM，pH為6.8。
[0037]熒光譜圖為圖2。
[0038]實施例3
[0039]—種酶偶聯核酸-銀納米探針，用下述方法制成:
[0040](I)分別用磷酸鹽緩沖溶液為溶劑配制0.5mM寡聚核苷酸溶液，配制3.5mM的硝酸銀溶液，和配制3.5mM硼氫化鈉溶液；
[0041 ] (2)取50yL所述寡聚核苷酸溶液和50yL硝酸銀溶液，混合均勻，加入4.85mL的磷酸鹽緩沖溶液，攪拌25min，加入50yL硼氫化鈉溶液，攪拌90min;
[0042](3)向步驟(2)獲得的液體中加入0.56mL的5.0mM的FeSO4水溶液，加入40yL的100000U/L D-氨基酸氧化酶水溶液，震蕩混勻;寡聚核苷酸為5'CCCTTAATCCCC-3z。
[0043]所述磷酸鹽緩沖溶液的濃度為20mM，pH為6.8。
[0044]熒光譜圖為圖2。
[0045]實施例4
[0046]—種含酶偶聯核酸-銀納米探針的胃癌檢測試劑盒，包括如下組分:
[0047]實施例1制備的酶偶聯核酸-銀納米探針，試劑a和試劑b;
[0048]試劑a為50mM的AgNO3水溶液；
[0049]試劑b為三氟乙酸。
[0050]實施例5
[0051]—種含酶偶聯核酸-銀納米探針的胃癌檢測試劑盒，包括如下組分:
[0052]實施例2制備的酶偶聯核酸-銀納米探針，試劑a和試劑b;
[0053]試劑a為3mM的AgNO3水溶液；
[0054]試劑b為三氟乙酸。
[0055]實施例6
[0056]—種含酶偶聯核酸-銀納米探針的胃癌檢測試劑盒，包括如下組分:
[0057]實施例3制備的酶偶聯核酸-銀納米探針，試劑a和試劑b;
[0058]試劑a為I OOmM的AgNO3水溶液；
[0059]試劑b為三氟乙酸。
[0060]實施例7
[0061 ]用實施例4的試劑盒進行檢測:
[0062]在三支離心管中，分別加入1yL模擬胃液(Scientif ic Reports,2016,6: 22165)(空白)、I OyL含1 2M的L-丙氨酸的模擬胃液；I OyL含1 2M的D-丙氨酸的模擬胃液；
[0063]再分別加入1yL試劑a，混合均勾，離心30min，取上清液，加入2yL試劑b，離心15min，取上清液，蒸干，加1yL蒸饋水，加入90yL的酶偶聯核酸-銀納米探針，混合均勾，370C恒溫30min，用熒光分光光度計在激發波長568nm，發射波長620nm測定。結果見圖3。
[0064]實施例8
[0065]用實施例5的試劑盒進行檢測:
[0066]在三支離心管中，分別加入1yL模擬胃液(Scientif ic Reports,2016,6: 22165)(空白)、1yL含10—2M的L-脯氨酸的模擬胃液；1yL含10—2M的D-脯氨酸的模擬胃液；
[0067]再分別加入1yL試劑a，混合均勾，離心30min，取上清液，加入2yL試劑b，離心15min，取上清液，蒸干，加1yL蒸饋水，加入90yL的酶偶聯核酸-銀納米探針，混合均勾，37°(:恒溫3011^11，用熒光分光光度計在激發波長56811111，發射波長62011111測定。結果見圖40
[0068]實施例9
[0069]用實施例6的試劑盒進行檢測:
[0070]步驟同實施例7，結果與實施例7相似。
[0071]實驗證明:用本發明的試劑盒可以對胃癌早期標記物D-丙氨酸，D-脯氨酸等進行檢測。
【主權項】
1.一種含酶偶聯核酸-銀納米探針的胃癌檢測試劑盒，其特征是包括如下組分: 酶偶聯核酸-銀納米探針，試劑a和試劑b; 所述酶偶聯核酸-銀納米探針是用下述方法制成: 1)分別用磷酸鹽緩沖溶液為溶劑配制0.1-0.5mM寡聚核苷酸溶液，配制0.7-3.5mM的硝酸銀溶液和配制0.7-3.5mM硼氫化鈉溶液； 2)取50yL所述寡聚核苷酸溶液和50yL硝酸銀溶液，混合均勻，加入4.85mL的磷酸鹽緩沖溶液，攪拌15-25min，加入50yL硼氫化鈉溶液，攪拌50_90min;所述寡聚核苷酸、硝酸銀和硼氫化鈉的摩爾比為:1:7:7; 3)向步驟(2)獲得的液體中加入0.56mL的0.5-5.0mM的FeSO4水溶液，加入25_40yL的100000U/L D-氨基酸氧化酶水溶液，震蕩混勻，得到酶偶聯核酸-銀納米探針;所述磷酸鹽緩沖溶液的濃度為20mM，pH為6.8; 試劑a為3-100mM的AgNO3水溶液； 試劑b為三氟乙酸。
【文檔編號】G01N21/64GK106018370SQ201610526249
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年7月6日
【發明人】仰大勇, 張志昆, 楊璐, 劉陽
【申請人】天津大學