一種柑桔黃龍病的近紅外光譜田間檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種柑桔黃龍病的近紅外光譜田間檢測方法，所述檢測應用方法包括如下步驟：S1.標準樣品光譜集的建立：采用微型便攜式近紅外光譜儀于田間直接探測讀取感染柑桔黃龍病病菌和不帶黃龍病病菌柑桔植株葉片的近紅外光譜學數據；S2.定性分類判別模型的建立：將S1中的近紅外光譜學數據進行校正和預處理后，分別提取其近紅外光譜學的特征值，經訓練集訓練和驗證集驗證后得到最優的PLS?DA定性分類判別模型；S3.未知樣品的定性判別：用S2建立的最優的PLS?DA定性分類判別模型于田間直接區分待測柑桔葉片樣本是否已感染柑桔黃龍病，單一植株僅需現場掃描3～5個葉片，耗時僅需1～2 min，便可實現快速實時確診。本發明方法可進行柑桔黃龍病的田間快速診斷，操作簡便，快速準確，對樣本不產生任何損傷，并對環境友好。
【專利說明】
一種柑桔黃龍病的近紅外光譜田間檢測方法
技術領域
[0001] 本發明涉及果樹病害田間的快速診斷技術領域，具體地，涉及一種柑桔黃龍病的 近紅外光譜田間檢測方法。
【背景技術】
[0002] 柑桔黃龍病(Citrus Huanglongbing，HLB)，是柑桔上的一種毀滅性病害，自20世 紀初柑桔黃龍病在我國華南地區被首次報道以來，該病害已成為制約世界柑桔產業健康發 展的最重要因素之一。柑桔植株一旦感染柑桔黃龍病，輕者影響柑橘的產量和品質，重者則 造成柑桔植株的直接死亡，堪稱柑桔產業上的"癌癥"（Bove，2006; Gr叫a,2015)。
[0003] 黃龍病病樹的正確診斷和鑒定是生產上正確防治柑桔黃龍病的前提，因此掌握快 速而有效的柑桔黃龍病診斷與檢測技術，對及時發現柑桔黃龍病并采取相應的措施積極防 治柑桔黃龍病具有重要實踐意義。PCR檢測技術是目前最有效的診斷技術，但是其僅限于在 具備有一定設備條件的實驗室內進行，而且需要熟練的技術人員，檢測成本高昂，不適合進 行田間大規模的排查（張利平，2009)。目前已有的田間直接診斷方法有：田間癥狀診斷法 (張名福等，1998;田亞南等，1999)，碘染色法(張利平等，2009)，環介導等溫擴增(LAMP)法 (黃麗等，2012)，近紅外光譜法等(劉燕德等2016)。田間癥狀診斷雖然快速簡便，但是黃龍 病的田間癥狀復雜多變，不同的生長季節在葉片、果實和植株上表現不同，且其癥狀易與柑 桔衰退病、缺素癥、天牛為害和除草劑藥害相互混淆，給病害的準確診斷鑒定造成困難 (Bove，2006);碘染色法則特異性較差，準確度低，同樣不適合進行柑桔黃龍病的田間早期 診斷(張利平等，2009);環介導等溫擴增(LAMP)法的原理基本與PCR檢測方法相同，需要先 進行復雜的前處理，并需要熟練的技術人員（孔德英等，2013);而現有報道的近紅外光譜法 是將柑桔葉片樣本采集回到實驗室內，再利用大型的傅里葉光譜儀進行分析，對不同類型 柑桔葉片的光譜特征解釋有較大意義，并從理論上明確了近紅外光譜應用于柑桔黃龍病的 診斷是可行的（劉燕德等，2016);但現有報道并沒有涉及該方法的田間應用技術，特別是沒 有涉及光譜數據的田間采集方法，難以適應于柑桔黃龍病的田間大規模快速診斷。因此，生 產上依然急需一種簡單易行，果農可以快速掌握，適合于田間大規模應用的柑桔黃龍病快 速診斷技術。
【發明內容】
[0004] 本發明為了克服現有技術的上述不足，提供一種柑桔黃龍病的近紅外光譜田間檢 測方法。
[0005] 為了實現上述目的，本發明是通過以下技術方案予以實現的：
[0006] -種柑桔黃龍病的近紅外光譜田間檢測方法，具體包括以下步驟：
[0007] S1.標準樣品光譜集的建立:采用微型便攜式近紅外光譜儀于田間直接探測讀取 感染柑桔黃龍病病菌和不帶黃龍病病菌柑桔植株葉片的近紅外光譜學數據；
[0008] S2.定性分類判別模型的建立:將S1中的近紅外光譜學數據進行校正和預處理后， 分別提取其近紅外光譜學的特征值，經訓練集訓練和驗證集驗證后得到最優的PLS-DA定性 分類判別模型；
[0009] S3.未知樣品的定性判別：用S2建立的最優的PLS-DA定性分類判別模型于田間直 接區分待測柑桔葉片樣本是否已感染柑桔黃龍病。
[0010] 本發明的方案，針對單一植株僅需現場掃描3~5個葉片，耗時僅需1~2min，便可 實現快速實時確診。
[0011] 作為優選實施方式，微型便攜式近紅外光譜儀探測讀數的部位為葉片背面的主葉 脈，葉齡為當年生或上年生的秋稍成熟葉片。
[0012] 為了讓該模型很好的將感染柑桔黃龍病柑桔葉片樣本與不帶菌柑桔葉片樣本進 行正確歸類。PLS-DA模型評價參數包括:決定系數(R 2)、預測誤差均方根(RMSEP)和交互驗 證均方根(RMSECV)。建立PLS-DA定性分類判別模型的評價標準為：（1)決定系數R 2值越接近 于1，表示所建立模型的預測值與真實值之間的相關性越好；⑵預測誤差均方根(RMSEP)值 越小，則能夠表明試驗結果和真實值越接近，并說明所建模型的預測精度越高；（3)交互驗 證均方根(RMSECV)作為主成分選擇的主要依據，一般選在RMSECV值最低處對應的主成分數 作為最佳主成分數；（4)RMSEP和SEP值越接近且越小代表模型性能越佳，預測精度越高。
[0013] 優選地，步驟S1所述的微型便攜式近紅外光譜儀采用的圖譜采集軟件為 MicroNIRl.5.7,測量時間（典型值)為0.5s，測量波長范圍為950~1650nm，采集背景為鋼 板，光源采集直徑為16mm。
[0014] 優選地，步驟S2并利用移動窗口擬和多項式平滑法（Sav i t zky-Go 1 ay，SG)消除噪 聲對光譜信號的影響，同時進行一階求導以消除基線漂移和背景影響，采用隨機樣本劃分 法(RS)劃分出為訓練集和驗證集。
[0015] 優選的，所述訓練集和驗證集中的柑桔葉片光譜學數據樣本均從標準樣品光譜集 中選取。
[0016] 與現有技術相比，本發明具有以下有益效果：
[0017] 本發明以田間采集的柑桔葉片近紅外光譜學數據為基礎，建立能對柑桔黃龍病進 行定性分類判別的判別模型，建立一種柑桔黃龍病的近紅外光譜學快速無損檢測方法，以 實現柑桔黃龍病的田間早期、準確以及快速無損診斷。相比目前常用的PCR檢測技術，本發 明不需要在具備有一定設備條件的實驗室內進行，可以直接在田間進行，每個樣本的相對 檢測成本低廉，而且還可以極大縮短生產上柑桔黃龍病的檢測周期，單一植株僅需現場掃 描3~5個葉片，耗時僅需1~2min，便可實現快速實時確診，有利于進行柑桔黃龍病的田間 大規模排查。另外，本發明采用物理光譜學實現柑桔黃龍病的田間快速診斷，還可以對樣本 不產生任何損傷，并對環境友好。
【附圖說明】
[0018] 圖1為不同柑桔葉片樣本的MicroNIR原始光譜。
[0019] 圖2為最優PLS-DA模型的預測結果。
【具體實施方式】
[0020] 下面結合說明書附圖和具體實施例對本發明作出進一步地詳細闡述，所述實施例 只用于解釋本發明，并非用于限定本發明的范圍。下述實施例中所使用的試驗方法如無特 殊說明，均為常規方法;所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，為可從商業途徑得到的試劑 和材料。
[0021] 實施例1
[0022]本實施例采用MicroNIR微型便攜式近紅外光譜儀直接于田間直接探測讀取待測 砂糖桔葉片的光譜學數據，并同時應用偏最小二乘判別(PLS-DA)模型進行定性分類判別， 以區分待測砂糖桔葉片樣本是否已感染柑桔黃龍病。
[0023] 1、砂糖桔葉片標準樣品光譜集的建立:不帶菌砂糖桔葉片樣本與感染柑桔黃龍病 砂糖桔葉片樣本的近紅外光譜學數據均通過微型近紅外光譜儀（Mi croNIR 17003?6〇讓〇1116七6〇進行采集，圖譜采集軟件為聽(^(^11?1.5.7，測量時間（典型值）為 〇. 5s，測量波長范圍為950~1650nm，將吸收率低、折射率和反射率相對較好的鋼板作為采 集背景。每個樣本取3點進行掃描，并取其平均值作為砂糖桔葉片標準樣品光譜集中每個樣 本的原始近紅外光譜學數據。
[0024] 2、柑桔黃龍病定性分類判別模型的建立:利用The Unscrambler 9.8分析軟件，結 合偏最小二乘判別(PLS-DA)法建立柑桔黃龍病病葉定性分類判別模型，并利用移動窗口擬 和多項式平滑法(Savitzky-G〇lay，SG)消除噪聲對光譜信號的影響，同時進行一階求導以 消除基線漂移和背景影響。采用隨機樣本劃分法(RS)將分別將感染柑桔黃龍病柑桔葉片樣 本與不帶菌柑桔葉片樣本的原始近紅外光譜學數據劃分出為訓練集和驗證集，染病柑桔葉 片樣本121個，其中訓練集101個，驗證集20個;不帶菌柑桔葉片樣本176個，其中訓練集133 個，驗證集43個。PLS-DA定性分類判別模型的評價標準為：（1)決定系數R 2值越接近于1，表 示所建立模型的預測值與真實值之間的相關性越好；（2)預測誤差均方根(RMSEP)值越小， 則能夠表明試驗結果和真實值越接近，并說明所建模型的預測精度越高；（3)交互驗證均方 根(RMSECV)作為主成分選擇的主要依據，一般選在RMSECV值最低處對應的主成分數作為最 佳主成分數；（4)RMSEP和SEP值越接近且越小代表模型性能越佳，預測精度越高。根據以上 評價標準，發現SG -階導數7點平滑時，其R2 = 0.970317，RMSEP = 0.080198，SEP = 0.074656,相對其它組合的預測結果更能滿足模型評價標準。所以將經過SG-階導數7點平 滑預處理后所建的模型作為最優PLS-DA預測模型，主成分15為最佳參數。PLS-DA模型建立 過程中，為了決定樣本種類歸屬，通常需要對訓練集賦予分類變量(Y)，Y矩陣必須描述特定 種類的樣品，一般可以用"Γ和"〇"來表示樣本屬于某一類或者不屬于某一類，然后通過設 定一個臨界值來判定歸屬。圖2為最優PLS-DA模型的預測結果，從圖中可以看出，該模型很 好的將感染柑桔黃龍病柑桔葉片樣本與不帶菌柑桔葉片樣本進行了正確歸類。經計算，其 驗證集分類準確率高達100%，表明該模型的預測準確度足以滿足后期田間待測樣本的定 性分類判別要求。
[0025]決定系數(R2):
①
[0027]交互驗證均方根（root-mean-squares error of cross_validation，RMSCEV)
②
[0029]預測誤差均方根（root-mean-squares error of prediction，RMSEP)
[0031 ]公式①、②和②中：Yi為傳統分析技術得到的參考值;Ym為Yi的均值;?ξ為利用近紅 外分析得到的預測值;η為建模樣品數;m為主成分數;ρ為驗證集樣品數;1^為交叉驗證得到 的預測值;&.為驗證集得到的預測值。
[0032] 3、柑桔黃龍病定性分類判別模型的適用性驗證:為對所建模型進行適用性驗證， 重新采集了兩個砂糖桔果園（1號果園與2號果園）的田間樣本，每個果園按五點隨機取樣法 進行采樣，每點采樣33個，每個柑桔園共采樣165個，兩個柑桔園共采樣330個。實時熒光定 量PCR(RT-qPCR)檢測結果顯示，本批次田間樣品中帶菌樣本共297個，不帶菌樣本共33個， 其中1號果園帶菌樣本150個，不帶菌樣本10個，2號果園帶菌樣本147個，不帶菌樣本13個。 兩個不同柑桔園樣本MicroNIR光譜按照最佳參數進行預處理后，分別輸入最優PLS-DA定性 分類判別模型中進行分類預測，并用卡方檢驗(X 2)判斷模型預測值與理論值之間是否有差 異。兩個不同砂糖桔果園的田間驗證結果表明，PLS-DA模型的正確識別率均在99%以上，最 高達到100%，再一次驗證了該模型的精確預測能力。將理論預測值與RT-qPCR的檢測實際 值進行卡方檢驗發現，其卡方(X 2)值為〇. 357，P值為0.592，表明該模型的理論預測值與RT-qPCR所檢測的實際值之間無顯著差異，能精確的對待測柑桔葉片樣本進行定性分類判別， 可以進一步利用該模型進行柑桔黃龍病的田間快速診斷應用。
[0033] 正確識別率（Correct recognition rate) =Nr/NiX 100%
[0034] 式中:Nr為正確識別樣品本身來源的樣本數;Ni為同一來源的樣本個數。
【主權項】
1. 一種柑桔黃龍病的近紅外光譜田間檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：51. 標準樣品光譜集的建立:采用微型便攜式近紅外光譜儀于田間直接探測讀取感染 柑桔黃龍病病菌和不帶黃龍病病菌柑桔植株葉片的近紅外光譜學數據；52. 定性分類判別模型的建立:將S1中的近紅外光譜學數據進行校正和預處理后，分別 提取其近紅外光譜學的特征值，經訓練集訓練和驗證集驗證后得到最優的PLS-DA定性分類 判別t吳型； S3 .未知樣品的定性判別：用S2建立的最優的PLS-DA定性分類判別模型于田間直接區 分待測柑桔葉片樣本是否已感染柑桔黃龍病。2. 根據權利要求1所述方法，其特征在于，光譜儀探測讀數的部位為葉片背面的主葉 脈，葉齡為當年生或上年生的秋稍成熟葉片。3. 根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，S1所述微型便攜式近紅外光譜儀使用 的圖譜采集軟件為MicroNIR 1.5.7,測量時間為0.5 s，測量波長范圍為950~1650 nm，采 集背景為鋼板，光源采集直徑為16 mm。4. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，S2所述最優PLS-DA模型評價的參數包括： 決定系數、預測誤差均方根和交互驗證均方根。5. 根據權利要求4所述的方法，其特征在于，決定系數值越接近于1，表示所建立模型的 預測值與真實值之間的相關性越好;預測誤差均方根值越小，則能夠表明試驗結果和真實 值越接近，說明所建模型的預測精度越高;交互驗證均方根選在其值最低處對應的主成分 數作為最佳主成分數;預測誤差均方根和預測誤差值越接近且越小代表模型性能越佳，預 測精度越高。
【文檔編號】G01N21/359GK106018332SQ201610581372
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年7月21日
【發明人】曾鑫年, 陳冬梅, 王華堂
【申請人】華南農業大學