T 細胞表位表達譜分析、制備 t 細胞組合物以及治療疾病的方法
【專利摘要】本文公開了一種檢測從受試者分離的樣品中的抗原特異性T細胞和繪制所述抗原的免疫刺激表位的方法。此類方法可用于制備例如用于治療疾病諸如癌癥、感染性疾病和自身免疫疾病的抗原特異性T細胞組合物的方法。
【專利說明】
τ細胞表位表達譜分析、制備τ細胞組合物從及治療疾病的 方法
技術領域
[0001] 本發明提供檢測樣品中的抗原特異性Τ細胞，鑒定該抗原特異性Τ細胞對其應答的 抗原的免疫刺激表位，W及使用該表位制備(例如）用于治療疾病的Τ細胞組合物的方法。
[0002] 發明背景
[0003] Τ細胞對抗原的應答設及Τ細胞識別抗原的片段，即在抗原呈遞細胞上表達的抗原 呈遞分子的環境中存在的表位。抗原蛋白的給定片段是否為免疫刺激表位，即能夠刺激Τ細 胞對其應答，在很大程度上取決于其結合抗原呈遞分子的性質，W及表位的特定氨基酸與 適當Τ細胞受體的相互作用。檢測抗原特異性Τ細胞W及理解特別是在疾病的發病期間參與 Τ細胞介導的免疫的抗原的表位，為免疫應答的直接調節和疫苗的開發W及對過敏原、自身 免疫疾病和腫瘤的治療提供了基礎。
[0004] 例如，就自身免疫疾病而言，使用對髓銷蛋白表位具有反應性的自身Τ細胞進行免 疫治療已顯示出對缺失和/或負調控髓銷反應性Τ細胞W及為患有多發性硬化癥(MS)的患 者提供潛在的臨床有益效果有效。然而，每位患者的T細胞免疫治療必須是個性化的，因為 此類自身反應性T細胞的T細胞受體在不同MS患者之間的表位特異性上存在高度變化和差 異（Vandevyver等，Eur. J. Immunol.，1995年，第25卷，第958-968頁；Wuche;rpfennig等， J. Immunol .，1994年，第 152卷，第5581-5592頁；Hong等，J. Immunol .，1999年，第 163卷，第 3530-3538頁）。
[0005] 除每位患者的個性化之外，針對自身免疫疾病的T細胞免疫治療的成功制造需要 檢測自身反應性T細胞和鑒定自身反應性T細胞結合的表位。對抗原的免疫刺激表位進行作 圖和克隆治療用途的T細胞的標準方法設及抗原引發(通常設及T細胞與抗原一起溫育），然 后是將單個細胞接種至96孔板。然后擴大培養細胞，并通過耗力、耗時的工藝篩選具有覆蓋 抗原的單個膚的克隆分析膚特異性。然后使用免疫刺激陽性的膚表位測試獲得和擴大用于 T細胞免疫治療的克隆T細胞系。
[0006] 還開發了增強宿主對腫瘤、病毒和細菌病原體的免疫應答的細胞治療方法。運些 細胞治療方法通常還設及腫瘤或病原體相關抗原特異性自身T細胞的體外活化和擴大。運 些類型治療的例子包括腫瘤侵潤淋己細胞（TIL)(參見授予Rosenberg的美國專利No. 5， 126,132)、胞毒T細胞(參見授予化i等的美國專利No.6,255,073和授予Celis等的美國專利 齡.5,846,827)、擴大腫瘤引流淋己結細胞(參見授予了61111曰11的美國專利齡.6,251，385)和 各種其它淋己細胞制劑(參見授予Bell等的美國專利No.6,194,207、授予Ochoa等的美國專 利No. 5,443,983、授予Riddell等的美國專利No. 6,040,177、授予Balibitt等的美國專利 No. 5,766,920)的使用。
[0007] 然而，易于從患者獲得的樣品中此類抗原特異性T細胞的頻率很低。例如，MS患者 外周血中自身反應性T細胞的頻率為大約105個外周血單核細胞中存在1個至106個外周血單 核細胞中存在1個（Ota等，1990年，Nature,第346卷，第183-187頁；Martin等，1990年， J. Immunol.第145卷，第540-548頁）。運在T細胞產品的制造期間對患者樣品篩選自身反應 性τ細胞時提出了挑戰，因為120ml抽血的典型產率為總共約1億個Τ細胞。
[0008] 為此，需要足夠靈敏的分析法來檢測稀有反應性Τ細胞和鑒定該稀有反應性Τ細胞 W強烈方式對其應答的免疫刺激表位。
[0009] 發明概述
[0010] 本文提供了檢測樣品中的抗原特異性Τ細胞和鑒定抗原的免疫刺激表位的方法。 如本文所公開，研究了多種開發此類分析的方法，獲得了出乎意料的結果:Τ細胞的大量培 養物仍然是存活的。因此，本文所公開的優選的分析形式利用包含Τ細胞的樣品的"大量培 養物"，其中該樣品W高濃度和密度與表位庫一起培養，其中該庫優選地包含自身抗原的重 疊膚。
[0011] -般來講，檢測抗原特異性Τ細胞和鑒定該抗原特異性Τ細胞對其應答的免疫刺激 表位的方法包括：（a)使用表位庫體外引發至少一種來自受試者的包含Τ細胞的樣品的大量 培養物，該表位庫包含一個或多個膚，其中該表位庫中的每個膚是抗原的獨特片段；（b)使 用表位庫再刺激大量培養物一段時間，W足W允許對表位庫中的至少一個膚特異的T細胞 釋放可檢測的至少一個活化細胞因子，W及(C)檢測所述大量培養物中是否存在所述至少 一個活化細胞因子;其中所述培養物中存在所述至少一個活化細胞因子檢測對抗原特異的 T細胞，并且將表位庫中的一個或多個膚跨越的抗原區域鑒定為包含抗原特異性T細胞對其 應答的免疫刺激表位。在一個實施方案中，可利用多種大量培養物進一步限縮結果，并允許 進行統計分析。在一個優選的實施方案中，表位庫包含至少兩個膚，每個膚與表位庫中的至 少一個其它膚共有重疊氨基酸序列同一性的區域，并且表位庫中的膚一起跨越抗原的鄰接 區域。
[0012] 在一個實施方案中，該方法包括：（a)使用來自文庫的獨特表位庫體外引發來自受 試者的包含T細胞的樣品的多種大量培養物中的每種，該文庫包括至少兩個表位庫，其中文 庫中的每個表位庫包含一個或多個膚，每個膚包含抗原的獨特片段，（b)使用表位庫再刺激 每種包含T細胞的大量培養物(該培養物使用該表位庫引發)一段時間，W足W允許對表位 庫中的至少一個膚特異的活化T細胞釋放可檢測的至少一個活化細胞因子，W及(C)檢測所 述多種大量培養物中的每種中是否存在活化細胞因子，其中大量培養物中存在活化細胞因 子檢測對抗原特異的T細胞，并且將用于引發和再刺激大量培養物的表位庫中的一個或多 個膚跨越的抗原區域鑒定為包含T細胞對其應答的免疫刺激表位。在一個優選的實施方案 中，表位庫包含至少兩個膚，每個膚與表位庫中的至少一個其它膚共有重疊氨基酸序列同 一性的區域，并且表位庫中的膚一起跨越抗原的鄰接區域。在一個實施方案中，表位庫的文 庫包括跨越抗原的至少1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95% 或99 %的膚。
[0013] 在一個實施方案中，大量培養物包含在約2xl05個細胞/mL/mm3至約2xl06個細胞/ mL/mm3之間。在一個實施方案中，大量培養物包含在約4xl05個細胞/mL/mm 3至約IxlO6個細 胞/mL/mm3之間。在一個優選的實施方案中，大量培養物包含約5xl05個細胞/mL/mm 3。
[0014] 樣品優選地得自哺乳動物。在一個實施方案中，樣品得自曬齒動物。在一個優選的 實施方案中，樣品是人類樣品。在另一個實施方案中，樣品還包含抗原呈遞分子，該抗原呈 遞分子是可溶解的或由抗原呈遞細胞表達的。在一個優選的實施方案中，樣品是外周血單 核細胞樣品。在另一個優選的實施方案中，樣品是人類外周血單核細胞。
[0015] 在一個優選的實施方案中，樣品得自患有疾病的患者，并且抗原與疾病相關。在一 個實施方案中，疾病是感染性疾病，并且抗原從與疾病相關的感染性病原體分離。在另一個 實施方案中，疾病是癌癥，并且抗原是與腫瘤相關的或腫瘤特異性抗原。在一個優選的實施 方案中，疾病是自身免疫疾病，并且抗原是與自身免疫疾病相關的自身抗原。最優選地，疾 病是多發性硬化癥，并且抗原是髓銷蛋白。在一個實施方案中，髓銷蛋白選自由W下組成的 組:髓銷堿性蛋白、蛋白脂質蛋白、髓銷少突膠質細胞蛋白W及它們的組合。
[0016] 在某些實施方案中，膚庫中的每個膚的長度為約10至約20個氨基酸，優選地長度 為約16個氨基酸。在另一個實施方案中，每個膚庫包含一個或多個膚。在一個實施方案中， 每個膚庫包含至少兩個膚，并且所述膚之間的重疊氨基酸區域的長度為約4至約16,優選地 12個氨基酸。
[0017] 在一個實施方案中，使用表位庫引發大量培養物至少1至10天。在一個優選的實施 方案中，使用表位庫引發大量培養物至少5天。
[0018] 在一個實施方案中，在存在另外的抗原呈遞細胞或膚裝載人工APC的情況下，使用 表位庫再刺激大量培養物至少12天。在一個優選的實施方案中，使用表位庫再刺激大量培 養物至少1天。
[0019] 在一個實施方案中，活化細胞因子選自由W下組成的組：化-2、化-4、化-5、化-9、 比-10、比-13、比-17、比-18、比-21、化-22、比-35、TN化和IFN 丫。在一個優選的實施方案中， 活化細胞因子是IFN 丫。在另一個實施方案中，檢測步驟包括檢測是否存在兩個活化細胞因 子，例如IFN 丫和TNFa、IFN 丫和IL-6或TN化和IL-6。在一個優選的實施方案中，一個或多個 活化細胞因子通過選自流式細胞分析、酶聯免疫吸附試驗化LISA)、基于微珠的多重分析和 細胞因子捕集分析的方法檢測。最優選地，活化細胞因子通過化ISA檢測。在另一個實施方 案中，一個或多個活化細胞因子通過基于微珠的多重分析檢測。
[0020] 本文還公開了制備用于治療疾病的組合物的方法，該方法包括：（a)根據本文所公 開的方法檢測患有疾病的患者中的抗原特異性T細胞和鑒定抗原特異性T細胞對其應答的 免疫刺激表位，其中包含T細胞的樣品從患者分離，W及(b)使用所鑒定的免疫刺激表位增 殖從患者分離的T細胞。在一個實施方案中，疾病是癌癥，并且抗原是癌癥的腫瘤相關或腫 瘤特異性抗原。本文還公開了所制備的T細胞的組合物，W及此類組合物用于疾病諸如癌癥 的治療方法的用途。此類用途包括給患有癌癥的患者施用治療有效量的包含T細胞的組合 物。
[0021] 在一個實施方案中，制備用于治療疾病的組合物的方法還包括最后一個步驟(C) 使所增殖的T細胞減弱。在一個實施方案中，疾病是自身免疫疾病，并且抗原是與自身免疫 疾病相關的自身抗原。在一個優選的實施方案中，自身免疫疾病是多發性硬化癥，并且自身 抗原選自由W下組成的組:髓銷堿性蛋白、蛋白脂質蛋白和髓銷少突膠質細胞蛋白。本文還 公開了所制備的T細胞的組合物，W及此類組合物用于疾病諸如自身免疫疾病的治療方法 的用途。在一個優選的實施方案中，將包含根據本文所公開的方法制備的減弱T細胞的組合 物用于治療自身免疫疾病。此類用途包括給患有自身免疫疾病的患者施用治療有效量的減 弱T細胞。在一個優選的實施方案中，自身免疫疾病是多發性硬化癥，并且自身抗原選自由 W下組成的組:髓銷堿性蛋白、蛋白脂質蛋白和髓銷少突膠質細胞蛋白。
[0022] 附圖簡述
[0023] 圖1:第4天CMV pp65誘導IFN 丫應答(PBMCW兩個密度接種）
[0024] 圖2:第6天CMV pp65誘導IFN丫應答(PBMCW兩個密度接種）
[0025] 圖3:抗髓銷膚WN丫活性(使用MS供體011034 PBMC作為應答細胞）
[0026] 圖4:抗髓銷膚WN丫活性(使用MS供體011054 PBMC作為應答細胞）
[0027] 圖5:對免疫顯性破傷風毒素膚表位的應答:直接體外培養對5天微量培養，然后進 行IFN 丫化ISpot。數據W四個平行ELISpot孔的平均值+SD表示。
[00%]圖6.第6天通過IFN 丫化Ispot檢測的健康供體03106抗髓銷膚免疫。數據W四個平 行化Ispot孔的平均值+SD表示。CTRLs:陰性對照。
[0029] 圖7:第6天通過IFN 丫化ISpot檢測的健康供體03106抗髓銷膚免疫。數據W四個平 行化ISpot孔的平均值+SD表示。CTRLs:陰性對照。
[0030] 圖8:第6天通過IFN 丫化ISpot檢測的MS供體03102抗髓銷膚免疫。數據W四個平行 ELI Spot孔的平均值+SD表示(左圖板分析1，右圖板分析2)。CTRLs:僅培養基中的細胞。
[0031] 圖9:第6天通過IFN 丫化ISpot檢測的MS供體03103抗髓銷膚免疫。數據W四個平行 ELI Spot孔的平均值+SD表示(左圖板分析1，右圖板分析2)。CTRLs:僅培養基中的細胞。
[0032] 圖10:接種密度和解離步驟對MOGmie膚庫的陽性免疫檢測的影響。未處理:在微量 管和化ISpot分析中不存在膚的情況下培養的PBMC。數據W化ISpot分析中接種的四個平行 孔的平均值+SD表示。
[003引圖11 :ELISpot"斑點"的形狀和大小分布-高頻、高反應性T細胞的粗略定量。所有3 個孔使用相同的設置計數。
[0034] 圖12 :MS供體03171-化ISpot與細胞化ISA的髓銷膚庫的陽性應答檢測比較。交叉 影線條表示大于分析的檢測上限的細胞化ISA數據點，因此表示未正式定量的陽性應答。 CTRk對照。
[0035] 圖13 :MS供體03172-化ISpot與細胞化ISA的髓銷膚庫的陽性應答檢測比較。交叉 影線條表示大于分析的檢測上限的細胞化ISA數據點，因此表示未正式定量的陽性應答。 CTRk對照。
[0036] 詳述
[0037] 本發明提供檢測樣品中的抗原特異性T細胞和鑒定該T細胞對其響應的和/或特異 的抗原的一個或多個免疫刺激表位的方法。本文公開了出乎意料的發現，免疫細胞的大量 培養物，例如其中細胞W高密度、彼此接近培養的大量培養物，在與免疫刺激表位接觸時， 提供了有利于培養物中的稀有抗原特異性免疫細胞的可檢測活化的環境。本文所公開的方 法通常包括使用包含一個或多個膚的表位庫體外引發包含T細胞的樣品的大量培養物。使 用表位庫再刺激包含T細胞的大量培養物，W允許對表位庫中的一個或多個膚特異的T細胞 分泌可檢測水平的活化細胞因子。此類活化細胞因子的檢測與樣品中活化T細胞的檢測W 及確定表位庫中的膚跨越的抗原區域包含活化T細胞的免疫刺激表位有關。
[0038] 免疫系統的T細胞識別結合到抗原呈遞分子例如曬齒動物中的主要組織相容性復 合體(MHC)或人類中的人類白細胞抗原化LA)、在抗原呈遞細胞(APC)上表達的膚。T細胞的 抗原識別特異性由多個參數定義：1)Τ細胞受體與結合到抗原呈遞分子的膚的親和力;2)抗 原膚的一級序列;和3)抗原膚內某些氨基酸組合的協同增強效應。通常認為，高水平的抗原 特異性是Τ細胞活化的特征。因此，如本文所用，抗原特異性Τ細胞是指特異性抗原或其免疫 刺激表位活化的τ細胞。
[0039] 如本文所用，"表位"包括能夠特異性結合到與抗原呈遞分子相關的Τ細胞受體的 抗原的任何膚片段。表位決定子通常為分子的化學活性表面基團，諸如氨基酸或糖側鏈，并 且通常具有特定的Ξ維結構特征W及特定的電荷特征。如本文所用，"免疫刺激表位"包括 不僅能夠特異性結合到免疫細胞受體，而且在結合時能夠活化免疫細胞例如Τ細胞的抗原 的任何膚片段。
[0040] 普通技術人員將認識到，Τ細胞的活化通常引起增殖。因此，使用本文所述的表位 庫引發和再刺激包含Τ細胞的樣品均會刺激Τ細胞的增殖。
[0041 ]如本文所用，"引發"是指獲得性免疫細胞及其特異性抗原之間的初始接觸。因此， 體外引發是指使用表位初始體外刺激Τ細胞。在一個優選的實施方案中，使用膚庫引發(例 如接觸、溫育、培養等)Τ細胞至少24小時，并且優選地至少約2至10天。最優選地，使用膚庫 引發Τ細胞5天。
[0042] -旦使用抗原(或其表位）引發免疫細胞，則隨后免疫細胞和抗原之間的接觸在本 文中即可稱為"再刺激"。在優選的實施方案中，使用膚庫再刺激(例如接觸、溫育、培養等)Τ 細胞至少2小時，并且優選地至少12小時或更長，例如24、48或72小時。最優選地，使用膚庫 再刺激Τ細胞約1天。
[0043] 在本發明的另一個方面，使從所關注的受試者分離的包含Τ細胞的樣品與根據本 文所述的方法鑒定的免疫刺激表位接觸，W增殖衍生表位的對抗原特異的Τ細胞。在一個實 施方案中，使樣品與免疫刺激表位接觸約3至14天，并且優選地至少5天。最優選地，使樣品 與免疫刺激表位接觸一段足W提供治療有效量的Τ細胞的時間。
[0044] 大量培養物
[0045] 在本發明的一個方面，使包含Τ細胞的樣品的大量培養物與膚接觸，W允許Τ細胞 的體外引發和/或再刺激。如本文所用，"大量培養物"是指在高濃度和密度下培養細胞。此 類高濃度和密度可W例如使用少量培養基和培養管而不是平底或U型底平板或培養瓶實 現。例如，與1Χ106個細胞/ImL接種于24孔板相比，可接種于1.5mL培養管中，W增加細胞的 密度。在示例性實施方案中，將至少1X106個細胞，優選地至少2.5X106個細胞，W及最優選地 至少3X106個細胞懸浮于至少ImL，優選地至少1.5mL培養基中，并且在小培養管諸如1.5mL 培養管，W及最優選地5mL培養管中培養。
[0046] 在一個優選的實施方案中，樣品的大量培養物包含約2xl05個細胞/mL/mm3至約 2xl06個細胞/mL/mm3。在一個實施方案中，大量培養物包含在約4xl05個細胞/mL/mm 3至約 IxlO6個細胞/mL/mm3之間。在一個優選的實施方案中，大量培養物包含約5xl0 5個細胞/mL/ mm3。除使用大量培養物之外，還將標準技術用于如本文所述的細胞培養(例如，使用膚引 發、再刺激和增殖T細胞）。
[0047] 包含T細胞的樣品和/或T細胞可從任何哺乳動物例如曬齒動物、人等分離。在一個 優選的實施方案中，樣品從患有疾病或提供人類疾病的模型的哺乳動物分離。在更優選的 實施方案中，樣品從人類，最優選地從患有疾病諸如但不限于:感染性疾病、癌癥或自身免 疫疾病的人類分離。
[0048] 包含T細胞的樣品和/或T細胞可W哺乳動物的新鮮樣品，從哺乳動物細胞的體外 培養物，從細胞的冰凍樣品等分離。合適的樣品可包括例如血液、淋己、淋己結、脾臟、肝臟、 腎、膜腺、扁桃體、胸腺、關節、滑液W及衍生τ細胞的其它組織。在一個優選的實施方案中， 包含Τ細胞的樣品W外周血單核細胞(PBMC)分離。PBMC可W例如通過離屯、（例如，從血沉棟 黃層），通過密度梯度離屯、(例如，通過Fi C011 -Hypaque)，通過淘選，親和分離，細胞分選(例 如，使用一個或多個細胞表面標記物特異性抗體），W及提供PBMC和/或T細胞富集的其它技 術部分純化。
[0049] 在一個示例性實施方案中，PBMC通過標準Fi CO11-Hypaque法從血液樣品分離。血 液樣品使用肝素處理，并經受Ficoll溶液處理。在離屯、后，可W例如在PBS或T細胞培養基 (例如，補充有2mM k谷氨酷胺、10化g/ml青霉素/鏈霉素、ImM丙酬酸鋼和15%混合人血清 的RPMI 1640;AIM-V;0pTimizer CTS等）中洗涂回收的細胞。可使用熟知的技術將洗涂的細 胞重懸于細胞培養基并置于培養管中，形成如本文所述的大量培養物。在一個優選的實施 方案中，本文所公開的方法包括引發濃度和密度為約4.0乂105個口81(：/111171111113至約2乂10 6個 PBMC/mL/mm3的外周血單核細胞的大量培養物。在一個優選的實施方案中，本文所公開的方 法包括引發濃度和密度為約4.5X105個PBMC/mL/mm3的包含T細胞的外周血單核細胞的大量 培養物。
[0050] 膚、表位庫和文庫
[0051] 如上文所述，本文所公開的方法包括在引發和再刺激步驟期間溫育包含T細胞的 樣品W及膚(例如該膚可W是表位庫的一部分）的大量培養物。一般來講，膚的長度可W為 約9個氨基酸至約20個氨基酸或更多。在一個優選的實施方案中，膚為約16個氨基酸。表位 庫或表位文庫中的每個膚可W是抗原的獨特片段，例如與抗原的鄰接片段共有氨基酸序列 同一性。在一個實施方案中，每個膚與抗原的鄰接片段共有至少75%，例如約80%、90%、 95 %、97 %、98 %、99 %或100 %序列同一性，所述片段的長度可W為至少7個氨基酸，并且小 于抗原的全長。
[0052] 膚可W衍生自任何合適的抗原。在某些實施方案中，抗原為至少約4千道爾頓 化D)，至少約化D，或至少約lOkD。合適的抗原可包括例如衍生自傳染原的抗原、與自身免疫 疾病相關的抗原、各種與癌癥相關的腫瘤相關或腫瘤特異性抗原等。
[0053] 在示例性實施方案中，抗原是具體癌癥相關的腫瘤相關或腫瘤特異性抗原，包括 但不限于:細胞角蛋白，特別是細胞角蛋白8、18和19;上皮細胞膜抗原化MA);人類胚胎抗原 化EA-125);人乳脂肪球諸如18^、18記、86'斗?4、17-^、〔26和1'16;肌間線蛋白；肌特異性 肌動蛋白；胎盤堿性憐酸酶;β-人絨毛膜促性腺激素；曰-胎兒球蛋白；前列腺特異性抗原 (PSA);結腸腺癌的癌胚抗原;ΗΜΒ-45;嗜銘粒蛋白-Α;突觸小泡蛋白、酪氨酸酶等。
[0054] 在另外的示例性實施方案中，抗原衍生自病原體。非限制性例子包括單純瘤疹-2 病毒VP16、破傷風毒素、流感血凝素 、HIV gag蛋白、細胞巨化病毒ρρ65、皿V表面抗原W及其 它的病毒包膜和外殼蛋白等。
[0055] 在優選的實施方案中，抗原是與自身免疫疾病相關的自身抗原。自身抗原的非限 審雌例子包括髓銷堿性蛋白、蛋白脂質蛋白、髓銷少突膠質細胞蛋白、水通道蛋白4、血小板 膜糖蛋白Hb-IIIa和化-IX、膜島素、前膜島素、谷氨酸脫簇酶(640)、64065、64067、熱激蛋 白65化sp65)、膜島細胞抗原69QCA69)、膜島細胞抗原相關蛋白-酪氨酸憐酸酶(PTP)、GM2- 1神經節巧脂、T巧69、膜島細胞蛋白酪氨酸憐酸酶及其衍生的37-kDa自身抗原(包括IA-2)、 福格林(Phogrin)、人軟骨細胞糖蛋白-39、膠原、Π 型膠原、軟骨鏈蛋白、埃茲蛋白、根蛋白、 膜突蛋白、分枝桿菌熱激蛋白6、橋粒忍糖蛋白、i3-2-GPI、Ku(p70/p80)自身抗原或其80-kd 亞基蛋白、核自身抗原La( SS-B)和Ro (SS-A)、蛋白酶體β-型亞基C9、中屯、體自身抗原PCM-1、 多發性肌炎-硬皮病自身抗原(PM-Scl)、自身抗原CENP-A、肌、核仁U3-和化(7-2)核糖核蛋 白、核糖體蛋白L7、hPopl、來自核基質抗原的36-kd蛋白、甲狀腺過氧化物酶和甲狀腺刺激 激素受體、人TSH受體、乙酷膽堿受體、肌肉受體激酶或任何其它合適的自身抗原。
[0056] 對于長抗原而言，可將重疊膚分選到膚庫，形成至少兩個膚庫的文庫。膚庫通常包 括一個或多個膚。在一個實施方案中，表位庫的文庫包括一起跨越抗原的至少1%、1〇%、 20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95% 或99% 的膚。在一個優選的實施方案 中，表位庫的文庫包括跨越抗原的至少90%，更優選地至少95%，W及最優選地至少98%的 膚。
[0057] 膚庫中的膚通常(但不一定)具有約兩個和約十五個或更多個氨基酸殘基之間的 重疊（即，共有氨基酸序列同一性的區域）。在一個優選的實施方案中，膚庫的膚重疊至少四 個氨基酸。在另一個實施方案中，膚庫的膚重疊約10個氨基酸。在一個優選的實施方案中， 重疊膚重疊約12個氨基酸。例如，膚V'可W是抗原的殘基1至16,膚"η+Γ可W是抗原的殘 基4至20等。然而，技術人員將會知道，膚的長度和膚之間重疊的殘基的數量可根據抗原的 長度和/或所關注的區域、所需的分辨度等而變化。
[0058] 將膚分選到庫的依據可W是變化的，如技術人員所理解。例如，在一個實施方案 中，提供至少約2或約3至約8個重疊膚的庫（例如，跨越抗原的鄰接區域）。在一個實施方案 中，提供2個重疊膚的庫。在優選的實施方案中，提供至少6個重疊膚的庫。
[0059] 在其它實施方案中，根據任何其它合適的依據將膚分選到庫，使得每個庫中的膚 是已知的或可確定的。在一個實施方案中，將膚分選到庫，使得庫中的膚一起跨越抗原的獨 特和鄰接區域。在另一個實施方案中，將膚進行另外分選，不僅使得庫中的膚一起跨越抗原 的獨特和鄰接區域，而且使得第一庫中的至少一個膚與第二庫中的至少一個膚共有重疊氨 基酸序列同一性區域，并且第一和第二庫中的膚一起跨越抗原的鄰接區域，該鄰接區域包 含第一庫中的膚跨越的抗原的鄰接區域和第二庫中的膚跨越的抗原的鄰接區域二者。
[0060] 在任一個實施方案中，膚可W多種方式制備。例如，膚可使用自動化膚合成儀合 成。膚也可人工合成。或者，膚可通過蛋白水解裂解(例如，通過膜蛋白酶、膜凝乳蛋白酶、木 瓜蛋白酶、V8蛋白酶等)或特異性化學裂解(例如，通過漠化氯)生成。膚也可通過重疊核酸 序列的體內或體外表達合成，每條核酸序列編碼特定的膚。
[0061] 膚任選地可在接觸包含Τ細胞的樣品的大量培養物之前分離和純化。合適的方法 包括例如色譜法(例如，離子交換色譜法、親和色譜法、大小排阻柱色譜法、高壓液相色譜法 等）、離屯、法、差示溶解度法或任何其它合適的膚或蛋白質純化技術。在某些實施方案中，膚 可W是標記的（例如，放射性標記、發光標記、化學發光標記、親和標記等），W便有利于膚的 純化。
[0062] 在另一個方面，提供鑒定候選免疫刺激表位的方法。在某些實施方案中，候選免疫 刺激表位可使用計算機執行算法進行候選表位鑒定。此類計算機程序包括例如TEPIT0PE程 序（參見例如，Hammer等，Adv . Immunol，第66卷，第67-100 頁，1997年；Sturniolo等， 化t.Biotechnol.，第 17卷，第555-561 頁，1999年;Manici等，J Exp.Med.，第 189卷，第871- 876頁，1999年;de Lalla等，J.Immunol.，第 163卷，第 1725-1729頁，1999年;Cochlovius等， J. Immunol.，第165卷，第4731-4741頁，2000年；運些文獻的公開內容W引用方式并入本 文），W及其它計算機執行算法。
[0063] 用于候選表位鑒定的計算機執行算法可鑒定例如單個蛋白質、大型蛋白質、相關 蛋白質的組(例如，同源物、直系同源物或多態性變體）、不相關的蛋白質的混合物、組織或 器官的蛋白質或生物體的蛋白質組中的候選表位。除分析已知候選分子祀標之外，使用此 方法還可根據表達蛋白質的序列信息查詢復合組織或生物體(例如，從推導開放閱讀框或 cDNA文庫查詢），是鑒定潛在T細胞表位的有效、靈敏、特異性方法。
[0064] 在鑒定候選表位后，可形成一個或多個候選表位對應的膚或膚庫。例如，一定鑒定 出候選表位，即可制備跨越候選表位或其部分的重疊膚，W確認刺激T細胞，W及（如有需 要)限縮該表位的鑒定結果。或者，可制備包括多個候選表位的膚庫，該候選表位使用計算 機執行算法進行候選表位鑒定。
[0065] 使用膚刺激包含T細胞的大量培養物
[0066] 在另一個方面，使包含T細胞的樣品的大量培養物與膚庫接觸，W確定庫中的至少 一個膚是否W表位特異性方式結合和刺激T細胞。此類接觸可在引發、再刺激和增殖步驟之 間進行。在一些實施方案中，使用多種大量培養物。
[0067] -般來講，使用膚培養從所關注的受試者分離的包含T細胞的樣品的大量培養物， 該膚可處于膚庫中，該膚庫是膚庫的文庫的一部分。在一個優選的實施方案中，大量培養物 還包含抗原呈遞分子，該抗原呈遞分子是可溶解的或由細胞表達的，該細胞能夠在從受試 者分離的T細胞的準確環境中呈遞膚。
[0068] 在一些實施方案中，T細胞在存在表位或免疫刺激表位庫的情況下在T細胞培養基 中引發、再刺激、增殖、培養、接觸、溫育等約1至10天之間或更長，W刺激衍生表位的抗原特 異性T細胞的增殖。培養基任選地可補充用于T細胞的培養和/或生存的其它組分(例如，血 清、抗生素、細胞因子、共刺激受體激動劑等）。
[0069] 使包含T細胞的樣品在合適的結合條件下與膚庫/免疫刺激表位接觸。在一個實施 方案中，結合條件為37°C、在任何合適的T細胞培養基（例如，RPMI 1640、AIM-V、0pTmizer CTS培養基）、憐酸鹽緩沖鹽水、Dulbecco憐酸鹽緩沖鹽水、Dulbecco改良Eagle培養基、 Iscove培養基等中。培養基可補充有用于T細胞的培養和/或生存的其它組分(例如，血清、 抗生素、細胞因子等）。膚的適當濃度可通過滴定確定。在一個實施方案中，膚庫中的每個膚 或免疫刺激表位W約化g/mL至約l(K)yg/mL的最終濃度添加。在一個實施方案中，特別是對 于在呈遞之前不需要進一步加工的膚，每個膚W20和200ng/mL之間的濃度添加。對于大型 膚而言，每個膚W約1 Oyg/mL至約50yg/mL，最優選地20yg/mL的濃度添加。
[0070] 抗原特異性T細胞的檢測及其免疫刺激表位的鑒定
[0071] 抗原特異性T細胞及其結合的免疫刺激表位可通過T細胞活化檢測鑒定。通過比較 包含來自受試者的T細胞的樣品的不同大量培養物與不同的膚庫接觸時的活化狀態，可鑒 定包含抗原的免疫刺激表位的一個或多個膚庫。在一個實施方案中，大量培養物中活化T細 胞的檢測將使用大量培養物溫育的表位庫中的膚跨越的抗原區域鑒定為包含活化T細胞的 免疫刺激表位。
[0072] 在某些實施方案中，進行一個或多個另外的篩選輪次(或循環），其中使用所鑒定 的一個或多個膚庫中的單個膚篩選包含T細胞的樣品的大量培養物。通過單個膚的分析，可 將一個或多個免疫刺激表位鑒定為一個或多個膚，或一個或多個膚的一部分。在相關的實 施方案中，可任選地合成另外的膚，W進一步定義一個或多個表位。例如，可制備截短的膚， W限縮表位的鑒定。
[0073] T細胞活化可使用熟知的方法確定，W檢測和/或測定任何多個標準活化依據(例 如，T細胞增殖的測定，活化細胞因子的釋放，細胞表面活化標記物的表達等）（參見例如， Novak等，J. Immunol .，第166卷，第6665-6670頁，2001年；Kwok等，J. Immunol .，第164卷，第 4244-4249頁，2000年；Fraser等，Immunology Today，第 14卷，第357頁，1993年；Novak等， International Immunology，第13卷，第799頁，2001年;運些文獻的公開內容W引用方式并 入本文。）。
[0074] 在一個優選的實施方案中，活化通過檢測熟知的活化細胞因子的存在確定。非限 制性例子包括比-2、比-4、化-5、比-9、IL-10、IL-13、IL-17、IL-18、IL-21、IL-22、IL-35、TNF α和IFN 丫，例如IL-2JFN 丫、TN化等。在一個優選的實施方案中，活化通過檢測單個活化細 胞因子優選地IFN 丫的存在確定。
[0075] 在另一個實施方案中，活化通過檢測至少第二熟知的活化細胞因子的存在確定。 優選地，通過第一活化細胞因子的活化水平是否低于被視為存在的闊值來檢測是否存在第 二活化細胞因子。在此類實施方案中，活化可通過檢測是否存在第一和第二活化細胞因子 來確定。
[0076] 活化細胞因子的活化水平可通過與陰性對照培養物，例如使用陰性對照膚或不使 用膚溫育的樣品的大量培養物的比較確定。一般來講，活化細胞因子的活化水平可通過根 據本文所公開的方法引發和再刺激的大量培養物的上清液中活化細胞因子的濃度與作為 陰性對照溫育的樣品的大量培養物的上清液中活化細胞因子的濃度的比較來確定。活化水 平可通過與陰性對照相比的倍數增加來確定，例如濃度增加1.5倍可視為活化水平為1.5， 與陰性對照相比增加10倍可視為活化水平為10等。在一個實施方案中，如果活化細胞因子 的活化水平為至少約1.2，例如約1.5、約1.8、約2、約2.5、約5、約7.5，優選地至少約10，則確 定該活化細胞因子存在。在另一個實施方案中，如果第一活化細胞因子和第二活化細胞因 子的累積活化水平達到至少約1.2，例如約1.5、約1.8、約2、約2.5、約5、約7.5，優選地至少 約10,則確定第一和第二活化細胞因子存在。
[0077] 在示例性實施方案中，使用酶聯抗體，例如酶聯免疫吸附斑點分析化LISPOT)和酶 聯免疫吸附分析化LISA)檢測是否存在活化細胞因子。在一個優選的實施方案中，活化使用 ELISA確定。在另一個優選的實施方案中，使用基于微珠的分析檢測是否存在活化細胞因 子。
[0078] 包含活化T細胞的組合物W及使用該組合物治療疾病的方法
[0079] 在檢測受試者中的抗原特異性T細胞和鑒定該細胞應答的免疫刺激表位時，免疫 刺激表位可用于制備包含抗原特異性T細胞的組合物的方法，例如用于治療疾病。
[0080] 因此，本文提供了制備包含抗原特異性T細胞的組合物的方法，該方法包括：（a)根 據本文所公開的方法檢測患有疾病的患者中的抗原特異性T細胞和鑒定抗原特異性T細胞 對其應答的免疫刺激表位，其中包含T細胞的樣品從患者分離，W及(b)使用所鑒定的免疫 刺激表位增殖從患者分離的T細胞。在一個實施方案中，增殖T細胞從而得到治療有效量的 施用給需要其的患者的T細胞。
[0081 ]"治療有效量"或"有效量"意指，當施用給受試者用于治療疾病、病癥或病狀時，組 合物、化合物、療法或療程的量足W實現此類疾病、病癥或病狀的治療。"治療有效量"將根 據組合物、化合物、療法、療程、疾病、病癥或病狀及其嚴重性W及待治療的受試者的年齡、 體重等而變化。在另一個實施方案中，方法還包括最后一個步驟:使T細胞減弱的步驟。
[0082] 本文還提供了根據上述方法制備的包含抗原特異性T細胞的組合物。在一個實施 方案中，組合物包含減弱的抗原特異性T細胞。在一個優選的實施方案中，組合物包含治療 有效量的抗原特異性T細胞(可W是減弱的），W治療選自癌癥、感染性疾病和自身免疫疾病 的疾病。
[0083] 技術人員將認識到，此類組合物可具有治療癌癥和感染性疾病W及（當T細胞減弱 時）自身免疫疾病的特定用途。此類方法包括將治療有效量的本文提供的包含抗原特異性T 細胞的組合物施用于需要其的患者。對于運些組合物而言，根據本文所述的方法檢測抗原 特異性T細胞和鑒定免疫刺激表位，其中該抗原與疾病相關。在優選的實施方案中，用于引 發、再刺激和增殖步驟的包含T細胞的樣品從待治療的患者分離，使得所施用的組合物包含 自身Τ'細胞。
[0084] 在一個實施方案中，患者患有癌癥，根據本文所公開的方法鑒定的免疫刺激表位 衍生自癌癥相關的腫瘤相關或腫瘤特異性抗原。特別關注的癌癥是呈遞腫瘤相關或腫瘤特 異性抗原的那些癌癥。此類抗原可呈遞于異常環境中，通常具有高水平，或可W是突變形 式。腫瘤抗原特異性自身Τ細胞可作為響應于腫瘤細胞的宿主Τ細胞對其應答的一部分施 用。
[0085] 腫瘤抗原的例子是細胞角蛋白，特別是作為癌抗原的細胞角蛋白8、18和19。上皮 細胞膜抗原化ΜΑ)、人類胚胎抗原化ΕΑ-125)、人乳脂肪球、MBrl、M化8、Ber-EP4、17-lA、C26 和T16也是已知的癌抗原。肌間線蛋白和肌特異性肌動蛋白是肌原肉瘤的抗原。胎盤堿性憐 酸酶、0-人絨毛膜促性腺激素和α-胎兒球蛋白是滋養層和生殖細胞腫瘤的抗原。前列腺特 異性抗原是前列腺癌的抗原、結腸腺癌的癌胚抗原。ΗΜΒ-45和酪氨酸酶是黑素瘤相關的抗 原。嗜銘粒蛋白-Α和突觸小泡蛋白是神經內分泌和神經外胚層腫瘤的抗原。特別要關注的 是形成具有壞死區域的實質性腫塊的侵潤性腫瘤。
[0086] 多種常規的癌癥療法諸如化學療法和放射療法顯著減少了淋己細胞群體。雖然受 試者治療可在一定程度上緩解此免疫抑制，但在受試者治療之前或之后優選的組合療程將 使用此類淋己毒性治療。
[0087] 上述組合物也可作為響應于病原體的宿主應答的一部分施用。當宿主抗病毒機制 失效時，某些病毒的感染成為慢性的。此類感染可持續多年或甚至受感染宿主的生命期，并 且通常導致嚴重的疾病。顯著發病和早期死亡相關的慢性感染包括兩種人類肝炎病毒：乙 肝病毒化BV)和丙肝病毒化VC)的感染，該感染導致慢性肝炎、肝硬化和肝癌。其它人類慢性 病毒感染包括人類逆轉錄病毒：人類免疫缺陷病毒化IV-1和HIV-2)的感染（該感染導致 AIDS)和人類嗜Τ淋己球病毒化化V-1和HTLV-2)的感染（該感染導致Τ細胞白血病和骨髓 病）。人類瘤疹病毒包括單純瘤疹病毒化SVH型和2型、愛潑斯坦-己爾二氏病毒巧BV)、細胞 巨化病毒(CMV)、水痘-帶狀瘤疹病毒(VZV)和人類瘤疹病毒6化HV-6)的感染通常不會被宿 主機制根除。當宿主防御機制不能消除時，在細胞內復制的其它感染原，諸如病原性原生動 物，例如錐體蟲、追疾和弓形蟲（T 0 X 0 P 1 a S ma g 0 η d i i );細菌，例如分枝桿菌 (Mycobacteria)、沙口氏菌（Salmonella)和李斯特氏菌(Xisteria);和真菌，例如假絲酵母 (化nd i da)的感染也可成為慢性的。
[0088] 本文所公開的組合物可施用給患有此類慢性病原體感染的患者，其中T細胞是衍 生自病原體的抗原的所鑒定免疫刺激表位特異性的。多種此類抗原是本領域已知的，并且 可通過病原體的分離或通過重組方法表達獲得。例子包括HIV甜120、皿V表面抗原、病毒的 包膜和外殼蛋白等。
[0089] 當上述組合物包含減弱T細胞時，此類組合物也可作為T細胞免疫治療施用給需要 其的患者。在一個實施方案中，患者患有自身免疫疾病，并且根據本文所公開的方法鑒定的 免疫刺激表位衍生自與自身免疫疾病相關的自身抗原。
[0090] 自身免疫疾病的非限制性例子包括多發性硬化癥、類風濕性關節炎、自身免疫葡 萄膜視網膜炎、糖尿病、神經炎、多發性肌炎、牛皮癖、白齋風、斯耶格倫綜合征、自身免疫膜 腺炎、炎性腸疾病(例如，克羅恩氏病(Crohn ' S disease)和潰瘍性結腸炎）、乳糜瀉、腎小球 腎炎、硬皮病、肉樣瘤病、自身免疫甲狀腺疾病(例如，橋本氏甲狀腺炎和格雷夫斯病）、重癥 肌無力、阿狄森氏病(Addison's disease)、尋常型天瘤瘡、原發性膽汁性肝硬化、惡性貧血 和系統性紅斑狼瘡。在一個優選的實施方案中，自身免疫疾病是多發性硬化癥。
[0091 ]用于擴大T-細胞（用于自身免疫疾病的免疫治療）的自身抗原的例子包括但不限 于:髓銷蛋白諸如髓銷堿性蛋白、蛋白脂質蛋白（PLP)W及多發性硬化癥的髓銷少突膠質細 胞糖蛋白。
[0092] 對于硬皮病、全身性硬化和系統性紅斑狼瘡而言，自身抗原包括例如β-2-GPKKu (p70/p80)或其80-kd亞基蛋白、核自身抗原La( SS-B)和Ro (SS-A)、蛋白酶體β-型亞基C9、中 屯、體自身抗原PCM-1、多發性肌炎-硬皮病自身抗原(PM-Scl)、自身抗原CENP-A、呪、核仁U3- 和化(7-2)核糖核蛋白、核糖體蛋白L7、Wopl和來自核基質抗原的36-kd蛋白。
[0093] 對于皮膚的自身免疫疾病而言，可用的抗原包括但不限于:450kD人類表皮自身抗 原、230kD和180kD大瘤性類天瘤瘡抗原、落葉型天瘤瘡抗原(橋粒忍糖蛋白1)、尋常型天瘤 瘡抗原(橋粒忍糖蛋白3)、8口4邑2、8口4邑1、￥11型膠原、癒痕性類天瘤瘡患者子集中的168-40曰 粘膜抗原和218-kd核蛋白（218-kdMi-2)。
[0094] 膜島素依賴性糖尿病相關的自身抗原包括但不限于:膜島素、前膜島素、GAD65和 GAD67、熱激蛋白65化sp65)、膜島細胞抗原69QCA69)、膜島細胞抗原相關蛋白-酪氨酸憐酸 酶(PTP)、GM2-1神經節巧脂、谷氨酸脫簇酶(GAD)、膜島細胞抗原（ICA69)、Τ邱69、膜島細胞 蛋白酪氨酸憐酸酶及其衍生的37-kDa自身抗原(包括ΙΑ-2)和福格林。
[00M]類風濕性關節炎相關的自身抗原包括但不限于:人軟骨細胞糖蛋白-39、膠原、II 型膠原、軟骨鏈蛋白、埃茲蛋白、根蛋白、膜突蛋白和分枝桿菌熱激蛋白6。
[0096] 與自身免疫甲狀腺疾病相關的自身抗原包括：甲狀腺過氧化物酶和甲狀腺刺激激 素受體和人TSH受體的非限制性例子。
[0097] 重癥肌無力相關的自身抗原包括但不限于:乙酷膽堿受體和肌肉受體激酶。 實施例
[0098] 實施例1:培養環境和培養持續時間對誘導抗原特異性T細胞應答的影響評估;在 微量培養后IFN 丫化ISpot作為檢測稀有抗原特異性T細胞的高靈敏度方法評估；W及在培 養第6天檢測抗原特異性免疫和表位表達譜分析建立的常規的化ISA評估。
[0099] 實施例1.1:材料和方法
[0100] 組織培養基
[0101] 將完全化Tmizer CTS培養基化ife Technologies)用于整個方法開發，在使用前 補充2體積％熱減弱混合人AB血清（Val 1 ey Biomedi cal )和^谷氨酷胺化We Technologies)至終濃度2mM。根據制造商的說明，重構培養基的有效期設定為1個月。
[0102] 外周血單核細胞(PBMC)
[0103] 外周血單核細胞(PBMC)從來自Key Biologies,Memphis，TN的健康供體血液成分 分離產物獲得。MS供體的PBMC在臨床地點根據IRB批準的化exa方案0P-BD-007Wl20ml抽血 收集。受試者募集、篩選和抽血在W下兩個臨床地點收集:Dr Gazda, Integra Clinical Research,LLC,San Antonio,ΤΧ和Dr Fox,Central Texas Neurology Consultants,Round Rock,TX。根據化exa方案2005.00(稱為'TERMS'的第化階段臨床試驗)獲得的存檔PBMC也用 于早期方法開發。
[0104] 從血液成分分離和全血富集的PBMC通過將原材料W1: 2稀釋于憐酸鹽緩沖鹽水 (PBS)來存檔，并且將多個30ml稀釋產物的等分試樣加入50ml錐形管，每個錐形管包含15ml Ficoll Hypaque Premium(GE Healthcare) eWSOOg進行Ficoll梯度離屯、20分鐘。從每個管 的界面收集單核細胞、混合、1:5稀釋于PBS中，通過300g離屯、10分鐘洗涂PBMC。將細胞重懸 于50ml PBS中、進行計數并用于方法開發或使用制造商的說明W5xl07或2xl08個PBMC/ml7令 凍保存于CS10冷凍保護劑(BioLife)中。將細胞置于Coo化ox(Biocision)中，保持在2-8°C 下，然后轉移到Coolcell(Biocision)，在-80°C下程控冷凍過夜。將PBMC轉移到蒸氣相液氮 長期儲存。
[0105] 通過在37°C水浴中迅速解凍最多四瓶細胞，從液氮儲存恢復全血或血液成分分離 產物的冷凍儲存PBMC，并稀釋到50ml OpTmizer CTS完全培養基。W250g離屯、細胞10分鐘， 然后重懸于10ml完全化化izer CTS培養基中，然后進行計數，并用于下游方法開發。
[0106] 利用細胞巨化病毒(CMV)回憶應答進行微量培養物分析研究
[0107] 通過血液成分分離從預篩選的化A-A2陽性、抗CMV免疫球蛋白反應性健康供體收 集PBMC。將來自CMV pp65的優化的HLA-A2結合的9-mer膚(化VPMVATV)W200ng/ml的濃度溶 于補充有20IU/ml比-2的完全OpTmizer CTS培養基(R&D systems)中，用于刺激1ml微量管 中的PBMC(1x106/350u1或lxl06/ml)3或5天。通過在培養的第3天或第5天加入200ng/ml膚再 刺激微量培養物。在膚脈沖24小時后，收集上清液，并通過夾屯屯LISA分析IFN 丫含量。
[0108] 在微量培養物中使用存檔MS供體PBM擁開究抗髓銷免疫
[0109] 在早期開發中，使用來自TERMS臨床試驗的存檔PBMC研究對一組包含MBP、M0G和 PLP的序列的109個膚的免疫。膚文庫構建為一系列16-mer膚，其中有12-mer重疊。膚根據其 在每個髓銷抗原的相應蛋白質序列中的線性位置按質量成對混合。序列表、配對混合物和 最終庫在附錄中提供。
[0110] 在350id補充有20IU/ml化-2的完全OpTmizer CTS培養基中建立IxlO6個PBMC/ 1.2ml圓底微量培養管，并且每個膚"對"W lug/ml脈沖，總共55種微量管培養物。在5天后， 通過加入IxlO6個PBMC和lug/ml適當的膚對再刺激培養物。在第0和5天不存在膚刺激的情 況下，使陰性對照培養物接受PBMC。在第6天，從所有培養物收集培養物上清液，并經受通過 夾屯、ELISA進行的IFN 丫含量分析。
[0111] 通過夾屯屯LISA測定培養物上清液中的IFN 丫
[0112] 使用得自抓Bioscience的具有鏈親和素-HRP的捕集和檢測抗體W及化巧IA分析 稀釋劑通過夾屯、化ISA進行IFN 丫含量測定。使用制造商的說明進行化ISA。簡而言之，用 lOOul 1: 250稀釋于涂覆緩沖液(P朋.6)的儲備捕集抗體涂覆96孔化ISA板，并在2-8C下溫 育過夜。使用Biotek ELx405 96孔板洗涂器通過PBS洗涂平板5次。向每個孔加入lOOul蛋白 質阻斷溶液，并在室溫下溫育2小時。通過傾析平板并吸去吸附的組織來移除阻斷溶液，然 后向指定的孔加入lOOul體積的上清液。在一些實驗中，將"未稀釋"至1:8倍比稀釋的上清 液加入ELISA平板。在每種情況下，平板布置允許每個平板接收涵蓋300至25pg/ml范圍的重 組IFN 丫曲線。分析的化0Q設定為11.25pg/ml。在溫育2小時后，用0.05%溶于PBS的Tween 20洗涂平板7次，然后加入1:250稀釋的結合到鏈親和素-皿P的生物素酷化檢測抗體。使平 板在室溫下再溫育一小時，然后用0.05%溶于PBS的Tween 20洗涂14次。通過在每20ml蒸饋 水中加入一粒尿素片劑和一粒Oro片劑重構鄰苯二胺(0PD)酶底物。將lOOul底物溶液施加 到所有的孔，并在室溫下黑暗處溫育30分鐘。光密度(0D)使用BioTek ELxSOO ELISA讀板器 測定，濾光器設定為45化m。使用Genie 5軟件(BioTek)生成IFN 丫標準曲線，將OD讀數轉換 為IFN 丫的濃度(pg/ml)。
[011引通過ELISpot測定IFN 丫分泌細胞的頻率。
[0114] 所有化ISpot均使用由eBioscience供應的試劑盒形式的試劑在96孔板中進行。在 使用前24小時，在2-8C下使用lOOul 1: 250稀釋的抗IFN 丫捕集抗體涂覆化ISpot平板。傾析 捕集抗體，并更換為200ul阻斷溶液，該阻斷溶液由RPMI培養基加上10%FBS構成，并且平板 在室溫下進一步溫育2小時。傾析阻斷溶液，將各種實驗的PBMC制劑(參見實驗設計和步驟） WlOOul的總體積加入指定的孔。如有必要，向每個孔的50ul體積再加入IxlO5個PBMC，作為 抗原呈遞來源(APC)。膚W80ug/ml的濃度加入50ul體積中，在分析孔中得到20ug/ml的最終 膚濃度。當排除APC或膚時（陰性對照），將單獨培養基更換為適當體積的細胞懸浮液或膚溶 液。對于分析中的陽性對照而言，使用50U1濃度為20ug/ml的PHA-L代替膚對接受應答細胞 和APC的對照孔進行脈沖。負載的化ISpot平板在37C下溫育大約18小時，W允許在各種微孔 中分泌和捕集IFN γ。在完成細胞培養時，將平板從溫育移除，并用蒸饋水洗涂兩次，W裂解 和移除細胞，然后用0.05%溶于PBS的Tween20再洗涂五次。所有洗涂使用BioTekELx405 平板洗涂器進行。向洗涂的平板加入lOOul/孔1:250稀釋的溶于分析稀釋劑的生物素酷化 抗IFN 丫檢測抗體，并且平板在室溫下進一步溫育2小時。然后使用屯次變化的0.05%溶于 PBS的Tween 20再次洗涂平板，然后加入lOOul/孔1:100稀釋的溶于分析稀釋劑的儲備鏈親 和素-HRP。然后在室溫下溫育平板1小時。在完成時，使用0.05%溶于PBS的Tween 20洗涂平 板屯次，然后單獨用PBS再洗涂五次。AEC底物通過W下步驟制備:將10滴濃縮物加入10ml分 析稀釋劑，并將lOOul底物溶液加入每個化ISpot孔。在大約20分鐘的時期后，顯影斑點變為 可見的，通過蒸饋水洗涂五次澤滅反應。使顯影平板空氣干燥過夜，然后在CTL Immunospot 讀取器上使用ImmunoSpot軟件5.1.8版對斑點計數。
[011日]通過化ISpot對抗破傷風毒素(TT)應答進行定量
[0116]
[0117] 直接體外化ISpot
[011引將來自健康供體的PBMC -式四份W2xl05個細胞/孔直接接種于200ul完全 Optmizer CTS培養基中，該培養基補充有20ug/ml-組屯個(TT1-TT7)包含已知免疫顯性決 定子的破傷風毒素膚中的一個。膚使用FM0C化學法合成，通過HPLC純化至大于95%的膚純 度。單個膚溶解于二甲基亞諷(DMS0)、乙酸和/或水中，達到5mg/ml的終濃度。包含20化g/ml HLA-A2 CMVpp65 9-mer的四個平行孔作為對照回憶抗原包括在內，此前使用來自該供體的 PBMC檢測該膚對該抗原的免疫。陰性對照孔在不存在膚的情況下接受PBMC。使化ISpot平板 溫育過夜，隨后如上文所述通過斑點計數進行IFN γ分泌細胞的計數。
[0119] 在微量培養5天后進行化ISpot
[0120] PBMCWlxlO6個細胞/微量管接種于500ul體積完全OpTmizer CTS培養基中。每個 管補充有20ug/ml-組屯個(TT1-TT7)破傷風毒素膚中的一個加上5IU/ml終濃度的化-2。陰 性對照微量培養物由培養基中的細胞加上IL-2構成，但不存在任何膚。在培養5天后，輕輕 重懸每個微型管的內容物，培養物WlOOul等分試樣分配到四個平行化ISpot孔中，W建立 用于分析的四個平行的相同孔。向孔的50ul體積再接種IxlO5個PBMC，作為抗原呈遞來源， 并且膚W80ug/ml的濃度重疊于50ul中，在化ISpot培養物中得到20ug/ml的終濃度。陰性對 照孔還包含另外的PBMC，但不存在膚。在37C下過夜溫育后，對化ISpot平板顯影，并且如上 文所述對IFN 丫斑點進行計數。
[0121] 使用微量和大量培養W及化ISpot對細胞-ELISA對抗髓銷免疫進行定量
[0122] 在微量培養后，使用55個膚"對"編碼MBP、M0G和化P(對照組使用檢測抗破傷風應 答所用的屯個膚文庫)擴大培養與破傷風毒素膚應答定量所用類似的分析形式，W研究抗 髓銷免疫。在此形式中，建立500ul培養體積的完全化Tmizer CTS培養基中的IxlO6個PBMC， 該培養基補充有5IU/ml化-2加上20ug/ml終濃度的一個膚對，總共55個微量管，涵蓋全部 髓銷膚文庫。再次平行運行陰性對照培養物，該培養物由PBMC和IL-2構成，但不存在膚。
[0123] 為增加暴露至任何一個抗原來源的PBMC的總數，根據由六個組成的組(對照組成 "對"進行測試）的質量等量混合膚，并在第0天將20ug/ml運些膚庫加入無菌5ml圓底試管中 1.5ml完全OpTmizer CTS中的3xl06個PBMC。
[0124] 在培養的第5天，輕輕重懸每個微量培養管中的細胞，并將lOOul等分試樣一式四 份接種于化ISpot平板中。對于5ml試管中的大量培養物而言，移除1ml培養基并將細胞重懸 于其余的500ul中，然后接種W進行分析。在每種情況下，在第0天存在20ug/ml所用的匹配 髓銷膚對或庫的情況下使用IxlO5個PBMC作為抗原呈遞來源再刺激孔。在過夜培養后，對 ELISpot平板顯影，并對IFN 丫斑點定量。在一些實驗中，將培養物的二分之一和八分之一各 兩份接種于孔中（對照組將全部培養物均勻接種于四個孔中），w減少每個孔的潛在斑點 數，從而提高斑點定量的準確性。
[0125]作為化ISpot的替代形式，將細胞-ELISA作為檢測原位累積IFN 丫分泌的方法進行 研究，對照組對IFN 丫分泌細胞的數量進行定量。第5天的培養物的接種方式與化ISpot孔相 同。然而在細胞-ELISA中，ELISA平板預先涂覆抗IFN 丫捕集抗體，代替化ISpot平板。在過夜 溫育后，使用0.05%溶于PBS的Tween 20洗涂5次，將細胞從平板移除，使用由eBioscience 供應的試劑對分析進行顯影，并用于上述常規夾屯、ELISA。再次參考細胞ELISA(但不存在細 胞)中滴定的IFN□的標準曲線，將光密度轉換為IFN γ的濃度。
[01%]在一些實驗中，對培養物進行細胞"解離步驟"，然后接種到化ISpot或細胞-ELISA 分析。運通過W下步驟實現:在第5天離屯、（10分鐘250g)培養管，移除用過的培養基，隨后使 用0.5ml PBS洗涂，重復離屯、，然后在37°C下懸浮于0.5ml ImM抓TA，10U/ml溶于PBS的DNA 酶10分鐘。通過離屯、移除解離溶液，并用0.5ml完全化Tmizer CTS補充細胞，然后進行下游 分析。
[0127]優化的表位表達譜分析
[012引將3xl06個PBMC接種于18個5ml FACS管中的每個，該FACS管含有1.5ml補充有5IU/ ml化-2的完全化Tmizer培養基。將每個培養物加入18個膚庫中的一個，達到20ug/ml的終 濃度。兩個陰性對照管接受溶于培養基的PBMC，但不存在膚。在第0天給另外的管接種PBMC， 隨后在第5天用另外的PBMC和PHA脈沖時作為陽性對照。掩蓋所有試管，并在37C 5%C02下 溫育5天。在第5天，從每個試管移除1ml用過的培養基，將IxlO6個PBM切日入補充有匹配膚庫 的0.5ml總體積，在1ml的最終培養物體積中獲得20ug/ml的終濃度。陰性對照管接受0.5ml 培養基中的IxlO6個PBMC，但不含膚。陽性對照（從第0天不接受膚的管建立）接受另外的 IxlO6個PBMC，用PHA-L代替膚，在1ml最終培養物體積中獲得化g/ml的終濃度。試管在37C 5%C02下溫育18-24小時的時期。然后收集上清液，并從"未稀釋"雙倍稀釋至1:8,并施用到 常規夾屯、ELISA。參考包括每個測試板的IFN 丫標準曲線記錄IFN 丫濃度。
[0129] "反應性"膚庫陽性的臨時定義如下：1:2稀釋的上清液中的IFN 丫含量大于陰性對 照2.5倍，即PBMC培養物在不存在膚的情況下始終得W保持。
[0130] 實施例1.2:結果
[0131] 實施例1.2.1:培養環境和培養持續時間對誘導抗原特異性T細胞應答的影響
[0132] 圖1和2示出了使用化A - A 2呈遞的優化的9 -m e r膚時，時間和培養條件對CM V PP65T-細胞回憶應答的影響。W高密度（IxlO6個PBMC/350U1)培養細胞使得在培養的第4和 6天檢測到抗原特異性IFN 丫的濃度增加4-5倍。向培養物加入20IU/ml化-2由于支持T-細 胞增殖會大大增加 IFN 丫應答，從而增加培養物中抗CMV pp65反應性T-細胞的克隆呈遞。總 共培養6天，在第5天再刺激抗原，與僅培養4天后，在第3天使用抗原再刺激所培養和分析的 細胞相比，使得抗CMV pp65 T-細胞應答大大增加。
[0133] 圖3和4示出了使用優化的CMV PP65抗原回憶應答產生的接種密度和培養條件（圖 2)，兩種MS供體PBMC制劑對109個髓銷膚文庫的成對混合物的刺激的IFN 丫應答。兩種供體 均未顯示出大于背景2倍所定義的IFN 丫抗髓銷膚相對于陰性對照（僅培養基的微量培養 物）的任何顯著活性。使用供體011054的分析顯示出陰性對照培養物中的一個的高背景應 答所定義的存在"假陽性"活性。
[0134] 實施例1.2.2: IFN 丫化ISpot的評估是在微量培養后檢測稀有抗原特異性Τ細胞的 高靈敏度方法
[0135] 不能觀察到清晰的抗髓銷膚IFN 丫活性暗示，所開發的培養條件不足W支持低頻 率髓銷反應性Τ-細胞組庫，或分析讀數未顯示出描述相對于背景的陽性應答的足夠嚴重 性。為了對后者進行評估，實施IFN 丫化ISpot分析，W代替常規夾屯、化ISA，用于定量相對于 上清液中測定的累積IFN 丫應答的培養物中IFN 丫分泌細胞的頻率。ELI Spot分析通常用于 檢測低頻率T-細胞應答。此外，為了控制培養物中的背景應答，比-2的濃度從20IU/ml減少 至5IU/ml。
[0136] 為建立化ISpot后細胞培養物對定量稀有T-細胞應答的影響，設定分析從而使健 康供體(03094)的PBMC經受針對破傷風毒素的一組屯個已知免疫顯性決定子膚的直接體外 化ISpot，如上述文獻所述。或者，在存在每個膚的情況下細胞培養后第5天進行重復分析， 并在化ISpot環境中再刺激。
[0137] 圖5示出，供體的PBMC的直接體外化ISpot不能檢測IFN 丫分泌性抗破傷風毒素 T- 細胞的存在，但來自CMV pp65的HLA-A2免疫顯性膚的免疫易于檢測為"回憶"應答。然而，當 在存在每個破傷風毒素膚的情況下，PBMC經受5天細胞培養W擴大培養稀有T-細胞克隆，然 后進行化ISpot時，獲得特異性應答。為確認至少TT4的應答不是"假陽性"，每周使用達21天 培養期的膚加上另外的供體細胞樣品的PBMC重復再刺激成功產生TT4-反應性T-細胞系。
[0138] 在建立微量管和候選抗原即破傷風毒素的化ISpot終點，并且微量培養物可將破 傷風應答擴增至可檢測范圍后，進行分析W研究抗髓銷T-細胞免疫。首先將分析應用到健 康供體PBMC。對相同來源的存檔組織庫進行兩種分析，W反映分析間差異。圖6和7示出了鑒 定兩種化I Spot分析之間陽性應答膚庫的不一致性。
[0139] 為確認共培養微量IFN 丫化ISpot平臺的較小分析間差異，將分析應用到從兩個MS 供體收集的PBMC。每個供體的分析進行兩次，第二分析利用相同的PBMC，但來自冷凍保存來 源。另外，數據產生了不一致的結果(圖8和9)。
[0140] 缺乏可重復性，W及任何一種膚混合物的四個平行孔之間存在標準偏差暗示，潛 在反應性T-細胞在四個平行ELISpot系列的每個成員孔之間的分布不均勻。運可W是細胞 培養5天轉移到化ISpot之前不充分解離而在微量管中形成聚集體的結果。由于洗涂時細胞 碎片從化ISpot孔的移除不充分，聚集體也可在化ISpot中導致"假陽性"數據，然后檢測抗 體的非特異性捕集在分析中導致"假斑點"。為了試圖改善每個膚混合物的四個平行 ELISpot組中的任一組之間的細胞分布，并減少聚集體產生"假陽性"數據點的風險，微量培 養物樣品首先經受"解離步驟"，W增加接種單個細胞懸浮液的可能性，并減少帶入化ISpot 分析的細胞和碎片聚集體的數量。解離步驟通過如下步驟實現:洗涂微量培養物，重懸于37 °C下含lOU/ml溶于PBS的DNA酶的ImM邸TA中10分鐘，然后重懸于細胞接種培養基中并進行 最后分析。
[0141] 另一個問題設及抗髓銷T-細胞免疫的絕對頻率，W每個膚對取樣的應答細胞/ PBMC的數量計。成"對"混合的109個膚文庫的使用根據來自120ml抽血的PBMC可能產率，規 定了IxlO6個細胞/微量培養物的PBMC樣品量，W支持分析設計。此樣品量太小，W至于預期 文獻暗示外周血中抗髓銷T-細胞的頻率在1/105至1/106個細胞的范圍內時，不能檢測可靠 的抗髓銷T-細胞免疫。為解決此問題，W及除聚集體對最后化ISpot分析的影響之外，設定 微量培養物中的PBMC，在微量管中包含的PBMC樣品量為IxlO6或3xl06個細胞/350ul體積，并 研究對MOG膚文庫的應答，如上文所述成"對"混合MOG膚。
[0142] 圖10示出，微量管培養物的接種化ISpot (初始W1X106個PBMC接種)掲示了對膚混 合物MOGmie的"弱"應答。在此實驗中，解離步驟的應用對"未處理的"培養基對照所定義的 "假陽性"可能性的影響最小。然而，利用3xl06個PBMC作為第0天接種材料產生的對膚庫 MOGmie的應答更強，并且解離步驟移除了未處理的對照中存在斑點所定義的"假陽伴'的風 險。
[0143] 上述數據支持了每個膚庫的樣品量增加。然而，由于等待從120ml抽血移除的PBMC 的量有限，不可能篩選成對混合的109個膚文庫，從而產生55個膚"祀標"，樣品量為3xl06個 PBMC/祀標。為了能夠將PBMC樣品量增加至3xl06個細胞/膚"祀標"，需要混合重疊膚文庫產 生6個膚的"庫"（對照組僅"成對"）。實際上，MBP文庫由6個膚的6個"庫"構成。對于M0G，6個 膚的5個"庫"，其中C-末端庫(M0Gp6)由八個膚構成。最后，PLP由6個膚的5個"庫"構成，并且 一個庫(PLPp6)由5個膚構成。在此情形下，膚家族涵蓋MBP、M0G和化P，每個由涵蓋全部109 個膚文庫的6個"祀標"構成。為了便于提高樣品細胞數量/膚庫，即3xl06個PBMC，第0天在 5ml FACS管中建立1.5ml體積的細胞培養物，對照組在微量管中建立350ul體積。此模式即 為所謂的"大量"培養物。
[0144] 使用ELI Spot的另一個問題是計數斑點的"半定量"性質。雖然可校準CTL Immunospot軟件來識別均勻性質的斑點，但化ISpot分析中形成的斑點在形狀、大小和分布 方面差別很大。圖11中最好地示出了運一點。由于化ISpot分析在5天的共培養期后進行，抗 原特異性T-細胞產生的大斑點的大小不一致，反映出它們對IFN 丫分泌的高反應性，W及在 18小時的再刺激分析期間它們在化ISpot孔之間的運動性。計數斑點的準確性隨著化ISpot 孔中活性的增加而下降（圖11)。
[0145] 為了提高化ISpot計數的準確性，特別是第0天接種PBMC樣品量從IxlO6增加至 3xl06個PBMC，W增加檢測到陽性信號的可能性，ELISpot設定為包括細胞稀釋步驟，W便對 斑點進行準確計數。簡而言之，使1.5ml第5天培養物離屯、，移除用過的培養基，應用"細胞解 離"步驟，最后將細胞沉淀物重懸于400ul新鮮培養基中。代表一半大量培養物的化ISpot平 板的兩個孔各取lOOul接種。其余的細胞(200ul)使用600ul新鮮培養基進一步稀釋，然后再 將lOOul細胞懸浮液分配到兩個化ISpot孔中的每個，W創建初始接種大量培養物的1:8稀 釋。
[0146] 作為化ISpot中"細胞因子分泌細胞的數量"計數的替代形式，還建立了檢測IFN 丫 的"累積分泌"的平行細胞化ISA。分析的形式與化ISpot基本上相同，不同的是該細胞接種 于抗IFN 丫抗體涂覆的化ISA平板上，而不是硝化纖維化ISpot平板上。在通過加入膚庫再刺 激和支持作為APC來源的PBMC，W及培養18小時后，洗掉細胞，W常規化ISA對平板顯影，包 括比色底物。此方法的優點是，當0D解釋為IFN 丫的濃度依賴性標準曲線時，讀數是完全定 量的。從相同的冷凍保存PBMC原材料建立化ISpot和細胞化ISA分析，但每個分析從第0天開 始進行不同的天數。
[0147] 圖12和13示出，對于第一次開發優選的表位表達譜分析，當根據相同的細胞原材 料設定在不同的天數進行獨立分析時，甚至當替代分析平臺用于最終讀數時，個體中的應 答膚庫檢測具有一致性。數據的質量改善幾乎毫無疑問設及初始培養物的量增加，即第0天 3xl06對IxlO6個PBMC。運增加了捕集相對稀有髓銷反應性Τ-細胞的可能性，該稀有髓銷反應 性Τ-細胞可在存在來自包括109個膚文庫的重疊序列的任一個膚庫的情況下，在共培養的 前5天期間擴大培養。
[0148] ELISpot和細胞化ISA均具有可檢測范圍的問題。當斑點計數超過200時，包含大量 大型反應性斑點的化ISpo巧L難W準確定量。細胞化ISA具有大約30化g/ml的定量上限，可 導致一些數據點"超出范圍"。為解決運些問題，設定包括接種材料的稀釋步驟的兩種分析 (圖12和13)。實現準確數據需要準確稀釋均勻的細胞懸浮液，運需要引入細胞"解離步驟"， 然后將"稀有事件"即髓銷反應性T-細胞均勻分配于樣品孔中。盡管能夠實現，但稀釋系列 導致大量培養物的大量操作，W及在總共Ξ個96孔板上接種，每個抗原祀標MBP、M0G和化P 接種一個96孔板。當旨在設計"高通量"平臺時，進行細胞稀釋的復雜性W及分析"量"將成 為挑戰。
[0149] 實施例1.2.3:在培養第6天檢測抗原特異性免疫的常規化ISA評估W及表位表達 譜分析化PA)的建立
[0150] 細胞化ISA的讀數為細胞分泌的IFN 丫的濃度，從而從分析自身內部的周圍上清液 原位捕集。因此除稀釋應答細胞數量W進行分析范圍內的IFN γ含量分析之外，更簡單的方 法是不稀釋應答細胞，而稀釋上清液，進行常規化ISA二次分析。由于其后均勻細胞懸浮液 不再具有決定性，可避免細胞"解離步驟"。第5天，在收集上清液進行IFN 丫含量定量之前， 可在培養管中直接進行大量培養物的再刺激，顯著減少培養物的操作。
[0151] 作為上述限縮分析的初始測試，定性通過四位獨立的操作員檢測健康供體(3183) 對破傷風毒素的公布免疫顯性膚序列的免疫應答設定，涵蓋總共屯個膚(TT1-TT7)。簡而言 之，每位操作員在第0天設定5ml FACS管中的3x106個PBMC/1.5ml培養基體積的屯種培養 物，每種使用20ug/ml-組屯個膚中的一個脈沖。第5天，移除1ml培養基上清液，加入lxl〇6 個PBMC作為抗原呈遞來源，再次使用20ug/ml膚脈沖培養物，最終培養物體積為1ml。在過夜 溫育后，收集上清液并使用常規ELISA分析IFNy含量，參考重組IFNy的標準曲線將光密度 轉換為pg/ml。對"未稀釋"和1:2、1:4和1:8稀釋的上清液進行分析。
[0152] 表1示出了如上所述測定的IFN 丫的濃度(pg/ml)，闊值設定為陰性對照的2.5倍 (PBMC在不存在膚的情況下培養）。一致率記錄了準確鑒定對單個膚祀標的陽性或陰性應答 的操作員（總共四名）的百分比。不出意料，當檢測到陽性應答時，一致率隨著上清液的滴定 而下降，反映了不同操作員之間檢測的IFN 丫的絕對濃度差異。重要的是，當對未稀釋的上 清液進行分析時，4名操作員記錄到TT膚ΤΤ3、ΤΤ5、ΤΤ6和TT7的陽性活性100%-致。記錄到 ΤΤ膚ΤΤ1和ΤΤ2的非反應性100%-致。ΤΤ4的數據的差異更大，僅一名操作員化Κ)檢測到強 烈應答。ΤΤ4缺乏可重復性可反映稀有初級免疫應答的檢測，其在第0天開始培養。
[0153] 表1:利用破傷風毒素膚進行表位表達譜分析的操作員間定性
[0154]
[0155]
[0156] 數據表示大于陽性闊值的IFNγ(pg/ml)設定為大于陰性對照（無膚)培養物2.5 倍。ALOQ:大于定量的水平(313pg/ml)
[0157] EPA的進一步定性由另外兩位操作員使用不同供體(03190)的PBMCW及破傷風毒 素膚組進行。表2的數據反映了在測試上清液的1:2稀釋點處大于陰性對照(無膚)2.5倍的 IFN 丫濃度(pg/ml)。1:2稀釋點被選為分析的最適當滴定點，因為與"未稀釋"上清液中所檢 測的信號相比，它要求信號為可滴定的。此外，它還排除分析中包括的弱的從而可能假陽性 數據。數據示出，兩位操作員的供體03190對破傷風毒素膚ΤΤ3、ΤΤ6和TT7的陽性反應之間 100%-致。
[0158] 表2:利用破傷風毒素膚進行表位表達譜分析的二次定性
[0159]
[0160]
[0161] 數據表示大于陽性闊值的IFN 丫（pg/ml)設定為上清液的1:2稀釋點處大于陰性對 照(無膚)培養物2.5倍。
[0162] 為了定性髓銷膚庫的優選分析形式，在第0天啟動3xl06個PBMC/膚庫，在第5天進 行再刺激，在第6天對上清液進行IFN 丫含量定量。使用來源于健康供體的PBMC的單個來源 建立不同操作員的Ξ個重復EPA。表3示出，當從滴定上清液的1: 2稀釋點繪制數據時，供體 (03190)具有可檢測的對M0Gp6、化化1和化化4的應答。IFN 丫化ISA分析的定量下限水平 化LOQ)為11.25pg/ml。陽性闊值再次設定為大于無膚對照中的應答2.5倍，在運些分析中分 析等于LLOQ。
[0163] 表3:檢測髓銷反應性T-細胞的表位表達譜分析化PA)的操作員間和分析間定性。 數據表示在每個培養物中檢測的大于陽性闊值的IFN 丫濃度(pg/ml)。
[0164]
[0165] 對于該供體具有重復陽性評分的Ξ個免疫反應性膚庫為M0Gp6、PLPpl和化巧4。兩 個最具反應性的膚庫(PLPp 1和化化4)的一致率為100 %。對M0Gp6的反應性較弱，并且在所 進行的6個分析中的5個進行檢測。因此，存在假陰性數據的可能性，然而在低頻率下，僅反 應性較弱的膚庫存在該可能性。根據數據，有十五個膚庫被視為"非反應性"。在總共90個培 養物中（15個膚庫進行六次分析），僅兩個顯示出假陽性數據，顯示出大約2%的比率。成功 產生用于T-細胞免疫治療方案的髓銷反應性T-細胞系的能力僅取決于被選擇用于T-細胞 增殖的完全反應性膚庫。EPA中非常低的假陽性率大大緩解了產生缺乏抗原特異性的T-細 胞系的風險。
[0166] 實施例1.3
[0167] 為了進一步示例反映陽性T-細胞對髓銷膚的免疫反應性的細胞因子檢測的用途， 使表位表達譜分析的上清液經受更詳細的分析。為此，使用基于微珠的多重分析進行13個 細胞因子的同時檢測，W對多功能T-細胞對髓銷膚的免疫進行表達譜分析。
[0168] 對來自5個單獨MS供體的PBMC進行EPA。如前所述，在第6天收集上清液，24小時后 使用另外的PBMC和膚再刺激培養物。
[0169] 在多重分析之前，離屯、樣品W移除細胞碎片并儲存在-20°C下直到分析。在分析制 劑中，試劑比LIPLEX Magnetic Human化17試劑盒形式提供，其包括抗體固定微珠、質 量控制樣品和細胞因子標準品，并且在適當的緩沖液中重構。標準曲線樣品使用所提供的 分析緩沖液從儲備標準品進行1:4系列稀釋來制備。使用20化L分析緩沖液溫育所提供的平 板的所有孔10分鐘，W防止非特異性結合。然后棄去分析緩沖液，將25化每種標準品或對照 W及25化適當的基質溶液加入適當的孔。向每個樣品孔加入25化分析緩沖液W及25化樣品 上清液。然后使用SSiiL抗體固定微珠在避免光照、攬拌、4Γ的條件下培養所有孔18小時。然 后使用BioTek化-405平板洗涂器洗涂平板，并施加檢測抗體溶液1.5小時。向未洗涂的平 板施加鏈親和素 PE溶液30分鐘，立即洗涂W移除所有過量試劑。向所有孔加入150μΙ Ma評ix運行緩沖液，然后用Ma評ix光度計采集數據。使用Millipore Milliplex Analyst軟 件對樣品中的細胞因子水平定量。
[0170]如表4所示，全部五個供體顯示出對一個或多個膚庫的陽性反應。在所有情況下， 膚(NP)對照培養物均不能用于設定每個細胞因子的基線自發分泌水平。在所檢測的分析物 中，IFN 丫、TN陽和IL-6最易于檢測并且檢出的頻率最高。
[0171]
[0172] 表4:對髓銷膚應答的五個MS供體樣品的細胞因子水平
[0173] 在建立IFN 丫、TNFa和IL-6作為檢測多功能MRTC的主要候選活化細胞因子的用途 后，使8個另外的MS供體經受Ξ個分析物的多重分析。數據示于表5中。
[0174] 表5:對髓銷膚應答的八個MS供體樣品的細胞因子水平
[0175]
[0176] 實施例1.4:討論
[0177] 方法開發的焦點是生成檢巧帆MC中的髓銷反應性T-細胞(MRTC)的可靠平臺，最后 功能讀數為IFNy的分泌。
[0178] 解決了兩個主要問題：
[0179] 1) PBM帥MRTC的頻率較低，及其對陽性免疫檢測的樣品量的影響。
[0180] 2)優選的檢測系統能夠對單個膚庫的陽性免疫進行高通量讀取。
[0181] 最初目的是使用成對的109個膚文庫創建55個"祀標"，其中測定該祀標的T-細胞 免疫。然而，利用120ml抽血作為原材料通常會限制用于1.2-1.5億個細胞分析的PBMC總數， 包含大約1-1.2億個T-細胞。如果在分析前不經過擴大抗原特異性T-細胞的預培養期，簡單 體外分析諸如ELISpot的靈敏度不會很高。為利用55個膚祀標，W及允許足夠的細胞能夠在 分析中再刺激培養物，要求任何一種"成對"膚混合物的免疫分析具有100萬個PBMC的樣品 量。盡管處于測試中，但基于100萬個PBMC的初始樣品量的分析不能稱為很大。MRTC可視為 "稀有事件"，在PBMC中具有1/105至1/106個T-細胞之間，預期僅100萬個PBMC/膚混合物或庫 的樣品量易于成為"假陰性"數據。為解除此限制，將六個膚混為一組，而不是成為一對，倉U 建一組18個膚祀標，在"大量"培養物環境中評估每個膚祀標的300萬個細胞的PBMC樣品量。
[0182] 在存在涵蓋MBP、M0G和PLP的18個膚庫的情況下大量培養PBMC五天后，評估總共Ξ 個分析平臺的陽性抗髓銷免疫檢測。ELISpot由于能夠檢測低頻率免疫應答，被視為精選的 分析。然而，利用檢測5天培養物預敏化的免疫的分析僅得到半定量數據。此外，分析需要在 接種前進行細胞解離，并且它們的滴定能夠可靠地定量"斑點"。作為另外一種選擇，開發原 位細胞化ISA用于測定"累積"IFNT分泌。然而，由于缺乏動態范圍，細胞仍需要解離和滴 定，W允許IFNT的有效定量。雖然兩個分析均產生了鼓舞人屯、的數據，但平臺的復雜性不 適用于"高通量"形式。
[0183] 最終分析模式第0天每個膚庫使用300萬個PBMC的樣品量，第5天再刺激培養物。第 6天收集上清液，并滴定為常規IFN 丫夾屯、化ISA。由于此方法避免了任何滴定應答細胞需 要，分析平臺的復雜性大大降低。
[0184] 評估優選分析平臺的操作員間和分析間差異，該分析平臺研究屯個來自破傷風毒 素的免疫顯性膚的免疫，W及18個髓銷膚庫的免疫。
[0185] 設計分析時的重要考慮因素是限制檢測到"假陽性"數據的可能性。為此，陽性闊 值初始設定為大于陰性對照培養物2.5倍。此外，ELISA中培養物上清液的1:2稀釋必須超出 該闊值。選擇該闊值將確保，只有當來自"未稀釋"上清液的數據分析不能作為潛在的"假陽 性"膚選擇進行時，弱應答才記為陽性。根據該闊值，仍存在分析可記錄偶然的"假陰性"的 可能性(參見表3)。然而，最重要的是所選的膚庫表示強烈應答，W成功產生T-細胞系，并且 顯示出抗原特異性免疫。
[0186] 陽性應答的確定，W及用于T-細胞疫苗制造的膚的分配。
[0187] 在開發期間，對任何一個膚庫的陽性應答通過上清液1:2稀釋點處IFN 丫濃度(pg/ ml)的檢測確定，該檢測結果比對應的陰性對照培養物的記錄高至少2.5倍。如果IFN 丫的濃 度超出分析的檢測上限水平(313pg/ml)，則1:4和1:8稀釋點必須落在范圍內，并顯示出滴 定度證據。利用表示IFN 丫的存在的膚庫，例如活性水平高于預定水平的膚庫，可產生用于 T-細胞免疫治療的多個T-細胞系。
[0188] 隨著開發的進行，與單個分析物例如IFN 丫的檢測相比，利用多個細胞因子的上清 液EPA分析允許檢測多功能T-細胞對髓銷膚庫的應答。因此，可檢測更寬泛的反應性組，得 到更多的記錄為髓銷的陽性反應的供體。據設想，不同細胞因子組合的檢測可用于設及不 同疾病的表位表達譜分析。
[0189] 表5示出了用于鑒定每個供體對基于多個髓銷膚與無膚對照的陽性反應的"活性 水平"。為支持對髓銷膚庫的陽性反應選擇，通過W下活化水平測定一個或多個細胞因子的 存在：
[0190] 單獨IFN 丫應答大于無膚對照lOx。WIFN 丫排序。
[0191] IFN 丫應答大于無膚對照5x且TNFa應答大于無膚對照5x。WIFN 丫排序。
[0192] IFN 丫應答大于無膚對照5x且IL-6應答大于無膚對照5x。WIFN 丫排序。
[0193] TNFa應答大于無膚對照5x且IL-6應答大于無膚對照SxdWTNFq排序。
[0194] 對于每個供體，表5示出了每個陽性膚庫的細胞因子，或第一和第二細胞因子的存 在測定。濃度(pg/ml)列列出了排序最高的細胞因子的濃度及其相關活性水平。在多種情況 下，髓銷膚庫的免疫通過多于一個細胞因子的存在測定。對于八個供體中的屯個，MRTC反應 性通過存在IFN 丫達到。對于一個供體（14010030-03856)，陽性通過存在TNF-a和IL-6二者 的信號但不存在IFN 丫達到。
[01%]本文所提及的所有專利和專利公布據此W引用的方式并入。
[0196] 本領域的技術人員在閱讀上述【具體實施方式】時可作出某些修改和改進。應當理 解，為了簡明和清晰目的，所有此類修改和改進可從本文刪除，但仍在W下權利要求書的范 圍內
[0197] 髓銷膚序列、混合物和庫 [019 引
[0199]
【主權項】
1. 一種檢測抗原特異性T細胞和鑒定所述抗原特異性T細胞對其應答的免疫刺激表位 的方法，所述方法包括： (a) 使用表位庫體外引發至少一種包含來自受試者的Τ細胞的樣品的大量培養物，所述 表位庫包含一個或多個肽，其中所述表位庫中的每個肽是抗原的獨特片段； (b) 使用所述表位庫再刺激所述大量培養物一段時間，以足以允許對所述表位庫中的 至少一個肽特異的T細胞釋放可檢測的至少一個活化細胞因子；以及 (c) 檢測所述大量培養物中是否存在所述至少一個活化細胞因子； 其中所述培養物中存在所述至少一個活化細胞因子檢測對所述抗原特異的T細胞，并 且將所述抗原的所述片段鑒定為包含所述抗原特異性T細胞對其應答的免疫刺激表位。2. 根據權利要求1所述的方法，其中每個表位庫包含至少兩個肽，其中每個肽與所述表 位庫中的至少一個其它肽共有重疊氨基酸序列同一性的區域，所述表位庫中的所述肽一起 跨越所述抗原的鄰接區域，并且其中所述培養物中存在所述至少一個活化細胞因子將所述 表位庫中的所述肽跨越的所述區域鑒定為包含所述抗原特異性T細胞對其應答的免疫刺激 表位。3. 根據權利要求1所述的方法，其中每種大量培養物包含密度為4.5xl05個細胞/mL/mm3 的T細胞。4. 根據權利要求1所述的方法，其中所述樣品包含從患者分離的外周血單核細胞。5. 根據權利要求4所述的方法，其中所述患者患有疾病，并且所述抗原與所述疾病相 關。6. 根據權利要求5所述的方法，其中所述疾病是自身免疫疾病，并且所述抗原是與所述 自身免疫疾病相關的自身抗原。7. 根據權利要求6所述的方法，其中所述自身免疫疾病是多發性硬化癥，并且所述自身 抗原是髓鞘蛋白。8. 根據權利要求7所述的方法，其中所述髓鞘蛋白選自由以下組成的組：髓鞘堿性蛋 白、蛋白脂質蛋白、髓鞘少突膠質細胞蛋白以及它們的組合。9. 根據權利要求5所述的方法，其中所述疾病是腫瘤，并且所述抗原是腫瘤相關抗原。10. 根據權利要求1所述的方法，其中所述肽的長度為約16個氨基酸。11. 根據權利要求1所述的方法，其中每個肽庫具有至少2個不同的肽。12. 根據權利要求11所述的方法，其中兩個不同肽之間的重疊氨基酸區域的長度為12 個氨基酸。13. 根據權利要求1所述的方法，其中所述活化細胞因子是IFNy。14. 根據權利要求1所述的方法，其中所述活化細胞因子通過ELISA檢測。15. 根據權利要求1所述的方法，其中所述表位庫來自包括至少兩個表位庫的文庫，并 且其中對所述文庫中的每個表位庫重復步驟(a)-(c)。16. 根據權利要求15所述的方法，其中所述表位庫的文庫包含跨越所述抗原的至少 50%的肽。17. 根據權利要求1所述的方法，其中所述檢測步驟包括檢測所述大量培養物中是否存 在兩個活化細胞因子;其中所述培養物中存在兩個活化細胞因子檢測對所述抗原特異的T 細胞，并且將所述抗原的所述片段鑒定為包含所述抗原特異性T細胞對其應答的免疫刺激 表位。18. 根據權利要求17所述的方法，其中所述兩個活化細胞因子選自：（a)IFNy和TNFa、 (b)IFNy 和IL-6以及（c)TNFa和IL-6。19. 一種制備用于治療患有疾病的患者的組合物的方法，所述方法包括： (a) 根據權利要求1所述的方法檢測來自所述患者的樣品中的抗原特異性T細胞，并且 鑒定與所述疾病相關的抗原的免疫刺激表位和所述抗原特異性T細胞對其應答的免疫刺激 表位；以及 (b) 使用所述鑒定的免疫刺激表位增殖從所述患者分離的T細胞。20. 根據權利要求19所述的方法，其中所述疾病是癌癥，并且所述抗原是與所述癌癥相 關的腫瘤相關抗原或腫瘤特異性抗原。21. 根據權利要求20所述的方法，還包括最后一個步驟使所述增殖的T細胞減弱的步 驟。22. 根據權利要求21所述的方法，其中所述疾病是自身免疫疾病，并且所述抗原是與所 述自身免疫疾病相關的自身抗原。23. -種組合物，其包含根據權利要求19所述的方法制備的T細胞。24. -種治療疾病的方法，所述方法包括施用根據權利要求19所述的方法制備的組合 物。
【文檔編號】G01N33/50GK105992950SQ201480074688
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2014年12月19日
【發明人】D·希利, L·W·科利森
【申請人】歐普薩治療股份有限公司