尿液載脂蛋白c-ii的應用
【專利摘要】本發明提供一種尿液載脂蛋白C-II(Apolipoprotein C-II，Apo C-II)的應用，具體為尿液載脂蛋白C-II在尿液中的表達及其用于尿液含量檢測中的應用。本發明通過研究證實尿液中載脂蛋白C-II有較高豐度的表達，因此通過對尿液中載脂蛋白C-II表達量的檢測獲得對于診斷疾病的信息。本發明發揮尿液標本獲取可大規模重復取樣的優勢，利用隨機尿標本檢測載脂蛋白C-II。
【專利說明】
尿液載脂蛋白C-I I的應用
技術領域
[0001] 本發明設及尿液載脂蛋白C-II的新用途，具體設及載脂蛋白C-II在尿液中的表 達及其在尿液含量檢測中的應用。
【背景技術】 陽00引 Apo C-II基因與ApoC-I、ApoE基因成簇排列，位于19號染色體長臂ql3區。Apo C-II基因長3320bp，含4個外顯子和3個內含子。ApoC-n是由79個氨基酸殘基組成的單 鏈多膚，不含半脫氨酸和絲氨酸，共有兩種多態型，等電點分別為4. 86和4. 69,其二級結構 中a -螺旋約占23%。Apo C-II是CM、VLDL和皿L的結構蛋白之一，分別占其蛋白成份的 14% ,7%-10%及1 %-3%。Apo C-II是Apo C家族中最重要的亞型之一，它是LPL的輔 助因子，在脂類代謝中發揮著重要的作用，可激活多種來源的脂蛋白脂肪酶（LPL)。其結構 中第55-78位氨基酸殘基是維持其對LHJ敦活作用的最短必需區域。簇基端43-50位氨基 酸殘基為a螺旋結構的脂質結合。Apo C-II具有多種生物學功能：（1)激活LPL。Apo C-II 為LPL的輔助因子，它可激活多種來源的LPL。其激活機制可能是LP L通常存在于外周循 環與肝素樣分子結合，并附著于血管內上。當LI^L接觸乳糜微粒（CM)或極低密度脂蛋白 (VLDL)時，LI^L便同脂蛋白顆粒表面的憐脂發生作用進而結合于脂蛋白顆粒上。（2)維持脂 蛋白的穩定性。應用巧光光譜法研究Apo C-II簇基端19-39位氨基酸殘基，發現其a-螺 旋不僅能介導蛋白質與脂質表面結合，而且它不是自身締合，而是通過與Apo C-II內其它 雙極性螺旋及載脂蛋白締合，從而維持脂蛋白的穩定性。（3)保護血管內皮細胞，在阻止動 脈粥樣硬化的形成方面發揮重要的作用。
[0003] Apo C-II的缺乏或異常能導致脂蛋白代謝素亂。Apo C-II與L化發生作用，可W 改變LI^L的結構，從而可催化水解甘油=醋，只有基因適度表達才可W激活LPL的活性，過 度表達或者缺失均會導致甘油S醋血癥。有研究發現Apo C-II缺陷可W導致血漿TG、VLDL 及乳糜微粒水平的升高和LD^mL和皿L水平的降低。Apo C-II缺陷病人是多種多樣，但 是大部分已經確定。其Apo C-II基因內含子剪接體位點的缺陷，可W導致血漿Apo C-II 的低水平。此外，Apo C-II缺陷合成或者產生的非功能性Apo C-II被認為是由各種單一 的氨基酸替換導致的。Apo C-II基因多態性常見于冠屯、病、糖尿病等一些老年性疾病患者。 有研究發現腦梗死組發病初期血清Apo C-II含量最高，隨著病情的恢復腦梗死組血清Apo C-II含量呈逐漸降低的趨勢。Apo C-II水平異常與急性腦梗死發生密切相關，并與急性腦 梗死病情嚴重程度存在著明顯的相關性，監測其水平變化對于腦梗死的預防、病情改善有 重要意義。動態測定腦梗死患者血清中Apo C-II水平變化有助于腦梗死的早期診斷及預 后推測，為腦梗死患者的預防和病情變化提供一定的依據。有研究表明，高濃度的Apo C-II 是C皿的危險因素之一，并且與高濃度的TG相比，Apo C-II濃度的增加是CHD發生更加敏 感的指標。有研究者發現與無 C皿的2型糖尿病患者相比，2型糖尿病合并冠屯、病患者體 內存在更高濃度的Apo C-II。臨床實驗表明慢性乙肝、肝硬化患者皿^1化、膽固醇均呈顯 著下降趨勢，測定Apo C-II的變化能夠準確、直接、快速地反映肝病各個時期的脂質代謝情 況。膽固醇結石患者血清Apo C-II水平與膽汁膽固醇含量呈正相關。因此，通過檢測Apo C-II等Apo指標的變化可W反映膽固醇結石患者脂質代謝變化及其在膽結石成因中的地 位和作用。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于提供一種尿液載脂蛋白C-II在尿液中的表達及其用于尿液含 量檢測中的應用。 陽〇化]優選地，所述尿液載脂蛋白C-II的氨基酸序列如SEQ ID NO :1所示
[0006] TQQPQQDEMP SPTFLTQVKE 化SSYWESAK TAAQNLY邸T 化PAVD邸LR DLYSKSTAAM STYTGTFTDQ 化SVLKGEE
[0007] 優選地，所述制劑為尿液載脂蛋白C-II檢測試劑盒。所述試劑盒為抗體抗原反 應。
[0008] 優選地，所述抗原抗體反應由尿液載脂蛋白C-II或多膚W及其抗體被包被或標 記在固相或液相載體。
[0009] 發明人首先收集了正常體檢的隨機尿液標本，離屯、后取上清，利用弱陽離子交換 磁珠純化和分離尿液標本。將1 y 1標本與10 y 1基質（0. 3%的a -氯基-4-徑基肉桂酸， 肥CA)混勻后，取 Iul 點在 Ancho;rchip(Autoflex MALDI T0F，B;r址er-Dalton)勒!板上，標 本離子化后進行質譜分析，采集1000-10000化范圍內的數據，獲得由不同質荷比的蛋白峰 構成的質譜多膚圖。應用ClinProTools2. 1分析軟件所有質譜圖進行分析，篩選出穩定表 達的高豐度蛋白多膚。然后發明人利用液相色譜串聯質譜儀對運些篩選出的蛋白多膚進行 鑒定，在 International Protein Index (IPI human v3. 45f曰st曰 with 71983entries)數 據庫檢索得到載脂蛋白 C-II(Apolipoprotein C-II，Apo C-II)。
[0010] 本發明通過研究證實載脂蛋白C-II能夠在正常體檢的人的尿液中穩定出現。從 而提出檢測尿液載脂蛋白C-II可用于尿液相關檢查中的應用。
[0011] 本發明發揮尿液標本獲取無創的優勢，利用隨機尿標本檢測載脂蛋白C-II或者 多膚。
[0012] 為讓本發明的上述和其它目的、特征和優點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例， 并配合附圖，作詳細說明如下。
【附圖說明】
[0013] 圖1是質荷比為1000-10000之間所有點在30例正常體檢標本中的平均值。
[0014] 圖2是質荷比為1735. 7的點在30例正常體檢標本中表達的散點圖。
[0015] 圖3是載脂蛋白C-II的質譜圖。
【具體實施方式】
[0016] 連施倆I 1尿液標本的收集與處理
[0017] 收集30例正常體檢（首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院體檢中屯、）隨機清潔中 段尿液標本，2h內離屯、（1500巧m，5min)，保留上清。分裝后-80°C冰箱凍存。
[0018] 連施例2磁珠純化和分離尿液標本中的多膚
[0019] 從-80°c冰箱取出尿液標本，4°C復融，離屯、（3000巧m，10min)后取上清備用。室 溫下平衡弱陽離子磁珠（MB-WCX)，并手動混勻磁珠懸浮液。在樣品管中加入IOul MB-WCX 和IOul磁珠結合緩沖液，加樣槍上下吹打混勻，避免起泡。向樣品管中加入加1尿液上清， 充分混勻后磁力架上靜置1分鐘，磁珠與懸浮的液體分離。用加樣槍除去懸浮的清澈液體， 槍頭應避免接觸到磁珠，避免吸走磁珠。在樣品管中加入IOOul磁珠清洗緩沖液，充分混勻 后將樣品管在磁力架上靜置1分鐘，磁珠貼壁，與懸浮的液體分離，用加樣槍除去懸浮的液 體。重復3次，棄去懸浮液。在樣品管中加入加1磁珠洗脫緩沖液，反復吸打10次W上，使 磁珠和洗脫緩沖液混勻，避免起泡。將樣品管放置于磁力架上，靜置2rmin，使磁珠與懸浮液 充分分離，將上清液（洗脫液）移入已標記的新的0. 5ml樣品管。加入加1穩定緩沖液，加 樣槍小屯、吹打混勻。
[0020] 連施例3尿液標本的點祀與多膚譜圖的生成
[0021] 用標準品校正儀器后，將Iyl洗脫液與IOyl基質（0.3%的a-氯基-4-徑基 肉桂酸，肥CA)混勻，取 Iji 1 點在 Anchorchip (Autoflex MALDI T0F，B;r址er-Dalton)革己板 上，室溫干燥。通過氮激光器照射使標本離子化后進行質譜分析，采集1000-10000化范圍 內的數據，獲得由不同質荷比的蛋白峰構成的質譜圖。對于每一個MLDI結晶點來說，共照 射400次激光（每個結晶點的8個不同的位置各照射50次），平均值代表一個標本，從而得 到所有樣本的多膚圖譜。應用ClinProTools2. 1分析軟件對正常對照組、2型糖尿病無并發 癥及合并癥組和2型糖尿病合并早期腎損傷組的質譜圖進行分析，篩選差異性多膚。篩選 條件：質量范圍1000-10000化，信噪比（S/N)大于5,質量飄移不超過0. 1%，所有質譜圖根 據總離子流進行歸一化。具體請參照圖1，其示30例尿液標本中1000-10000化之間所有質 荷比的點的平均值；峰面積作為定量的標準，圖2示出載脂蛋白C-II在所有尿標本中的表 達，從圖中可W看出m/z 1735. 7在所有標本中的峰面積都大于600。
[0022] 連施例4蛋白多膚的鑒定
[0023] 將樣品管中磁珠洗脫液旋轉蒸干，加入20ul流動相A6%乙臘，0. 1%甲酸的水溶 液）溶解，轉移至進樣瓶中。進樣體積18ul，首先W 15y Vmin的速度進入捕集柱脫鹽，捕 集時間3min。然后W 40化1/min的流速進入分析柱進行梯度洗脫，洗脫梯度為5% B-50% B-80% B-80% B-50% B-5% B (流動相B :95%乙臘，0. 1 %甲酸的水溶液，見表1)。分析時間 60min，色譜柱溫度35°C，所有洗脫成分進入質譜儀分析。Nano離子源，噴霧電壓1. SkV ;質 譜模式為數據依賴及動態排除，掃描范圍400-2000m/z ;-級掃描（M巧使用化itrap，分辨 率設定為100000 ;CID及二級掃描使用LTQ ;在MS譜圖中選取強度最強的10個離子的單一 同位素作為母離子進行MS/MS (單電荷排除，不作為母離子）。質譜掃描時間60min。應用數 據分析軟件Bioworks&rowser 3. 3. ISPl進行Sequest?檢索。檢索數據庫為International Protein Index (IPI human v3.45fasta with 71983ent;ries)。母離子誤差設定為 lOOppm， 碎片離子誤差設為IDa，酶切方式為非酶切，可變修飾為甲硫氨酸氧化。檢索結果參數設定 為 deltacn^O. 10,兩電荷 Xcorr 2. 6，S電荷 Xcorr 3. 1，S電荷 W上 Xcorr 3. 5。在數據 庫中檢索得到蛋白載脂蛋白C-II，載脂蛋白C-II的質譜圖請參照圖3。
[0024] 表1分析柱梯度洗脫的程序 陽0巧]
[0026] 連施倆I 5試劑盒的制備
[0027] 1.包被抗體和酶標抗體工作濃度的選擇
[0028] 按照Pierce公司的BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書操作，測定抗體及抗原的 濃度，然后采用標準的棋盤測定方法，用包被緩沖液將兔抗人載脂蛋白C-II多克隆抗體 (Abeam公司）稀釋至濃度為10.0 ng/ml、1.化g/ml和0.1 ng/ml，分別在固相化ISA板和液 相磁珠上包被，每個濃度包括=個縱行，4°C過夜，洗涂3次。在其中一個橫行的包被孔中加 入強陽性抗原液，另一橫行中加入弱陽性抗原液，第=行加入陰性對照。37°C解育2小時， 洗涂3次。加入鼠抗人載脂蛋白C-II單克隆抗體（Abeam公司），37°C解育1小時，洗涂3 次。加入標記的二抗，37°C解育30分鐘，洗涂4次，加入底物，室溫避光放置20分鐘，加入 中止液，讀數。選擇包被抗體最佳濃度。
[0029] 2.試劑盒的制備
[0030] 將兔抗人載脂蛋白C-II多克隆抗體用包被緩沖液進行稀釋，將其加入到固相微 孔板和液相磁珠中，4°C包被輕搖過夜。倒去未包被的液體，洗涂3遍，加入阻滯液阻止非特 異性結合位點，37°C解育1小時，洗涂3次。放入4°C保存備用。試劑盒分裝加入鼠抗人載 脂蛋白C-II單克隆抗體、標記的二抗等。
[0031] 連施倆I 7試劑盒靈敏度的檢測
[0032] 將載脂蛋白C-II重組蛋白（德國化iGene公司）用PBS稀釋成20化g/ml、10化g/ ml、50ng/ml、25ng/ml、10ng/ml、2ng/ml、0. 5ng/ml、0. 05ng/ml、0. 01ng/ml、0ng/ml，每手L IOOul加入到上述包被好的酶標板中和液相磁珠中，37°C解育2小時，洗涂3遍。按I : 2000 將鼠抗載脂蛋白C-II單克隆抗體稀釋，每孔加入100ul，37°C解育1小時，洗3遍。加入標 記二抗，37°C解育30分鐘，洗3遍。加入底物室溫放置15分鐘，加入終止液，讀數。檢測最 低的載脂蛋白C-II量，結果顯示，該試劑能檢測出0.0 lng/ml載脂蛋白C-II的濃度，說明 具有較高的檢測靈敏度。經上述實驗表明本發明的試劑盒檢測尿液樣本中載脂蛋白C-II 的含量，具有很高的靈敏度，樣本的最低檢測限O.Olng/ml，回收率為90% ±13%。本試劑 盒所需儀器較少，只需要酶標儀、振蕩器、離屯、機、移液器等，所需成本低。
[0033] 連施倆I 8試劑盒的特異性、穩定性的檢測
[0034] 取正常體檢（首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院）待測清潔中段隨機尿30-50ml， 裝入清潔的尿管，女性留取尿標本時應避開經期，應防止陰道分泌物混入尿液中，常溫下 1500巧m離屯、5分鐘，取上清待檢。
[0035] 純化定量的載脂蛋白C-II重組蛋白作為標準品，將抗原（離屯、后的尿標本）按 1 : 3稀釋后，加入到前面已經包被好的酶標板中，37°C解育2小時，洗去未結合的抗原，吸 干殘余液體。加入鼠抗人載脂蛋白C-II單克隆抗體37°C解育1小時，洗去未結合的抗體， 吸干殘余液體。加入標記的二抗，37°C解育30分鐘，洗涂4次，吸干殘余液體。加入顯色底 物，室溫放置10分鐘，加入終止液終止反應，酶標儀讀數，計算樣本中載脂蛋白C-II的含 量。
[0036] 通過該方法，發明人檢測了 100例正常體檢隨機尿中載脂蛋白C-II含量，準確率 達到97% W上，具有良好的特異性。
[0037] 分別取兩位正常體檢的隨機尿，利用上述方法進行了 ELISA測定，每天測定一次， 共重復10次，按公式變異系數（CV) = S/XX 100% (S為標準差，X為平均值）計算批間及 批內變異系數。最終得到批內與批間變異系數分別為2. 81%和3. 26%，說明穩定性好。
[0038] 雖然本發明已W較佳實施例披露如上，然其并非用W限定本發明，任何所屬技術 領域的技術人員，在不脫離本發明的精神和范圍內，當可作些許的更動與改進，因此本發明 的保護范圍當視權利要求所界定者為準。
【主權項】
1. 載脂蛋白C-II及其多肽在尿液中的表達及其在尿液含量檢測中的應用。2. 根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述尿液載脂蛋白C-II的氨基酸序列如 SEQ ID NO :1 所示。3. 根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述制劑為尿液載脂蛋白C-II或多肽檢 測試劑盒。4. 根據權利要求3所述的應用，其特征在于，所述試劑盒為抗原抗體反應。5. 根據權利要求4所述的應用，其特征在于，所述反應為尿液載脂蛋白C-II或多肽以 及其抗體被包被或標記在固相或液相載體。
【文檔編號】G01N33/535GK105988007SQ201510067730
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2015年2月10日
【發明人】張曼, 付廣真, 雷婷
【申請人】張曼