用于乳腺癌診斷的聯合腫瘤標志物及其試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種用于乳腺癌診斷的聯合腫瘤標志物及其試劑盒，所述標志物包括：天冬酰胺內肽酶和泛素連接酶TRAF6。該試劑盒包括：檢測天冬酰胺內肽酶或其編碼基因的表達情況或表達量的診斷試劑；以及檢測泛素連接酶TRAF6或其編碼基因的表達情況或表達量的診斷試劑。本發明的AEP和Traf6可以作為一種乳腺癌聯合檢測標志物，開發商業試劑盒，其用于乳腺癌早、中、晚期診斷；而棉酮牛磺酸鈉可作為一種候選藥物，以下調AEP及其活化的蛋白為途徑，抑制乳腺癌轉移，因而，對于乳腺癌藥物的開發奠定了基礎。
【專利說明】
用于乳腺癌診斷的聯合腫瘤標志物及其試劑盒
技術領域
[0001] 本發明設及一種腫瘤標志物，特別是設及一種用于乳腺癌診斷的聯合腫瘤標志物 及其試劑盒。
【背景技術】
[0002] 據WHO統計，每年全球新發乳腺癌病例超過100萬，全世界每年約有50萬人死 于乳腺癌，乳腺癌仍然是世界女性腫瘤患者中的首要種類的癌癥化Oblinski巧，Ahram M, Sloane BF. Unraveling the role of proteases in cancer. Clinica Chimica Acta 2000 :291 (2) :113-135)。在西歐、北美等發達國家，乳腺癌發病率占女性惡性腫瘤首位。中 國疾病預防控制中屯、健康教育所最新發布的《中國乳腺癌防治現況報告》顯示，乳腺癌已經 成為威脅婦女健康的最常見的惡性腫瘤，中國是乳腺癌發病率增長最快的國家之一，中國 抗癌協會公布的統計數字顯示，我國近年來乳癌發病率正W每年3%的速度遞增，成為城市 中死亡率增長最快的癌癥，發病年齡也呈逐漸年輕化的趨勢。
[0003] W手術為主，綜合治療乳腺癌雖然取得了較好的療效，但術后復發和轉移仍是影 響生存率和死亡率的關鍵因素。腫瘤的侵襲和轉移使惡性腫瘤的主要生物學特征，是影響 治療結果和病人預后的重要因素，一直是腫瘤研究的難點。
[0004] 天冬酷胺內膚酶（Asparagin}d E：ndopeptidase，AEFO是新近發現的一種溶酶 體蛋白酶，屬于半脫氨酸蛋白酶C13家族，其對底物的選擇有嚴格的專一性度arrett AJ,民awlings ND,0'Brien EA. The MEROPS database as a protease information system. Journal of Structural Biology 2001 :134(2-3) :95-102) D AEP 在腫瘤組織中大量表達， 而在正常組織中表達量卻很化（Clerin V，SMh 皿，Deng N, Hebert G, Resmini C, Shields KM，et al. Expression of the cysteine protease Iegumain in vascular lesions and functional implications in atherogenesis. Atherosclerosis2008 ;201 (I):53-66)。目 前已發現AEP在多種實體瘤（乳腺癌，結腸癌，卵巢癌等）和淋己瘤中表達上調。前期通過 基因表達譜和免疫組織化學實驗，我們發現AEP在腫瘤組織的腫瘤相關巨瞻細胞中也高表 達。并且，在結腸癌、乳腺癌中報道AEP與腫瘤病人預后呈負相關（Gawenda J，Traub F，Luck HJ, Kreipe H, von Wasielewski 民.Legumain expression as a prognostic factor in breast cancer patients. Breast Cancer Research and Treatment 2007 ;102(I):1-6)， 這些都提示該分子是潛在的原癌基因。
[000日]TRAF6 (Tumor necrosis factor receptor-associated factor 6)作為一個新發 現的重要的泛素 E3連接酶，介導K63多聚泛素化修飾。TRAra作為多種信號途徑中的重要 接頭分子，介導了包括TNF受體超家族和IL-I受體/TLR超家族在內的多條信號通路的激 活，對固有免疫，適應性免疫和骨平衡的維持至關重要化eng LWang C，Spencer E，Yang LY, Braun A, et al. Activation of the I kappa B kinase complex by TRAF6requires a dimeric ubiquitin-conjugating enzyme complex and a unique polyubiquitin chain. Cell 2000;103(2):351-361)。同時有文獻報道，TRAF6的功能不僅僅如此，它還參與了與 細胞存活和致癌相關的Akt信號途徑，運暗示著TRAro很可能是一個先前未發現的致癌基 因 （Yang WL, Wang J, Qian CH, Lee SW, Campos AD, et al.The E3 Ligase TRAFGRegulates Akt Ubiquitination and Activation. Science2009;325 巧944): 11134-1138)。TRAF6 的 重要性預示著其底物分子的獨特性和多樣性。和TRAF家族的其他成員不同，TRAra通過 其獨特的TRAF-C區域和其他分子相互作用，晶體結構分析表明運些底物分子與TRAro的 結合位點非常保守，即運些底物分子都含有P-X-E-X-X-Y基序燈e H，Arron JR，Lamothe B,Cirilli M, Kobayashi T, et al.Distinct molecular mechanism for initiating TRAF6si即ailing.化Uire 2002 ;418化896) :443-447)。我們初步篩選分析發現天冬酷胺 內膚酶AEP同樣具有保守的TRAro結合位點。我們的初步研究表明在腫瘤特殊的微環境下 (包括低氧，微酸，低糖等非正常的生理環境等），TRAF6可W通過調控AEP的活性來影響腫 瘤的發生和轉移。
[0006] 因此，研發一種新型乳腺癌檢測標志物，開發檢測試劑盒，開發W相應標志物為理 想祀點的藥物，無疑會為腫瘤的臨床診斷和治療帶來新的希望。
【發明內容】
[0007] 本發明要解決的技術問題是提供一種用于乳腺癌診斷的聯合腫瘤標志物及其試 劑盒。
[0008] 為解決上述技術問題，本發明的用于乳腺癌診斷的聯合腫瘤標志物，包括：天冬酷 胺內膚酶（AE巧和泛素連接酶TRAF6。
[0009] 另外，本發明還提供一種上述聯合腫瘤標志物在制備診斷試劑或試劑盒中的用 途，所述診斷試劑或試劑盒用于診斷乳腺癌，如所述診斷試劑或試劑盒用于診斷乳腺癌的 發生、侵襲或轉移。
[0010] 所述診斷試劑包括：特異性擴增天冬酷胺內膚酶（AE巧或泛素連接酶TRAro的編 碼基因的引物；特異性識別天冬酷胺內膚酶（AE巧或泛素連接酶TRAro的編碼基因或其轉 錄本的探針；或特異性抗擴增天冬酷胺內膚酶（AE巧或泛素連接酶TRAro的抗體。
[0011] 再者，本發明還提供一種用于乳腺癌診斷的試劑盒，其包括：檢測天冬酷胺內膚酶 (AE巧或其編碼基因的表達情況或表達量的診斷試劑；W及檢測泛素連接酶TRAro或其編 碼基因的表達情況或表達量的診斷試劑。
[0012] 所述檢測天冬酷胺內膚酶（AE巧或其編碼基因的表達情況或表達量的診斷試劑， 包括：特異性擴增天冬酷胺內膚酶（AE巧的編碼基因的引物；特異性識別天冬酷胺內膚酶 (AE巧的編碼基因或其轉錄本的探針；或特異性抗擴增天冬酷胺內膚酶（AE巧的抗體。
[0013] 所述檢測泛素連接酶TRAro或其編碼基因的表達情況或表達量的診斷試劑，包 括：特異性擴增泛素連接酶TRAro的編碼基因的引物；特異性識別泛素連接酶TRAro的編 碼基因或其轉錄本的探針；或特異性抗泛素連接酶TRAra的抗體。
[0014] 所述用于乳腺癌診斷的試劑盒，還可包括：常規的核酸提取試劑、PCR反應試劑、 蛋白免疫印跡試劑或酶鏈免疫反應試劑。
[0015] 此外，本發明還提供一種上述聯合腫瘤標志物在制備預防或治療乳腺癌的藥物中 的應用。
[0016] 所述預防或治療乳腺癌的藥物包括：預防或治療乳腺癌的發生、侵襲或轉移的藥 物；如抑制乳腺癌的發生、侵襲或轉移的藥物。
[0017] 所述藥物包括：如式（I)所示的棉酬牛橫酸鋼（ch282-5)，或棉酬牛橫酸鋼與藥學 上可接受的載體。
[0018]
[0019] 另外，本發明還提供一種下調上述聯合腫瘤標志物表達的化合物在制備預防或治 療乳腺癌的藥物中的應用。
[0020] 所述化合物可包括：棉酬牛橫酸鋼。
[0021] 所述預防或治療乳腺癌的藥物包括：預防或治療乳腺癌的發生、侵襲或轉移的藥 物；如抑制乳腺癌的發生、侵襲或轉移的藥物。 陽02引另外，本發明經研究發現：調查臨床數據，分析AEP和Trafe在乳腺癌中高表達情 況，說明AEP與Trafe的共同表現，可W作為乳腺癌檢測的分子標記物；此外，分子生物學方 法證明AEP和化af6與乳腺癌的侵襲轉移高度相關，細胞和動物實驗證明AEP和化af6是 抑制乳腺癌轉移的理想祀點，W及棉酬牛橫酸鋼能夠下調AEP，從而抑制乳腺癌轉移。 陽02引本發明中，因 AEP獨特的底物專一性和腫瘤特異性，AEP成為腫瘤祀向治療的理想 祀點。我們研究組已發表多篇針對AEP特異性激活釋放的前體藥物的研究。同時，我們從 臨床數據分析上建立了 AEP與腫瘤的相關性，并且還設計了多種針對AEP的抑制劑。
[0024] 棉酪衍生物一一棉酬牛橫酸鋼，能夠顯著下調AEP W及AEP調控的腫瘤轉移相關 蛋白，抑制乳腺癌的侵襲和轉移。AEP在腫瘤細胞和腎近曲小管細胞中表達，新型棉酪衍生 物棉酬牛橫酸鋼在腎臟回收利用，但是，動物實驗數據并未體現出明顯的腎臟損傷。因此， 棉酬牛橫酸鋼是一種理想的抗乳腺癌轉移的潛在化療藥物，依賴于下調AEP和AEP激活的 蛋白發揮功能。
[0025] 棉酬牛橫酸鋼有天然棉酪改造而成。天然棉酪分子內部具有兩個活性醒基，對動 物產生明顯的毒副作用，我們將運兩個活性醒基改造為酬基，顯著降低毒副作用。另外，在 R基團引入牛橫酸鋼基團，分子量小而水溶性大。經分析，棉酬牛橫酸鋼的疏水常數log P 為4. 63,處于理想的成藥水溶特性范圍內，作為小分子化合物（分子量804)的棉酬牛橫酸 鋼具備足夠的穩定性，易于制劑化，在體內作用時間長，持續殺滅原位的和轉移的乳腺癌細 胞。 陽0%] 本發明的有益效果分析如下。
[0027] 盡管AEP經典報道存在于溶酶體/內涵體組分，但AEP參與巧Clins A and E和 nucleoplasmic Ca2+的表達調控，細胞增殖等，暗示著AEP的功能不僅僅只是溶酶體降解酶 那么簡單。且AEP被發現存在于溶酶體/內涵提之外，在胞質中參與中風和老年癡呆等病 理過程。事實上，蛋白定位網站PSORT II OittpV/psort.hgc.化/)預測，AEP可能會存在于 細胞內多種位置，包括細胞膜，胞質，囊泡和內質網。先前的研究亦發現AEP在乳腺癌患者 腫瘤組織中的不同染色類型，即彌漫性，胞質小點和囊泡型。我們通過免疫電鏡和亞細胞組 分分離等實驗明確AEP在乳腺癌中的定位，即前體形式為主，且和TRAro共定位于胞質中。 根據文獻報道，溶酶體酶常W前體形式存在于胞質和分泌于胞外中。譬如，1989年發現的 cathepsin-D前體極大的聚集于乳腺癌細胞的胞質中。
[0028] 我們的數據進一步表明前體AEP和TRAro直接相互作用，且TRAro介導AEP的泛素 化修飾。有些推測在定位到溶酶體的過程中，蛋白酶因結構異常或其他的修飾，與Man-6-P 受體的互作異常，導致后邊不在繼續往溶酶體走，而分布到其他組分中。綜合我們的發現， 我們推測前體AEP是在溶酶體途徑早期的內質網合成后才進入胞質的。
[0029] TRAro過表達，尤其是在刺激情況下，可促進K63偶聯的AEP泛素化修飾，進而促進 HSP90 a的招募，增加胞內外的AEP水平。進而，我們發現過表達TRAF6可增加內涵體中AEP 的量，減少溶酶體中的AEP。并且，用MG132抑制蛋白酶體后，AEP無明顯變化，而用NH4C1 或化Ioroquine抑制溶酶體功能后，胞內AEP的量明顯增加。我們推測K63偶聯的泛素化 修飾減少了 AEP的溶酶體降解。有趣的是，我們檢測到80%的分泌型AEP存在于微泡結構 中。HSP90 a亦和分泌型的AEP有相互作用。AEP的分泌過程和模式需要進一步的研究。
[0030] 我們發現在乳腺癌病人的血清中存在大量的AEP，但是分泌型的AEP并沒有被泛 素化；而且，泛素化的前體AEP無法進行自活化，運可能是因為自活化位點（N32^和泛素化 位點（K318R)非常接近，多聚泛素鏈可能覆蓋了自活化位點。因為AEP的內切酶活性對其 促腫瘤侵襲和轉移至關重要，闡明前體AEP的活化過程有待進一步研究。據文獻報道，AEP 定位于腫瘤細胞的侵襲前緣，與integrins形成復合體，而結合的AEP可活化前體MMP2和 cathepsin L。運些下游分子在腫瘤的侵襲轉移中有重要作用，可W部分解釋AEP促進腫瘤 侵襲的現象。進一步尋找更多的AEP底物分子對闡明其功能很有幫助。循環中或分泌的 AEP可能被細胞內吞，活化后與integrin形成復合體。我們的數據表明，分泌型的AEP顯 著促進腫瘤的發生發展，而AEP抑制劑或單克隆抗體可有效抑制腫瘤侵襲和轉移。盡管其 它半脫氨酸家族的蛋白酶成員多，抑制劑專一性低，AEP是C13家族目前已知的唯一成員。 并且，AEP抑制劑（Aza-Asn-epoxides)具有極好的專一'性，和其他蛋白酶幾乎沒有交叉，如 chymotrypsin, P曰P曰in, C曰thepsin B, C曰thepsin L或C曰sp曰se-3〇總而言之，運些結果提示 分泌的AEP可作為潛在的血清檢測指標，并且AEP抑制劑或單克隆抗體祀向AEP亦是潛在 的腫瘤治療新策略。AEP已發現與腸癌，乳腺癌等的臨床病理和預后密切相關，并且TRAF6 是潛在的原癌基因，AEP和TRAro在惡性乳腺癌中高表達且與不良預后正相關，暗示著AEP 和TRAro可作為乳腺癌潛在的診斷指標。
[0031] 我們的研究掲示了一個全新的AEP調控機制，清晰的闡明了其在乳腺癌侵襲轉移 中的功能。我們提出AEP可作為潛在的診斷和治療指標。我們發現了 TRAro促癌的新途徑。
[0032] 綜上所述，AEP和Trafe可W作為一種乳腺癌聯合檢測標志物，開發商業試劑盒， 其用于乳腺癌早、中、晚期診斷；而棉酬牛橫酸鋼可作為一種候選藥物，W下調AEP及其活 化的蛋白為途徑，抑制乳腺癌轉移，因而，對于乳腺癌藥物的開發奠定了基礎。
【附圖說明】
[0033] 下面結合附圖與【具體實施方式】對本發明作進一步詳細的說明：
[0034] 圖1是AEP與TRAF6存在直接的結合；其中，圖A是分析MCF10A、MCF7、MDA-MB-231 培養基和細胞內AEP的分泌和表達量；圖B是對比培養基中AEP的前體形式和活化形式比 例；圖C是分析AEP高表達株轉入效率；圖D是預測AEP與Traf結合位點；圖E是分析轉 入AEP和Trafe的相互影響情況。 陽03引圖2是TRAF6增加細胞內外的AEP蛋白水平；其中，圖A是轉入Traf6和空載質粒 后對比培養基內AEP的分泌量；圖B是Western blot方法分析轉入Trafe和空載質粒后對 比細胞內和培養基中AEP的變化；圖C是分別敲除AEP和化af6對比培養基內AEP量的變 化；圖D是Western blot方法分析敲除AEP和Trafe對比培養基中和細胞內AEP量的變化； 圖E是轉入化af6和空載質粒后對比細胞內AEP量的變化；圖F是分別敲除AEP和化af6 對比細胞內AEP量的變化；圖G是轉入空載體和Trafe的不同片段，比較培養集中和細胞內 AEP量的變化。
[0036] 圖3是TRAro調節的AEP泛素化修飾增強腫瘤的侵襲轉移；其中，圖A是W AEP E214A和K318R位點突變的細胞為實驗對象，用劃痕實驗和化answell實驗分析細胞遷移 能力變化；圖B是用ShRNA干擾AEP表達，W及恢復AEP敲除，分析細胞遷移能力變化；圖C 是劃痕實驗對比敲除化af6和AEP的細胞的遷移能力；圖D是western blot檢查化af6和 AEP敲除和恢復效率；圖E是H&E染色分析AEP位點突變，AEP、Traf6敲除和恢復的細胞株 在動物體內肺轉移能力；圖F是分析肺轉移灶數目。
[0037] 圖4是分泌型的AEP促進腫瘤侵襲轉移；其中，圖A是構建AEP過表達質粒，利用 劃痕實驗，W空載質粒轉染組為對照比較空載級AEP高表達的細胞，W及在AEP抑制劑作用 下的遷移率；圖B是利用化answell實驗重復驗證上述結論；圖C是利用化answell實驗W 空載質粒轉染組為對照比較AEP高表達的細胞在不同濃度的AEP抑制劑作用下的遷移率； 圖D是比較不同處理下乳腺癌肺轉移情況；圖E是H&E染色，比較對照組、AEP過表達組、AEP 抗體添加組、AEPI處理組乳腺癌肺轉移灶的數目；圖F是所使用的AEPI的結構式；圖G是 比較AEPI處理的老鼠與對照組小鼠荷瘤大小。
[0038] 圖5是過表達AEP和TRAro與乳腺癌腫瘤病人的預后呈負相關；其中，圖A是H&E 染色和免疫組化的方法分析Trafe W及AEP在病人腫瘤組織中的表達情況；圖B是Western blot方法分析病人樣本內Traf6和AEP存在直接作用關系；圖C是Western blot方法分 析患者正常組織與腫瘤部位Traf6和AEP的表達情況；圖D是統計分析腫瘤患者正常組織 和腫瘤內Trafe W及AEP的表達情況；圖E是統計分析腫瘤患者不同部位血清內AEP表達 情況和濃度；圖F是統計分析Traf6與腫瘤病人預后的關系；圖G是統計分析AEP與腫瘤病 人預后的關系；圖H是統計分析AEP與Trafe與腫瘤病人預后的關系。
[0039] 圖6是棉酪衍生物ch282-5下調AEP，抑制乳腺癌侵襲轉移。其中，圖A是棉酬牛 橫酸鋼（ch282-5)結構圖；圖B是Western blot檢測不同濃度的ch282-5處理24小時的 MDA-MB231、MCF7、4T1細胞內AEP水平的改變；圖C是MTS方法檢測ch282-5處理72小時 后的細胞活力，分析半數抑制率ECw;圖D是劃痕實驗分析ch282-5對于4T1細胞遷移的抑 審IJ ;圖E是統計ch282-5處理的4T1乳腺原位瘤肺轉移老鼠的生存率；圖F是對比ch282-5 處理的老鼠4T1肺轉移情況。
【具體實施方式】 W40] W下實施例中所設及的試劑、質粒等，如未特別說明，則為商業化產品。其中，實驗 小鼠：SPF級巧7BL/6小鼠、裸鼠購自中國科學院上海實驗動物中屯、〔SYXK(滬）2003-0026, SCXK (滬）2002-003)。
[0041] 實施例1針對細胞和乳腺癌樣本的實驗 [00創（一）實驗過程
[0043] 材料和試劑：胎牛血清購自Gibco公司；細胞培養用青霉素-鏈霉素 、TRIzol RNA 提取試劑購自invitrogen公司；RPMI-1640、DMEM培養基購自Hyclone公司；KOD-plus、 RealMasterMix(SYBR Green I)試劑盒，反轉錄試劑盒購自東洋坊公司；限制性內切酶購 自Takara公司；T4DNA連接酶、western及IP裂解液購自碧云天公司；質粒大量抽提試 劑盒、質粒小量抽提試劑盒、膠回收試劑盒、DNA產物純化試劑盒購自Tiangen !Protein Inhibitor Cocktail、F*hos地Otase Inhibitor Cocktail 購買自 Roche 公司；硝酸纖維 素膜購買自Schleicher and Schuell Bioscience公司；羊多抗AEP購自R&D公司；兔 多抗 TRAF6 和鼠多抗 TRAF6 購自 Santa Cruz 公司；Anti - Flag M2Affinity Gel、鼠多 抗 hemagglutinin、兔多抗 Flag 和 hemagglutinin 貝勾自 Sigma ;Protein G Sepharose? 4 Fast Flow購自GE Healthcare公司；鼠多抗Actin抗體購自Sigma公司；多聚甲醒 (parafo;rmaldehyde，PFA)購自 Sigma公司；憐酸緩沖液（phosphate bufferd saline,PB巧 購自 Hyclone 公司；膜酶 I'rypsin 購自 Gibco 公司；Lipofectamine 2000 購自 Invihogen 公司；Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)貝勾自 Sigma 公司；Bicinchoninic acid 度CA) Protein Assay Kit 購自 Pierce 公司；E(X 反應試劑盒 SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate 貝勾自 Pierce 公司。 W44] I、免疫共沉淀和免疫印跡分析AEP與TRAro的關系及分布。
[0045] 實驗設及的細胞株 MDA-MB-231、MDA-MB-435、MDA-MB-453、MCF7 細胞（人乳腺癌 細胞）、MCFlOa細胞（人正常乳腺上皮細胞）、4T1細胞（小鼠乳腺癌細胞）、Raw264. 7 (小 鼠巨隧細胞），均購自中國科學院上海生科院細胞資源中屯、。
[0046] 真核表達載體PCDNA3. I-HA/-化AG和原核表達載體P-GEX-4T-1由中國科學院上 海高等研究院-系統生物學-腫瘤祀向治療實驗室提供，可W分別用來表達HA、FLAG融合 蛋白。原核表達載體P-GEX-4T-1用來表達GST融合蛋白。
[0047] 全細胞蛋白裂解液【20mM Tris-肥 1 (抑7. 5)、137mM 化C1、1. 5mM MgClzJmM 邸TA、lmM NaF、10mM焦憐酸鋼、25mM0-glyce;ro地OS地ate、10% (體積百分比）甘油， 1% (體積百分比）Triton X-IOOUmM正饑酸鋼】，置于4°C，用之前現加 ImM PMSF(購于 Sigma-Al化ich，57mM膽存液溶解于異丙醇）、1X蛋白酶抑制劑cocktailUOmM Okadaic Acid (購于Sigma-Al化ich，30 y M膽存液溶解于乙醇））。
[0048] Immunoblot 跑膠緩沖液（25mM Tris base, 0. 2M Glycine, 0. 1 % SD巧。
[0049] Immunoblot 轉膜緩沖液〔25mM Tris base, 0. 2M Glycine, 20% (V/V)甲醇，置于 4°C)〇 陽0加]IOXTBS〔20mM Tris-HCl (抑 7.4)，150mM 化ClK
[0051] TBST [1 XTBS,0.1 % (V/V)Tween-20) 0
[0052] Immunoblot 封閉液〔I XTBST，5% (W/V)脫脂奶粉)。
[0053] 細胞經培養后，細胞PBS洗一遍，棄上清，加入全細胞裂解液，反復吹打。冰上解 育30分鐘后，4°C，13200巧m高速離屯、10分鐘，取上清。蛋白濃度用BCA protein assay kit (Pierce, USA)檢測。加 SXLoading上樣緩沖液（含5%二琉基乙醇），水浴煮沸10分 鐘，待變性后，靜置至室溫，-80°C保存或上樣電泳。
[0054] 在免疫沉淀實驗中，Img蛋白與相應的蛋白抗體（終濃度為1 y g/ml)混合，溫和 振搖，4°C 過夜，再加 25 Jil Protein G Se 地 arose Ahst Flow 及抗體或 Anti-Flag M2 Affinity Gel (用PBS洗3次），4°C溫和振搖過夜。1000 g 4°C離屯、5分鐘，棄上清，所得免 疫沉淀復合物用細胞裂解液洗四次，加1 XLoading上樣緩沖液（含5%二琉基乙醇），水浴 煮沸10分鐘，變性后，靜置至室溫，-80°C保存或上樣電泳。 陽05引用BIO-RAD垂直電泳槽進行SDS-PAGE分離，分離膠濃度為10 %，濃縮膠5 %。電 泳條件：濃縮膠恒壓80V，分離膠恒壓120V。待指示劑漠酪藍泳至凝膠邊緣即終止電泳，取 出凝膠用于轉印。通過Mini Trans-Blol及(Bio-Rad)轉印儀把凝膠上的蛋白質區帶轉移 至 0.45]im 孔徑的 PVDF 膜（Schleicher&Schuell,Dassel,Ge;rmany)上。轉印電壓 100V， 4°C轉移化。轉印終止后取出轉印膜，用脫脂奶粉封閉液室溫封閉比。去離子水洗涂后再 用封閉液稀釋后的一抗中4°C溫和振搖過夜。TBS-T緩沖液洗涂3次后，將膜放入稀釋的 HRP-二抗中室溫作用比，TBS-T緩沖液洗涂3次，加入Supersi即al West Pico化學發光底 物（Pierce，USA)作用后，曝光，沖片。所得的X光片用掃描儀掃描。掃描圖象用如antity 化e軟件進行光密度分析。
[0056] 2、ShRNA 敲低 AEP 和 Traf 6 基因
[0057] 2. 1設計shRNA序列如下：
[0058] 人 AEP 敲低：5' -GATGGTGTTCTACATTGAA-3'（如沈Q ID NO. 1 所示）；
[0059] 鼠 AEP 敲低：5' -GCTCCAATGGCTGGTATAATT-3'（如沈Q ID NO. 2 所示）；
[0060] 人 TRAF6 敲低：5, -GCCACGGGAAATATGTAATATCT-3,（如沈Q ID NO. 3 所示）；
[0061] 鼠 TRAF6 敲低：5, -CAGAGCTACTATGAGTCTC-3'（如沈Q ID NO. 4 所示）；
[0062] 對照引物：5' -GTAGCGCGGTGTATTATAC-3'（如沈Q ID NO. 5 所示）；
[0063] 恢復突變序列：AEP :5' -AATGGTATTTTATATCGAG-3'（如沈Q ID NO. 6 所示）；
[0064] TRAF6:5, -GCCACGGGAAATATGTAATATCT-3,（如沈Q ID NO. 7 所示）。 陽0化]2. 2shRNA敲低序列方法：將細胞提前一夜鋪好；細胞長到80% -90 %密度時，更換 無雙抗的培養基；按照每個3. 5cm培養皿10 Ji g質粒，添加10 Ji L轉染試劑化ipo2000, Life SCI)的比例轉入質粒；6小時候更換培養基；24小時后利用western blot進行表達鑒定。 [0066] 3、定點突變、劃痕實驗、侵襲實驗W及實驗性肺轉移模型 陽067] 3. 1定點突變：W待突變的AEP和Trafe質粒（中國科學院上海高等研究院-系 統生物學-腫瘤祀向治療實驗室提供）為模板，用設計的引物及KOD-Plus酶進行PCR擴增 反應，獲得目的基因突變。設計點突變引物和恢復突變引物如下：
[0068] (I)Flag-AEPO(SlSR):
[0069] 化rward:GAATATGGGGAATACAGATTCTGTTGTATTTAGCACCATTCAACATCCTCCCCGGGATA (如沈Q ID NO. 8所示）；
[0070] Reverse:TATCCCGGGGAGGATGTTGAATGGTGCTAAATACAACAGAATCTGTATTCCCCATATTC (如 SEQ ID NO. 9 所示）。
[0071] (II)Flag-TRAF6 (C70A)
[0072] 化rward:AAATCCAAGTGCGGGGATTCAAAGCACTTTTGCGCGTCTGGCGCTAAGTGGTGGATTAC (如 SEQ ID NO. 10 所示） 陽07引 Reverse:GTAATCCACCACTTAGCGCCAGACGCGCAAAAGTGCTTTGAATCCCCGCACTTGGATTT (如 SEQ ID NO. 11 所示）
[0074] (III)Flag-TRAFe (K124R)
[0075] 化rward:TTATGATGAGGTCGCTGCAGATCCTGGTTTTAGCGTTATTCAGAATTTTTCAGGGAGCG (如 SEQ ID NO. 12 所示）
[0076] Reverse:CGCTCCCTGAAAAATTCTGAATAACGCTAAAACCAGGATCTGCAGCGACCTCATCATAA (如 SEQ ID NO. 13 所示）
[0077] 提取模板質粒DN A后，按如下樣品反應體系（50 y 1反應體系）：
[0078] IOXReaction Buffer 5 Ji 1 ;Sample plasmid 2 Ji 1 ;Sample primer (巧（lOpmol/ Ji I) I Ji I ；Sample primer (R) (lOpmol/ y I) I y I ；dNTP mixture (each 2. 5mM) 2 y I ;地2〇 38 yI ;K0D-plus Enzymely1。 陽0巧]按如下參數設置PCR擴增條件：1巧cle 95 °C 30sec ;20巧cle 95 °C 30sec ; 55°C Imin ;68°C Imin per plasmid kb。
[0080] PCR擴增反應完成后冰育5分鐘，然后置于室溫（避免反復凍融）。PCR反應結束 后使用化nl酶消化甲基化質粒從而選擇突變質粒DNA。準備PCR反應產物，加入1 y 1 (IOU/ yl)化nl酶37°C溫育1小時，反應完畢后在質粒DNA上會產生缺口，當把運個質粒DNA轉 入D冊a，將會被D冊a里面的T4連接酶連接好缺口。將10 y 1樣品加到50 y 1感受態細 胞里，然后放置在冰上30分鐘，42 °C熱激90秒，200巧m復活45分鐘，涂板，37 °C培養過夜， 挑白色單菌落進行測序分析，W便用于后續的分析位點突變而引起的效果變化實驗。 陽0川 3. 2劃痕實驗：細胞接種于6-孔板，當細胞密度長到90 %左右，用200 y 1槍頭劃 痕，并分別拍照記錄0小時和24小時的劃痕區域，并用公式計算出遷移能力（l-[current wound size/initial wound size])*100。
[0082] 3. 3侵襲實驗：實驗前先將細胞用無血清培養基培養12小時。將Matrigel鋪于 Transwell小孔上室，37°C凝結1小時后，將細胞鋪于其上。小孔下室放入200 y 1含10% FBS的培養基，待24或48小時后，用結晶紫進行細胞染色，拍照并計數穿過的細胞。
[0083] 3. 4實驗性肺轉移模型：細胞通過尾靜脈注射后，隨即分組，并給于不同處理（生 理鹽水，純化的 AEP 蛋白（4 Ji g/per mouse/per time), mouse anti-human AEP 抗體但 Hg/ per mouse/per time, R&D, MAB2199)或AEP抑制劑）一周兩次，連續給藥10周。當小鼠 (SPF級巧7BL/6小鼠）體重明顯減輕后，所有的小鼠用C〇2方法處死，取肺，固定。
[0084] 在解剖顯微鏡下計數肺轉移灶，包括直徑小于0. 5mm的轉移灶。每組包括6-8只 小鼠，重復3次。 陽0化]4、肥染色觀察腫瘤轉移情況
[0086] 二甲苯，5111；[]1;重復^次；100%酒精，5111；[]1;重復一次；95%酒精，5111；[]1;重復一次； 70%酒精，5min ;蒸饋水浸泡5min ;蘇木精，5min ;流水沖洗；氨水，潤洗；流水沖洗；伊紅， Imin ;95%酒精，Imin ; 100%酒精，Imin ;重復一次；二甲苯Imin ;重復一次；封片。
[0087] 5、新鮮收集的乳腺癌和癌旁正常組織中檢測AEP和TRAF6的表達情況
[0088] (I)樣本
[0089] 病人樣本采集分析。乳腺癌腫瘤病人的腫瘤組織，癌旁正常組織和外周血樣本收 集于瑞金醫院、上海交通大學醫學院。樣品的采集均經過病人的知情同意和機構審查委員 會批準。所有的樣品都病理明確診斷為乳腺癌。
[0090] 似ELISA檢測培養上清中的AEP : 柳川按稀釋一抗，IOOy 1/孔，室溫包板過夜。W洗液0). 05% Tween 20in PBS， 400 y 1/孔）洗板S次后，每孔加入300 y 1封閉液（1 % BSA，5% Sucrose in PBS)，室溫封 閉Ih。
[0092] 如上洗板=次后，加入細胞培養上清和標準品，室溫解育化。洗板=次后，按優化 濃度加入二抗，100 y 1/孔，室溫解育化。洗板=次后，加入Streptavidin-HRP,室溫避光 解育45min。洗板=次后，加入底物100 y 1/孔，室溫解育約15min，待標準曲線出現較理想 的顏色梯度時，每孔加入IM H2SO45O y 1終止反應。Sunrise酶標儀W 540皿為參考波長， 450nm為測量波長檢測OD值，計算含量。
[0093] (3)免疫組化分析組織表達AEP和Trafe的情況：
[0094] 烤片 65 °C，20min ;二甲苯，15min ;重復 S 次；100 %、95 %、80 %、70 % 酒精梯 度水化，每次3min，水洗；抗原修復，98°C，lOmin，冷卻至室溫；0. 3 %雙氧水（甲醇） 放置20min，去除內源的酶活性；PBS洗片S次，每次5min ;封閉液封閉30min ;Goat anti-human Iegumain antibody(R&D, AF2199)或 mouse anti-TRAF6antibody(Santa Cruz,D-10,sc-8409)l:50 稀釋，正常 goat 或 mouse IgG(R&D,AB-108-C)作為陰性對照。 4°C過夜；PBS洗片S次，每次5min ;二抗解育45min-l小時；PBS洗片S次，每次5min ; Vectastain Kit ABC reagent, 30min;PBS 洗片S次，每次 5min;DAB 顯色；蘇木素染色 Imin ;圭寸片。
[00巧]染色結束后，邀請瑞金醫院的3個病理醫生進行雙盲統計，得出結論。 陽096] 6、棉酬牛橫酸鋼作用
[0097] 棉酪衍生物降低AEP，抑制乳腺癌轉移，延長生存時間。Ba化C白鼠乳房接種4T1 細胞5 X IO5個/只，待腫瘤體積達到200mm 3時，對照組給與10 %乙醇，治療組給與用10% 乙醇溶解的ch282-5,統計生存期，解剖對比觀察乳腺癌肺轉移情況。
[0098] (二）實驗結果
[0099] 1、AEP與TRAF6存在直接的結合
[0100] 在乳腺癌細胞中，主要W前體形式的AEP為主，活性形式僅占很少一部分（圖 1.A)，蛋白定量分析結果表明，活性形式僅占了 AEP蛋白總量的10% (圖1.B)，由此 可見，腫瘤中AEP有獨特的功能和調控方式。通過運用生物信息學方法化ttp://elm. eu. org/)分析發現人源與鼠源的AEP均有保守的TRAF6結合位點P-X-E-X-X-(Aromatic/ Acidic)(圖1.D)，提示TRAF6可能是AEP的相互作用蛋白，接下來，構建AEPOiA-AE巧和 TRAF6 (Flag-TRAFS)表達質粒，共同轉染到肥K293T細胞中，當在肥K293T細胞中過表達 AEP時，前體和活性兩種形式均存在（圖1. C)。并且，雙向免疫共沉淀實驗結果表明HA-AEP 和Flag-TRAFS存在相互作用（圖1.巧。 陽10U 2、TRAF6增加細胞內外的AEP蛋白水平 陽10引發現當MDA-MB-231(圖2.A和圖2.B)過表達TRAro時，細胞內外的AEP蛋白含量 顯著增加，ShRNA敲低TRAF6表達水平時，AEP的蛋白水平顯著下降（圖2. C和圖2. D)。而 運些變化并未伴隨著mRNA的變化（圖2. E和巧，提示AEP的蛋白增加主要是通過翻譯后修 飾機制。而TRAro的突變體TRAF6NR (無 RING結構域）或單獨TRAF6-C域并無法如野生型 TRAF6 -樣促進細胞內外AEP的增加，暗示著TRAro的泛素 E3連接酶功能對AEP蛋白水平 的增加是至關重要的（圖2. G)。
[0103] 3、TRAro調節的AEP泛素化修飾增強腫瘤的侵襲轉移
[0104] 劃痕實驗和Matrigel-Transwell侵襲實驗發現，過表達野生型AEP的MDA-MB-231 細胞具有更強的遷移和侵襲能力（圖3. A)。反之，敲低AEP或TRAro顯著削弱了 MDA-MB-231 細胞的遷移和侵襲能力（圖3B，3C)。我們將MDA-MB-231 (肺轉移亞克隆-LM2)細胞尾靜 脈注射于裸鼠，8-9周后觀察肺轉移情況（圖3.化E和巧。AEP敲低后，肺轉移結點灶顯著 減少，和野生型相比，結點數降低了 90%，而用野生型AEP做恢復實驗依然可見明顯的轉移 灶結點，而用AE陽214A或AEPK318R恢復，肺轉移灶和敲低AEP的相差不大（圖3. E、巧， TRAro的敲低幾乎完全抑制了 MDA-MB-231的肺轉移能力，恢復實驗進一步證實TRAF6在腫 瘤侵襲和轉移中的重要性（圖3.化E和巧。總而言之，細胞水平和動物水平的實驗結果均 證實TRAro調節的AEP的多聚泛素修飾對腫瘤侵襲轉移的重要性。
[01化]4、分泌型的AEP促進腫瘤侵襲轉移
[0106] ELISA方法檢測上述小鼠血清中的AEP蛋白水平發現，循環血中的AEP蛋白含量和 肺轉移灶數呈正比，暗示著分泌型的AEP極可能是腫瘤轉移的重要部分。事實上，在培養基 中梯度添加收集自AEP過表達細胞株的富含AEP的上清，腫瘤的遷移和侵襲能力逐步增加 (圖4. A和B)，直接添加 AEP蛋白同樣能夠促進腫瘤侵襲（圖4. C)，表明分泌的AEP可促 進腫瘤侵襲和轉移。而尾靜脈注射AEP蛋白亦顯著促進腫瘤轉移灶的形成（圖4. D和巧。 相反，用高親水的穿膜能力差的AEP抑制劑（Aza-Asn epoxides, AEPI)(圖4.巧預處理富 含AEP的上清，抑制其內切酶活性之后，細胞的遷移和侵襲能力明顯受到抑制（圖4. G)。同 時，尾靜脈注射AEP抑制劑或單克隆抗體W干擾循環系統中的AEP亦顯著抑制了腫瘤的發 生和發展（圖4. A，B，G)。運些結果表明，分泌型的AEP對腫瘤發生發展起著重要作用。 陽107] 5、過表達AEP和TRAF6與乳腺癌腫瘤病人的預后呈負相關
[0108] 首先在新鮮收集的乳腺癌和癌旁正常組織中檢測AEP和TRAF6的表達情況，發現 AEP在乳腺癌組織中高表達（圖5, A，B，C)。而病人樣本的免疫共沉淀實驗分析結果亦證實 AEP和TRAro的相互結合（圖5. D)。收集了 90例乳腺病人的血清樣品，ELISA和免疫印跡 實驗結果都證實AEP在惡性乳腺癌患者的血清中大量存在，而在健康人和良性的乳腺纖維 素瘤中表達很低（P<〇. 0001)(圖5.巧。 陽109] 收集了 313例乳腺癌樣本，并做成組織忍片。免疫組化法檢測AEP的表達，統計分 析表明AEP和TRAro的表達有極強的相關性。跟蹤隨訪134例腫瘤病人進行存活分析，高表 達AEP或TRAF6的腫瘤病人預后明顯必低表達的腫瘤病人差，中位生存時間顯著降低（圖 5. F和G)。而AEP和TRAF6均高表達的腫瘤病人預后最差（圖5. H)。AEP/TRAF6低表達的 腫瘤病人平均存活時間是111個月[95%置信區間：108-115個月]，而高表達AEP/TRAF6 的腫瘤病人僅為61個月[95%置信區間：42-79個月]。綜上所述，運些結果表明AEP和 TRAra在乳腺癌中高表達，與腫瘤病人不良預后密切相關，是潛在的生物學指標和潛在的治 療祀點。
[0110] 6、棉酪衍生物ch282-5下調AEP，抑制乳腺癌侵襲轉移 陽11U 發現棉酪衍生物一一棉酬牛橫酸鋼（油282-5,圖6. A)能夠明顯下調AEP，抑制乳 腺癌細胞增殖和轉移（圖6. B，C)，劃痕實驗表明，油282-5能夠明顯抑制4T1細胞遷移。 [0112] 此外，還進行了動物實驗檢測，對比ch282-5給藥物和對照組，我們發現，ch282-5 能夠明顯延長4T1荷瘤小鼠的壽命，降低乳腺癌肺轉移（圖6.化巧。運說明，AEP作為一種 聯合乳腺癌標志物的同時，也成為抑制乳腺癌轉移的祀點之一。
【主權項】
1. 一種用于乳腺癌診斷的聯合腫瘤標志物，其特征在于，包括：天冬酷胺內膚酶和泛 素連接酶TRAro。2. -種如權利要求1所述的聯合腫瘤標志物在制備診斷試劑或試劑盒中的用途，其特 征在于：所述診斷試劑或試劑盒用于診斷乳腺癌。3. 如權利要求2所述的用途，其特征在于：所述診斷試劑或試劑盒用于診斷乳腺癌的 發生、侵襲或轉移； 所述診斷試劑包括：特異性擴增天冬酷胺內膚酶或泛素連接酶TRAra的編碼基因的引 物；特異性識別天冬酷胺內膚酶或泛素連接酶TRAro的編碼基因或其轉錄本的探針；或特 異性抗擴增天冬酷胺內膚酶或泛素連接酶TRAra的抗體。4. 一種用于乳腺癌診斷的試劑盒，其特征在于，包括：檢測天冬酷胺內膚酶或其編碼 基因的表達情況或表達量的診斷試劑；W及檢測泛素連接酶TRAF6或其編碼基因的表達情 況或表達量的診斷試劑。5. 如權利要求4所述的試劑盒，其特征在于：所述檢測天冬酷胺內膚酶或其編碼基因 的表達情況或表達量的診斷試劑，包括：特異性擴增天冬酷胺內膚酶的編碼基因的引物； 特異性識別天冬酷胺內膚酶的編碼基因或其轉錄本的探針；或特異性抗擴增天冬酷胺內膚 酶的抗體； 所述檢測泛素連接酶TRAra或其編碼基因的表達情況或表達量的診斷試劑，包括：特 異性擴增泛素連接酶TRAro的編碼基因的引物；特異性識別泛素連接酶TRAro的編碼基因 或其轉錄本的探針；或特異性抗泛素連接酶TRAra的抗體； 所述試劑盒還包括：核酸提取試劑、PCR反應試劑、蛋白免疫印跡試劑或酶鏈免疫反應 試劑。6. -種如權利要求1所述的聯合腫瘤標志物在制備預防或治療乳腺癌的藥物中的應 用。7. 如權利要求6所述的應用，其特征在于：所述預防或治療乳腺癌的藥物包括：預防或 治療乳腺癌的發生、侵襲或轉移的藥物。8. 如權利要求7所述的應用，其特征在于：所述藥物包括：如式（I)所示的棉酬牛橫酸 鋼，或棉酬牛橫酸鋼與藥學上可接受的載體。9. 一種下調如權利要求1所述的聯合腫瘤標志物表達的化合物在制備預防或治療乳 腺癌的藥物中的應用。10. 如權利要求9所述的應用，其特征在于：所述化合物包括：棉酬牛橫酸鋼； 所述預防或治療乳腺癌的藥物包括：預防或治療乳腺癌的發生、侵襲或轉移的藥物。
【文檔編號】G01N33/574GK105987999SQ201510073979
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2015年2月12日
【發明人】郭方, 王雪楓, 嚴向明
【申請人】中國科學院上海高等研究院