一種基于酶聯免疫吸附技術的人中性粒細胞載脂蛋白異源二聚體定量裝置的制造方法

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一種基于酶聯免疫吸附技術的人中性粒細胞載脂蛋白異源二聚體定量裝置的制造方法
【專利摘要】一種基于酶聯免疫吸附技術的人中性粒細胞載脂蛋白異源二聚體(HNL/MMP?9)定量裝置，屬于免疫學檢測技術領域。由5倍樣品稀釋液、25倍洗液、HNL/MMP?9標準品濃度梯度凍干粉一套、抗MMP9抗體或抗HNL抗體包被的96孔酶標板、酶標抗HNL抗體溶液溶液或酶標抗MMP9抗體溶液、U型底96孔板、封板膜、酶底物溶液及終止液組成，所述HNL/MMP?9標準品為人源HNL/MMP?9。本發明特異性檢出HNL/MMP?9，而不檢出游離MMP?9、HNL及HNL同源二聚體。本試裝置使用時孵育只需兩步和清洗只需一步，顯著縮短檢測時間。因此，本發明具有特異性強和測試時間短等優點。本發明具有以HNL/MMP?9為標志物診斷疾病(如乳腺癌)的實驗室研究和潛在臨床應用價值。
【專利說明】
一種基于酶聯免疫吸附技術的人中性粒細胞載脂蛋白異源二聚體定量裝置
技術領域
[0001]本發明屬于免疫學檢測技術領域，具體涉及一種基于酶聯免疫吸附(ELISA)技術的人中性粒細胞載脂蛋白異源二聚體(HNL/MMP-9)快速定量裝置。
【背景技術】
[0002] 人中性粒細胞脂質運載蛋白（human neutrophil lipocalin，HNL)也稱中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白（neutrophil gelatinase associated lipocalin，NGAL)，是一脂質運載蛋白（J.Biol.Chem. 1993,268:10425-10432;Scand.J.Clin.Lab. Invest. 1994， 54: 365-376)。單體(momomer)、同源二聚體(homomer)及單體與MMP-9分子形成異源二聚體 (HNL/MMP-9)是HNL在體液中的分子存在形式，不同分子形式HNL與不同的病理過程有關。如單體HNL可能與急性腎損傷有相對較高的相關性（Lancet 2005,365: 1231-1238; Am· J · N印hro 1 · 2004，24:307-315)，HNL/MMP-9可能與腫瘤侵襲有關。Ceci 1 ia A· Fernandez 等人研究發現HNL/MMP-9與乳腺癌存在相關性，具有作為乳腺癌診斷生物標準物的潛力 (Clin.Cancer Res.2005,11:5390-5395)〇
[0003] 單獨定量HNL方法已經有很多公開報道，如國際專利W0/1995/029404A1、歐洲專利 EP 2225268和中國專利ZL200980155194、ZL201220323587、ZL201420423962、201510184818 等;定量MMP-9的方法如中國專利（申請號：201410180514.X)SPR(表面等離子共振)法檢測溶液中的MMP-9,Andrea Staack等報道了酶聯免疫吸附法(ELISA)定量MMP_9(BMC Urology 2006,6:1-19)
[0004] 除R&D Systems公司有一款HNL/MMP-9定量試劑盒產品(DM9L20)外，至今沒有其他關于HNL/MMP-9的準確定量方法相關專利和文獻的報道。R&D Systems HNL/MMP-9定量裝置產品說明書表明采用該裝置定量HNL/MMP-9需要用時約4.5小時，可見該產品十分費時。

【發明內容】

[0005] 為了實現HNL/MMP-9分子的特異性快速定量，本發明設計并開發出基于酶聯免疫吸附（ELISA)技術的HNL/MMP-9快速定量裝置。該裝置具有操作簡單和使用快捷等優異性能，在HNL/MMP-9作為腫瘤等疾病生物標志物的實驗室研究和未來臨床應用方面具有極大應用潛力。
[0006] 為了實現上述目標，本發明采取以下技術方案：
[0007] -種基于酶聯免疫吸附技術(ELISA)的人中性粒細胞載脂蛋白異源二聚體(HNL/ 麗P-9)快速定量裝置，其特征在于：由5倍樣品稀釋液、25倍洗液、HNL/MMP-9標準品濃度梯度凍干粉一套、抗MMP-9抗體包被的96孔酶標板或抗HNL抗體包被的96孔酶標板、酶標抗HNL 抗體或酶標抗MMP-9抗體、U型底96孔板、封板膜、酶底物溶液及終止液組成，所述HNL/MMP-9 標準品為人源HNL/MMP-9;所述酶標抗體所標記的酶可用辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等；所述定量裝置是指經兩步法可快速定量HNL/MMP-9，所述兩步法快速定量HNL/MMP-9是指裝置使用過程中孵育過程只需兩次，所述兩次孵育過程第一次是指將酶標抗HNL抗體加入抗 MMP-9抗體包被的96孔酶標板或酶標抗MMP-9抗體加入到抗HNL抗體包被的96孔酶標板后快速加入標準品濃度梯度溶液和樣品溶液后孵育20~40min，所述兩次孵育過程第二次是指第一次孵育后將抗MMP-9抗體包被的96孔酶標板或抗HNL抗體包被的96孔酶標板經洗液工作液清洗后指加入酶底物溶液孵育10~20min后加入終止液。
[0008] 將5倍樣品稀釋液用去離子水稀釋5倍獲得樣品稀釋液工作液;將25倍洗液用去離子水稀釋25倍制成洗液工作液;所述標準品濃度梯度溶液是指將HNL/MMP-9標準品濃度梯度凍干粉加入200yL樣品稀釋液工作液制成;所述樣品溶液是指經樣品稀釋液工作液稀釋后的體液樣本，所述體液樣本包括尿液、血清、血漿、腦脊液、唾液等。
[0009] 本發明裝置具體組成、制備及使用方法如下：
[0010] 1)本發明裝置組成
[0011] 表1:為本發明裝置組成
[0012]
[0013]
[0014] 2)制備方法
[0015] a)抗體包被的96孔酶標板的制備
[0016] (1)抗體包被酶標板
[0017] 將抗MMP-9抗體或抗HNL抗體用25~100mmol/L Na2C03-NaHC03、pH 9.6的碳酸鈉緩沖液稀釋到2~6yg/mL制成抗體包被液；向96孔酶標板每孔加1 OOyL抗體包被液;37 °C孵育 2h、室溫孵育4h或4°C過夜；
[0018] 抗MMP-9抗體可為商品化的抗MMP-9抗體（如Abeam的ab38898或ab51203等）或通過常規方法以MMP-9免疫動物制備的抗體或基因工程方法制備的抗MMP-9抗體，所述抗體可為單克隆抗體或多克隆抗體。
[0019] 抗HNL抗體可為商品化的抗HNL抗體（如Abeam的ab63929、ab23477或P&M Venge Diagnostics Development公司的HNL mab 697等）或通過常規方法（Current protocols in molecular biology.New York:John Wiley，2008 11.10.1-11.10.10)以人HNL免疫動物制備的抗體或基因工程方法制備的抗HNL抗體，所述抗體可為單克隆抗體或多克隆抗體。
[0020] (2)封閉酶標板
[0021] 棄包被液；向96孔酶標板每孔加200~300μΙ^閉液(封閉液為含2%BSA(wt/vol) 的25~100臟〇1/1恥 20)3-似!10)3，？!19.6的碳酸鈉緩沖液）；37°(：孵育211、室溫孵育411或4 1€ 過夜。
[0022] (3)固定酶標板
[0023]棄封閉液；向96孔酶標板每孔加200~300yL固定液（固定液為含50%蔗糖(wt/ vol)、50%海藻糖（wt/vol)或25%鹿糖（*1:/￥〇1)和25%海藻糖（￥1:/￥〇1)的5〇1]1111〇1/1^ Na2C03-NaHC03，pH 9 · 6的碳酸鈉緩沖液）；室溫固定30min~2h。
[0024] (4)密封酶標板
[0025]棄固定液，室溫晾干或25~30 °C真空干燥;將酶標板和袋裝干燥劑裝進錫箱袋然后抽真空，4 C保存。
[0026] b)5倍樣品稀釋液
[0027] 為含有2 · 5%BSA(wt/vol)、0 · 5%Tween-20(vol/vol)、0 · 5%十六烷基三甲基溴化銨(CTAB) (wt/vo 1)、2 % PEG-600 (聚乙二醇600) (vo 1 /vo 1)和0 · 1 % NaN3 (wt/vo 1)的磷酸根摩爾濃度為50mmol/L、pH 7.4的PBS緩沖液；
[0028] c)標準品濃度梯度凍干粉的制備
[0029 ] 標準品濃度梯度凍干粉為不同濃度HNL/MMP-9溶液制備的凍干粉，HNL/MMP-9以文獻方法從中性粒細胞分離純化獲得（J. Biol .Chem. 1993,268: 10425-10432; Scand · J · Cl in · Lab · Invest · 1994，54:365-376)。具體是將 10ng純化的HNL/MMP-9溶解在400 yL樣品稀釋液工作液中，充分混勻，HNL/MMP-9的濃度為25ng/mL;然后將上述溶液用樣品稀釋液工作液進行2倍法梯度稀釋獲得濃度分別為12.5ng/mL、6.25ng/mL、3 . 13ng/mL、 1 · 56ng/mL、0 · 78ng/mL、0 · 39ng/mL的HNL/MMP-9標準品溶液各200yL，將以上溶液通過常規方法進行凍干，獲得標準品濃度梯度凍干粉①-⑦一套。
[0030]樣品稀釋液工作液是將5倍樣品稀釋液用去離子水稀釋5倍獲得。
[0031] d)酶標抗體溶液的制備
[0032] 酶標抗體是指通過常規的方法(Abeam的abl02850、abl02890、abl02887等）將辣根氧化物酶(HRP)或堿性磷酸酶(ALP)等酶分子共價標記在抗HNL抗體或抗MMP-9抗體上。如果步驟a)抗體包被的酶標板中的抗體是抗MMP-9抗體，那么酶標抗體中的抗體就是抗HNL抗體;反過來如果步驟a)抗體包被的酶標板中的抗體是抗HNL抗體，那么酶標抗體中的抗體就是抗MMP-9抗體。
[0033]酶標抗體溶液為含有1 %BSA(wt/vol)、0 · 1 %NaN3(wt/vol)和0 · 5~lyg/mL酶標抗體的磷酸根摩爾濃度為50mmol/L、pH7.4的PBS緩沖液。
[0034] e) 25 倍洗液
[0035]為含有2·5%Tween-20(vol/vol)的磷酸根摩爾濃度為250mmol/L、pH 7·4的PBS緩沖液。
[0036] f)酶底物溶液和終止液
[0037]對應酶標抗體所標記的酶采用不同的酶底物溶液和終止液。該體系是已經公開成熟的常規方法，也有相應的商品化產品可供選擇，如表2。
[0038]表2:酶標抗體的酶底物溶液和終止液體系
[0039]
[0040] 3)使用方法 [00411使用步驟如下：
[0042] (1)取出上述制備的溶液、標準品濃度梯度凍干粉、抗體包被的96孔酶標板等，放置于室溫環境平衡；
[0043] (2)將5倍樣品稀釋液和25倍洗液用去離子水分別稀釋5倍和25倍，制成樣品稀釋液工作液和洗液工作液；
[0044] (3)將生物樣本(血清、血漿、尿液、唾液或腦脊液)用樣品稀釋液工作液(血清和血漿通常稀釋50倍，尿液通常稀釋25倍，唾液和腦脊液通常稀釋5倍)稀釋后制成樣品溶液； [0045] (4)向每管標準品濃度梯度凍干粉中加 200yL的樣品稀釋液工作液，充分混勻制成標準品濃度梯度溶液；
[0046] (5)將步驟(4)和步驟(3)制備的標準品溶液和樣品溶液各1 OOyL加至U型底96孔板；
[0047] (6)將50yL酶標抗體溶液加至抗體包被的96孔酶標板；
[0048] (7)用多道移液器取50yL步驟(5)制備的U型底96孔板中的標準品溶液和樣品溶液移至步驟(6)制備的96孔酶標板上；
[0049] (8)用封板膜蓋住96孔酶標板，將96孔酶標板放置于酶標板震蕩器上，150~ 180rpm、37°C 孵育 20 ~40min;
[0050] (9)傾倒96孔酶標板中的物質，用洗液工作液對96孔酶標板進行常規3~5次清洗；
[00511 (10)向96孔酶標板每孔中加入酶底物溶液100yL，避光條件下孵育10~20min;
[0052] (11)向96孔酶標板每孔中加入終止液100yL，輕輕混勻，30min內利用常規的分光光度計測定450nm處的吸光值；
[0053] (12)以標準品濃度梯度溶液的濃度值為橫縱標，以標準品濃度梯度溶液450nm處的吸光值為縱坐標作標準曲線，再根據標準曲線及樣品溶液450nm處的吸光值計算出樣品溶液中異源二聚體(HNL/MMP-9)的濃度。
[0054]由于采取了以上技術方案，使本發明具有以下顯著有益效果：
[0055] (1)本發明根據HNL異源二聚體是由HN L單體和MMP-9組成，因此HNL/MMP-9異源二聚體既有抗HNL抗體識別的表位也有抗MMP-9抗體識別的表位;而HNL單體和HNL同源二聚體只有抗HNL抗體識別的表位而沒有抗MMP-9抗體識別的表位，游離MMP-9只有抗MMP-9抗體識別的表位而沒有抗HNL抗體識別的表位。所以利用抗HNL抗體和抗MMP-9抗體組成的夾心 ELISA能特異性檢測出HNL/MMP-9，而不檢出游離的HNL或MMP-9,也不檢出HNL同源二聚體 (圖1)
[0056] (2)本發明利用酶對抗HNL抗體或抗MMP-9抗體直接標記得到酶標抗體，從而使本裝置只需孵育兩次、清洗一次就能完成整個實驗，因此本發明測試時間顯著縮短，只需常規夾心ELI SA測試時間的1 /5~1 /4。
[0057] (3)本發明可用于以HNL/MMP-9為標志物診斷疾病(如乳腺癌）的實驗室研究和潛在臨床應用研究。
【附圖說明】
[0058]圖1為本發明一種人中性粒細胞載脂蛋白（HNL/MMP-9)異源二聚體的定量裝置能特異性快速定量HNL/MMP-9的原理圖。其中24代表用于抗體包被的96孔酶標板的一個孔，26 代表用于包被96孔酶標板的抗HNL抗體、27代表用于包被96孔酶標板的抗MMP-9抗體，28代表HNL同源二聚體（由兩個相同的（30)組成）、29代表HNL/MMP-9異源二聚體（由（30)和(31) 組成）、30代表HNL單體、31代表MMP-9，32代表酶標抗MMP-9抗體、33代表酶標抗HNL抗體。圖1 左圖由26包被24，26能識別HNL上的表位從而能結合30、28及29，32能識別MMP-9上的表位從而特異性結合29，因此該體系能特異性檢測29(HNL/MMP-9); 32利用其上所標記的酶催化酶底物溶液產生有色產物，進而利用分光光度計獲取特定波長下產物的吸光度值。圖1右圖由 27包被24,27能識別MMP-9上的表位從而你們結合31和29,33能識別HNL上的表位從而特異性識別結合在27上的29，因此該體系能特異性檢測29 (HNL/MMP-9)，33利用其上所標記的酶催化酶底物溶液產生有色產物，進而利用分光光度計獲取特定波長下產物的吸光度值。 [0059]圖2為本發明一種基于酶聯免疫吸附技術的異源二聚體人中性粒細胞載脂蛋白 (HNL/MMP-9)快速定量裝置實施例5繪制的參考標準曲線。
【具體實施方式】
[0060]下面將用實施例進一步說明本發明。需要聲明的是：（1)本發明實施例是用于本發明的進一步解釋而不是對本發明的限定；（2)根據本發明專利構思所述的構造、特征及原理所做的簡單變化均包括在本專利的保護范圍內；（3)本領域技術人員對所描述的具體實施例做各種修改或補充或替代，只要不偏離本發明權利要求書所定義的范圍，均屬于本發明的保護范圍。
[0061]實施例1: 一種基于酶聯免疫吸附技術的人中性粒細胞載脂蛋白異源二聚體(HNL/ MMP-9)快速定量裝置的組成 [0062]表3:為實施例1裝置的組成
[0063]
[0064] 實施例2: -種基于酶聯免疫吸附技術的人中性粒細胞載脂蛋白異源二聚體(HNL/ MMP-9)快速定量裝置的組成
[0065] 本實施例裝置由以下部分組成(見表4)。
[0066] 表4:實施例2裝置的組成
[0067]
[0068] 實施例3: -種基于酶聯免疫吸附技術的人中性粒細胞載脂蛋白異源二聚體(HNL/ MMP-9)快速定量裝置的組成
[0069] 本實施例裝置由以下部分組成(見表5)。
[0070] 表5:實施例3裝置的組成
[0071]
[0072] 實施例4: 一種基于酶聯免疫吸附技術的人中性粒細胞載脂蛋白異源二聚體(HNL/ MMP-9)快速定量裝置的酶標板的制備
[0073] (1)抗體包被酶標板
[0074] 將抗麗?-9抗體以1^3111的3匕38898)用50111111〇1/1恥2〇)3-恥!1〇)3印119.6的碳酸鈉緩沖液稀釋到2以8/1111^制成抗體包被液；向96孔酶標板(燦11〇纟/^13〇印：8>；|^131：-13〇1:1:〇11196￥611 p lat e)每孔加100μ]^)?體包被液;4 °C過夜。
[0075] (2)封閉酶標板
[0076] 棄包被液；向96孔酶標板每孔加200μΙ^?閉液（封閉液為含2%BSA(wt/vol)的 50mmol/L Na2C〇3-NaHC〇3，pH 9.6的碳酸鈉緩沖液）；37°C孵育2h。
[0077] (3)固定酶標板
[0078] 棄封閉液；向96孔酶標板每孔加30(^1^固定液（固定液為25%的蔗糖(的八〇1)和 25%的海藻糖(wt/vol)的50mmol/L Na2C03-NaHC03，pH 9 · 6的碳酸鈉緩沖液;室溫固定lh。 [0079] (4)密封酶標板
[0080]棄固定液，25~30 °C真空干燥;將酶標板和袋裝干燥劑裝進錫箱袋然后抽真空，4 °c保存。
[0081]實施例5: -種基于酶聯免疫吸附技術的人中性粒細胞載脂蛋白異源二聚體(HNL/ MMP-9)快速定量裝置的具體使用步驟
[0082]現以實施例1裝置的使用為例說明本裝置的具體使用步驟。
[0083] (1)取出上述制備的溶液、標準品濃度梯度凍干粉、抗體包被的96孔酶標板等，放置于室溫環境平衡；
[0084] (2)將5倍樣品稀釋液和25倍洗液用去離子水分別稀釋5倍和25倍，制成樣品稀釋液工作液和洗液工作液；
[0085] (3)將血清用樣品稀釋液工作液稀釋50倍，得到樣品溶液；
[0086] (4)向每管標準品濃度梯度凍干粉中加200yL樣品稀釋液工作液，充分混勻制成標準品濃度梯度溶液；
[0087] (5)將步驟(4)和(3)制備的標準品濃度梯度溶液和樣品溶液各1 OOyL加至U型底96 孔板；
[0088] (6)將50yL HRP-抗HNL抗體加至抗MMP-9抗體包被的96孔酶標板；
[0089] (7)用多道移液器取50yL步驟(5)制備的U型底96孔板中的標準品濃度梯度溶液和樣品溶液加至步驟(6)中的96孔酶標板上；
[0090] (8)用封板膜蓋住96孔酶標板，將96孔酶標板放置于酶標板震蕩器上，180rpm，37 °C 孵育 20min;
[0091 ] (9)傾倒96孔酶標板中的物質，用洗液工作液對96孔酶標板進行3次清洗，最后一次清洗后將96孔酶標板倒扣在吸水濾紙上10s;
[0092] (10)在清洗結束前，將TMB底物溶液A和TMB底物溶液B分別通過顛倒試劑瓶混勻，取等體積溶液A和溶液B混勻制成TMB底物工作液；
[0093] (11)加入TMB底物100yL至96孔酶標板，蓋上封板膜和錫箱紙，孵育15min;
[0094] (12)加入100yL、2mol/L H2S〇4的終止液，輕輕混勻30S，30min內利用常規的分光光度計以540nm波長為參考、讀取450nm波長下的吸光值；
[0095] (13)以濃度為橫坐標、吸光值為縱坐標繪制標準曲線，根據標準曲線趨勢線公式計算樣品中HNL濃度。
[0096] 表6:不同濃度HNL/MMP-9標準品溶液對應的450nm波長處的吸光度值
[0097]
LUUVbj 根據表6繪制買施例5的稱準凹線（圖幻。田表6 P」以得出本裝置足重丼源二衆體的濃度可低至〇. 2ng/mL，結合圖2可以得出本裝置定量同源二聚體的線性范圍為0.2ng.mL~ 12·5ng/mL〇
[0099] 本實施例裝置的批內差異CV平均值為5.94% (范圍0.78%~9.03%，n = 12)，批間差異CV平均值為8.25% (范圍為1.22%~14.30%，n = 3)。
[0100] 通過向已知HNL/MMP-9濃度(Co)的尿液中加入已知濃度(&)的HNL/MMP-9、MMP-9、 HNL及同源二聚體HNL，利用本實施例獲得尿溶液中的HNL/MMP-9測定值濃度(C2);理論值濃度為C3。根據公式（1)回收率1(%)=C3 + C2X100%和公式(2)回收率2(%) = (C2-CQ)+C1X 100 %計算得到以上分子在尿樣中的回收率(表7)。
[0101 ] 表7: HNL/MMP-9、MMP-9、HNL及HNL同源二聚體在尿液中的回收率
[0104] 表7數據顯示本裝置能特異性定量尿液樣本中的HNL異源二聚體，而對游離的MMP-9、單體HNL及同源二聚體HNL則不檢出。由此可以得出本方法有很高的特異性和靈敏度。
[0102]
[0103]
【主權項】
1. 一種基于酶聯免疫吸附技術的人中性粒細胞載脂蛋白異源二聚體HNL/MMP-9定量裝置，其特征在于：由5倍樣品稀釋液、25倍洗液、HNL/MMP-9標準品濃度梯度凍干粉一套、抗 MMP-9抗體包被的96孔酶標板和酶標抗HNL抗體溶液或抗HNL抗體包被的96孔酶標板和酶標抗MMP-9抗體溶液、U型底96孔板、封板膜、酶底物溶液及終止液組成，所述HNL/MMP-9標準品為人源HNL/MMP-9;所述酶標抗體所標記的酶為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶;所述定量裝置經兩步法快速定量HNL/MMP-9,所述兩步法快速定量HNL/MMP-9是指裝置使用過程中孵育過程只需兩次，所述孵育過程只需兩次第一次是指將酶標抗HNL抗體溶液加入抗抗體包被的96孔酶標板或將酶標抗抗體溶液加入抗HNL抗體包被的96孔酶標板后快速加入標準品濃度梯度溶液和樣品溶液后孵育20~40min，所述兩次孵育過程第二次是指加入酶底物溶液孵育10~20min后加入終止液;所述標準品濃度梯度溶液是指HNL/MMP-9標準品濃度梯度凍干粉加入200yL樣品稀釋液工作液制成;所述樣品溶液是指經樣品稀釋液工作液稀釋后的體液樣本，所述體液樣本為尿液、血清、血漿、腦脊液或唾液;所述樣品稀釋液工作液是將5 倍樣品稀釋液用去離子水稀釋5倍獲得。2. 如權利要求1所述的一種基于酶聯免疫吸附技術的人中性粒細胞載脂蛋白異源二聚體HNL/MMP-9定量裝置，其特征在于:抗MMP-9抗體為商品化的抗MMP-9抗體或通過常規方法以MMP-9免疫動物制備的抗體或基因工程方法制備的抗抗體，所述抗體可為單克隆抗體或多克隆抗體;抗HNL抗體為商品化的抗HNL抗體或通過常規方法以人HNL免疫動物制備的抗體或基因工程方法制備的抗HNL抗體，所述抗體可為單克隆抗體或多克隆抗體。3. 如權利要求1所述的一種基于酶聯免疫吸附技術的人中性粒細胞載脂蛋白異源二聚體HNL/MMP-9定量裝置，其特征在于:抗體包被的96孔酶標板是由如下步驟制備得到， (1) 抗體包被酶標板將抗MMP-9抗體或抗HNL抗體用25~100mmol/L Na2C03-NaHC03、pH 9.6的碳酸鈉緩沖液稀釋到2~6yg/mL制成抗體包被液；向96孔酶標板每孔加100yL抗體包被液;37°C孵育2h、室溫孵育4h或4°C過夜； (2) 封閉酶標板棄包被液；向96孔酶標板每孔加200~300yL封閉液，封閉液為含2%BSA(wt/vol)的25 ~100mmol/L Na2C03-NaHC03，pH 9.6的碳酸鈉緩沖液;37°C孵育2h、室溫孵育4h或4°C過夜； (3) 固定酶標板棄封閉液；向96孔酶標板每孔加200~300yL固定液，固定液為含50%蔗糖(的八〇1)、 50%海藻糖(wt/vol)或25%鹿糖(wt/vol)和25%海藻糖(wt/vol)的50mmol/LNa2⑶3-NaHC0 3，pH 9.6的碳酸鈉緩沖液;室溫固定30min~2h; (4) 密封酶標板棄固定液，室溫晾干或25 °C真空干燥;將酶標板和袋裝干燥劑裝進錫箱袋然后抽真空， 4°C保存。4. 如權利要求1所述的一種基于酶聯免疫吸附技術的人中性粒細胞載脂蛋白異源二聚體HNL/MMP-9定量裝置，其特征在于：5倍樣品稀釋液為含有2.5 %BSA(wt/vol)、0.5 % Tween-20 (vo 1/vo 1)、0 · 5 % 十六烷基三甲基溴化銨(CTAB) (wt/vo 1)、2 % PEG-600 (聚乙二醇 600)(vol/vol)和0.1 %NaN3(wt/vol)的磷酸根摩爾濃度為50mmol/L、pH 7.4的PBS緩沖液。5. 如權利要求1所述的一種基于酶聯免疫吸附技術的人中性粒細胞載脂蛋白異源二聚體HNL/MMP-9定量裝置，其特征在于:25倍洗液為含有2.5 % Tween-20( vol/vol)的磷酸根摩爾濃度為250mmol/L、pH 7.4的PBS緩沖液。6. 如權利要求1所述的一種基于酶聯免疫吸附技術的人中性粒細胞載脂蛋白異源二聚體HNL/麗P-9定量裝置，其特征在于:標準品濃度梯度凍干粉為不同濃度HNL/MMP-9溶液制備的凍干粉，具體是將l〇ng純化的HNL/MMP-9溶解在400yL樣品稀釋液工作液中，充分混勻，此溶液HNL/MMP-9的濃度為25ng/mL;然后將上述溶液用樣品稀釋液工作液進行2倍法梯度稀釋獲得濃度分別為12 · 5ng/mL、6 · 25ng/mL、3 · 13ng/mL、1 · 56ng/mL、0 · 78ng/mL、0 · 39ng/mL 的HNL/MMP-9標準品溶液各200yL，將以上溶液通過常規方法進行凍干，獲得標準品濃度梯度凍干粉一套。7. 如權利要求1所述的一種基于酶聯免疫吸附技術的人中性粒細胞載脂蛋白異源二聚體HNL/MMP-9定量裝置，其特征在于:酶標抗體的制備是指通過常規的方法將辣根氧化物酶HRP或堿性磷酸酶(ALP)共價標記在抗HNL抗體或抗抗體上;酶標抗體溶液為含有1 %BSA (wt/vol)、0.1 %NaN3(wt/vol)和0.5~lyg/mL酶標抗體的磷酸根摩爾濃度為50mmol/L、 pH7.4的PBS緩沖液。8. 如權利要求1所述的一種基于酶聯免疫吸附技術的人中性粒細胞載脂蛋白異源二聚體HNL/MMP-9定量裝置，其特征在于:其使用步驟如下， (1) 取出溶液、標準品濃度梯度凍干粉、抗體包被的96孔酶標板，放置于室溫環境平衡； (2) 將5倍樣品稀釋液和25倍洗液用去離子水分別稀釋5倍和25倍，制成樣品稀釋液工作液和洗液工作液； (3) 將生物樣品用樣品稀釋液工作液制成樣品溶液； (4) 向每管標準品濃度梯度凍干粉中加200yL的樣品稀釋液工作液，充分混勻制成標準品溶液； (5) 將步驟(4)和步驟(3)制備的標準品溶液和樣品溶液各1 OOyL加至U型底96孔板； (6) 將50yL酶標抗體加至抗體包被的96孔酶標板； (7) 用多道移液器取50yL步驟(5)制備的U型底96孔板中的標準品溶液和樣品溶液移至步驟(6)中的96孔酶標板上； (8) 用封板膜蓋住96孔酶標板，將96孔酶標板放置于酶標板震蕩器上，150~180rpm、37 °C 孵育 20 ~40min; (9) 傾倒96孔酶標板中的物質，用洗液工作液對酶標板進行常規3~5次清洗； (10) 向96孔酶標板每孔中加入酶底物溶液100yL，避光條件下孵育10~20min; (11) 向96孔酶標板每孔中加入終止液100yL，輕輕混勻，30min內利用常規的分光光度計測定450nm處的吸光值； (12) 以標準品濃度梯度溶液的濃度值為橫縱標，以標準品濃度梯度溶液450nm處的吸光值為縱坐標作標準曲線，再根據標準曲線及樣品溶液450nm處的吸光值計算出樣品溶液中異源二聚體HNL/MMP-9的濃度。
【文檔編號】G01N33/68GK105974127SQ201610404140
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年6月12日
【發明人】蔡林君, 楊津, 姜春來, 孔維
【申請人】吉林大學

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