一種心腦血管疾病特異性檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種心腦血管疾病特異性檢測試劑盒，所述的試劑盒中的適配子能夠高效的特異性的結合ApoBl00。該適體的獲得是應用新的組合化學技術SELEX，以ApoBl00為靶目標，從隨機文庫中篩選出了能與ApoBl00特異性結合的適配子。通過適配子特異性的結合ApoBl00，從而定量血清中ApoBl00的含量，從而能夠快速高效的初步篩選心腦血管疾病。該試劑盒制備簡單，成本低廉，適宜于大面積的推廣使用，具有極高的應用前景。
【專利說明】
一種心腦血管疾病特異性檢測試劑盒
技術領域
[0001 ]本發明涉及生物技術領域，特別涉及一種心腦血管疾病特異性檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002]心腦血管疾病是一種嚴重威脅人類，特別是50歲以上中老年人健康的常見病，全 世界每年死于心腦血管疾病的人數高達1500萬人，居各種死因首位。心腦血管疾病具有"發 病率高、致殘率高、死亡率高、復發率高，并發癥多" 8卩"四高一多"的特點，目前，我國心腦血 管疾病患者已經超過2.7億人!每年死于心腦血管疾病近300萬人，占我國每年總死亡病因 的51 %。而幸存下來的患者75%不同程度喪失勞動能力，心腦血管疾病已成為人類死亡的 重要殺手！
[0003]載脂蛋白B(Apolipoprotein Β,Αρο B)是血楽脂蛋白中蛋白質的一種，根據氨基 酸組成和分布分為Β 100、Β 48、Β 74、Β 26和Β 50五種亞型。載脂蛋白Β100(Αρο Β100)是低 密度脂蛋白（Low density lipoprotein, LDL)、中密度脂蛋白（Intermediated densitylipoprotein，IDL)和極低密度脂蛋白（Very low density lipoprotein,VLDL)顆 粒上主要的載脂蛋白，由肝臟合成，含有4563個氨基酸殘基，分子量約為510KDa。
[0004] ΑροΒ作為動脈硬化、冠心病等的危險因子，其與動脈粥樣硬化型心血管疾病之間 有著密切關系，其功能之一是攜帶膽固醇，因此ΑροΒ在血液中的含量可作為膽固醇等脂類 的指標。患有急性心肌梗死、心腦疾病患者、動脈硬化癥、高脂血癥、糖尿病、慢性腎功能不 全等疾病ΑροΒ含量出現增高。
[0005] Apo Biqq與載脂蛋白Al(Apolipoprotein Α1)的比值(Αρο Β/Α1)在臨床上是心腦 血管疾病檢測的重要指標，與心肌梗塞、缺血性中風有緊密的聯系，是微蛋白尿、糖尿病和 新陳代謝綜合癥的獨立風險因子。所以Αρο Β.水平的檢測對疾病的早期預測有一定的意 義。
[0006] 目前在臨床實驗室檢測Αρο Β100的方法主要是放射免疫分析(RIA)、免疫比濁法 和酶聯免疫吸附分析(ELISA)，其中RIA必須用放射性元素標記，檢測設備復雜昂貴，其放射 性元素的半衰期短，不能長期保存，檢測結果不穩定，同時存在放射性污染也給實驗操作人 員帶來了傷害;酶免疫分析法靈敏度低，影響因素較多，易造成假陰性和假陽性。
[0007] SELEX技術是20世紀90年代初發展起來的一種新的組合化學技術。利用該技術可 以從隨機單鏈寡核苷酸庫中篩選到特異性與靶物質高度親和的核酸適配體。其基本思路是 體外化學合成一個單鏈寡核苷酸庫，與靶物質混合，形成靶物質-核酸復合物，洗脫未結合 的核酸，分離與靶物質結合的核酸分子，并以此核酸分子為模板進行PCR擴增，再進入下輪 的篩選。通過重復的篩選與擴增，一些與靶物質不結合或與靶物質有低親和力、中親和力的 核酸分子被洗去，而與革G物質有強未和力的核酸分子從非常大的隨機庫中分尚出來，且純 度隨SELEX過程的進行而增高，最后占據庫的大多數（>90%左右）。自Tuerk和Ellington等 首先運用此技術篩選到特異性吸附噬菌體T4DNA聚合酶和有機染料分子的特異核酸適配體 后，經過十幾年的發展，SELEX技術已經成為一種重要的研宄手段和工具。因此，采用selex 技術，篩選特定的結合Apo B100的適配體具有較為重要的意義。
【發明內容】
[0008] 本發明的技術方案通過以下步驟實現：
[0009] 本發明的目的是提供一種Apo B100的核酸適配體序列。
[00?0]本發明中，所述的Apo B100的核酸適配體(序列1-21)能夠特異結合Apo B100。
[0011] 本發明的進一步的目的是提供所述核酸適配體序列的用途。本發明中根據對該序 列應用，可進一步用于制備特異性結合Apo B100的試劑盒。
[0012] 從體外合成的隨機寡聚DNA文庫，（5 '-TTGGACATGAACCAACGTTA-N35-CGACCATGACAACGGCTGAA-3 '），其中N35為35個隨機寡核苷酸;從中篩選出與APO B100特異結 合的核酸適配體；將篩選出的序列用引物P 1 : TTGGACATGAACCAACGTTA ;引物P2 : TTCAGCCGTTGTCATGGTCG，進行擴增并進行TA克隆入pMD19-T載體(購自上海博光生物公司）， 轉化DH5a細菌(購自北京天根生物公司）；挑去白色菌落進行PCR確定陽性克隆后，抽提質粒 并測序反應，上測序儀測序。
[0013] 本發明采用核酸適配體的體外篩選（SELEX)技術，以APO B100為正篩靶標篩選與 APO B100特異結合的核酸適配體，制得具有特異結合APO B100的序列，本發明中命名為適 配體APO B100-1~21。序列如下：
[0014] ApoB100-l：
[0015] TTGGACATGAACCAACGTTAACTACTTACTAACCCCCTCTTAAATTTATCACACTCGACCATGACAACG GCTGAA
[0016] ApoB100-2：
[0017] TTGGACATGAACCAACGTTAAAAAACCCAACACCTCCTCTCCCTCCTAAATACAACGACCATGACAACG GCTGAA
[0018] ApoB100-3：
[0019] TTGGACATGAACCAACGTTATCTTACATAAATAACAAATCCTCCCACACACCCACCGACCATGACAACG GCTGAA
[0020] ApoB100-4：
[0021] TTGGACATGAACCAACGTTACTACTACCCTCTCCTTTACTCCTCATAAATCCAATCGACCATGACAACG GCTGAA
[0022] ApoB100-5：
[0023] TTGGACATGAACCAACGTTATCCCTACTCAATTAATACTAATACCATAATACTTCCGACCATGACAACG GCTGAA
[0024] ApoB100-6：
[0025] TTGGACATGAACCAACGTTATTCTTCCAACCTTACCTTCCAAACATCCCCCTATACGACCATGACAACG GCTGAA
[0026] ApoB100-7：
[0027] TTGGACATGAACCAACGTTAACACTAAACATCTTACACTCTCTTTTAACCTCATCCGACCATGACAACG GCTGAA
[0028] ApoB100-8：
[0029] TTGGACATGAACCAACGTTATACCTCTTAAACAATCCTATATACTACCTCTACAACGACCATGACAACG GCTGAA
[0030] ApoB100-9：
[0031] TTGGACATGAACCAACGTTATACTAATACATTTTACTCCAATATTCATAATACCACGACCATGACAACG GCTGAA
[0032] ApoB100-10：
[0033] TTGGACATGAACCAACGTTATAAAATATTTCAATCTCTCTCTATATCATTCCTCCCGACCATGACAACG GCTGAA
[0034] ApoB100-ll：
[0035] TTGGACATGAACCAACGTTATTTATTACCCTTCAATCACAACACCATTATACTATCGACCATGACAACG GCTGAA
[0036] ApoB100-12：
[0037] TTGGACATGAACCAACGTTAATCTTTCCCAACCTCAATTCCATCCATTCTTAATCCGACCATGACAACG GCTGAA
[0038] ApoB100-13：
[0039] TTGGACATGAACCAACGTTAATCACTACCATTAACTCTAACACTTTCCCCCCCTCCGACCATGACAACG GCTGAA
[0040] ApoB100-14：
[0041] TTGGACATGAACCAACGTTAATACTTTAATTTAACTCCACTACTCACTCAATCTTCGACCATGACAACG GCTGAA
[0042] ApoB100-15：
[0043] TTGGACATGAACCAACGTTATCCCCCCTCCACACCTCTCCCCTTACATTTTATCCCGACCATGACAACG GCTGAA
[0044] ApoB100-16：
[0045] TTGGACATGAACCAACGTTAAATCTCATACCATTATCAATCCCATACCATCCATACGACCATGACAACG GCTGAA
[0046] ApoB100-17：
[0047] TTGGACATGAACCAACGTTACTTATCCCAATTTTCTCTTCAACATAAACAATCATCGACCATGACAACG GCTGAA
[0048] ApoB100-18：
[0049] TTGGACATGAACCAACGTTATTCTATTATATCCACTAATCAAACCCATAAACTATCGACCATGACAACG GCTGAA
[0050] ApoB100-19：
[0051] TTGGACATGAACCAACGTTATCTTCTATCATTTAACCTTTCCTCCCAACACACCACGACCATGACAACG GCTGAA
[0052] ApoB100-20：
[0053] TTGGACATGAACCAACGTTATCATCTACTCTTCTCTCCAACTTCTACATAAAAACCGACCATGACAACG GCTGAA
[0054] ApoB100-21：
[0055] TTGGACATGAACCAACGTTAAATTCACCTAAACTTTCTTCCTCCATACCTATACCCGACCATGACAACG GCTGAA
[0056] 本發明的適配子可以用于構建試劑盒，該試劑盒可以用于特異性的分離和定量檢 測APO B100,具有分離效果快，效率高，節省時間，節約成本的功效。具有極強的應用價值。 [0057]本發明的有益效果：（1)獲得了一種能夠特異高效結合APO B100的適配子。該適配 子可以大量人工制備，方法簡單，成本低廉。（2)以核酸適配子為基礎可以制備成為特異性 檢測APO B100的試劑盒。
【具體實施方式】
[0058] 實施例1:核酸適配體篩選
[0059] 從體外合成的隨機寡聚DNA文庫，5 ' -TTGGACATGAACCAACGTTA-NSS-CGACCATGACAACGGCTGAA』 ， 。
[0060] 所用引物：
[0061 ] F:5，-TTGGACATGAACCAACGTTA-3
[0062] R:5，-TTCAGCCGTTGTCATGGTCG-3
[0063] (1)AP0 B100蛋白溶于200μ1 PBS后加入96孔ELISA板中，4°C過夜。
[0064] (2)蛋白包被孔用PBS洗滌6次后，加入200μ1 3%BSA(購自上海生工），孵育2小時。 同時，空白96孔ELISA板中加入200μ1 3%BSA 37°C孵育2小時。
[0065] (3)將隨機 ssDNA 文庫（首輪用量為 800pmol)溶于 200μ1 1*SHCMK，95°C 變性 5min。 立即置于冰上lOmin，使其迅速降至室溫，避免ssDNA復性成雙鏈。
[0066] (4)將ssDNA加入PBS洗滌6次的空白ELISA孔中，37°C孵育2小時。
[0067] (5)上清轉入PBS洗滌6次的蛋白包被孔中，37 °C孵育2小時后PBS洗滌6次。
[0068] (6)結合了 ssDNA的酶標孔用200i 11洗脫緩沖液重懸，95 °C加熱5min，取上清，經過 乙醇沉淀DNA，溶于Mi 11 ipore水中，作為下一輪篩選的模板。
[0069] (8)取5μ1 PCR產物上樣于5wt%瓊脂糖(購自上海生工），觀察條帶位置是否正確。 從首輪之后，投入的ssDNA次級庫的量逐漸減少，如此反復進行14個循環。
[0070] 第14輪篩選產物的擴增和純化:將第14輪篩選得到的ssDNA序列，用引物P1，引物 P2進行擴增。100μΙ PCR擴增后體系加入500pl結合液BB(20mmol/L Hepes(pH7.35)， 120mmol/LNaCl，5mmol/LKCl，lmmol/LCaC12，lmmol/LMgC12，1 %BSA)，充分混勻。將上一步 所得溶液加入吸附柱EC中（吸附柱放入收集管中），室溫放置lmin，12000rpm離心30~60s， 倒掉收集管中的廢液。加入700pmol漂洗WB(結合液88+0.05%了《661120)，12000印111離心308， 棄掉廢液。加入500pmol漂洗液WB，12000rpm離心30s，棄掉廢液。將吸附柱EC放回空收集管 中，12000rpm離心2min。取出吸附柱EC，放入一個干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加 20pmol 65°C水浴預熱的洗脫緩沖液EB，室溫放置2min，12，OOOrpm離心lmin。將得到的溶液 重新加入吸附柱中，再次離心lmin。
[0071] PCR純化產物的克隆:取ΙμL擴增產物，與載體PGM-T在T4DNA連接酶的作用下連接， 再將其轉化到感受態細胞，取適當體積均勻涂布于含有IPTG、x-gal、抗生素(Amp)(它們分 別購自于上海生工）的LA平板，倒置培養皿，于37°C培養12-16小時進行〃藍-白斑篩選〃。測 序：用接種環挑取篩選平板上的單個白色菌落于含Amp的LB液體培養基，37°C培養過夜。取 菌液lml于離心管中，封膜后送上海生工測序。
[0072]測序結果發現其中有21個核酸適配體序列與APO B100具有非常強的親和性，該21 個序列分別是:SEQ ID NO :1-21所示。
[0073]實施例2特異性高親和力的APO B100結合適配子的性能測定 [0074] 將RNA適配子分別取1.5yg，用牛小腸堿性磷酸酶(CIP) 37 °C消化lh，純化回收去磷 酸化的RNA;通過T4多核苷酸激酶標記[γ -32P]ATP于去磷酸化的RNA分子末端。lOnmol放射 性標記的RNA適配子分別與不同濃度（1-200ηΜ)的APO B100蛋白37°C孵育30min，各組反應 液經硝酸纖維素膜濾過，洗滌濾膜，干燥濾膜，液閃計數儀測定濾膜上殘留的放射量，同一 樣品平行做兩次測定。計算各個適配子與APO B100蛋白的解離常數。結果如下：
[0075]
[0076]
[0077] 實施例3所述適配子特異性分析以及穩定性分析
[0078] 從以上結果可以看出，本發明的21個適配子具有非常強的結合特性，現有技術中 也沒有所述結合特性的適配子能夠結合APO B100蛋白。
[0079]實施例4降解活性分析
[0080] 分別采用人血白蛋白，APO B48、AP0 B74、AP0 B26和APO B50與21條適配子進行特 異性檢測，經過結合試驗發現，這些適配子都不與這些蛋白相結合，而只與APO B100蛋白結 合保持較高的特異性。
[0081] 將所述的適配子，取〇.2ug，分別置于常溫的血清、水溶液中，放置二周。通過RT-PCR檢測，發現二周的放置其結構穩定，沒有被降解。
[0082]實施例5臨床試驗分析
[0083]取105組臨床血清樣本，患有心腦疾病的患者100例作為實驗樣本，5例為正常人。 [0084] 將21個適配子分別與標準品APO B100蛋白通過免疫磁珠分離的方式構建標準品 檢測的標準曲線。然后將105組臨床血清樣本分別去10μ1加入到無菌離心管中，加入PBS溶 液震蕩溶解。分別將偶聯有磁珠的21組適配子與105組的血清溶液混合孵育20分鐘(一種適 配子對應檢測5組血清樣本），而后磁分離，即可獲得相應的分離的APO Β100蛋白，通過標準 曲線濃度檢測發現，其檢測的濃度與實際相符，比采用"雙抗夾心法"檢測試劑盒檢測的濃 度還要精確，由此可見，可以實現100%的定量檢測效果。具有極高的準確性。其中，100組心 腦疾病患者的APO Β100蛋白濃度明顯高于對照的5組50%-200%，具有極大的差異顯著性， 說明可以用于檢測分析。
[0085]上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的 限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 一種心腦血管疾病特異性檢測試劑盒，其特征:其包含核酸適體。2. 如權利要求1所示的試劑盒，其特征在于:所述核酸適體序列如SEQ ID NO: 1-21任一 項所示。3. -種檢測心腦血管疾病的方法，其特征在于：使用權利要求1-2任一項所示的試劑 盒。
【文檔編號】C12N15/115GK105974125SQ201610340463
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年5月22日
【發明人】杜護俠
【申請人】杜護俠