與糖尿病前期、糖尿病及糖尿病相關病癥相關的生物標記的制作方法

與糖尿病前期、糖尿病及糖尿病相關病癥相關的生物標記的制作方法
【專利摘要】本申請涉及與糖尿病前期、糖尿病及糖尿病相關病癥相關的生物標記。本發明提供了用于糖尿病前期、糖尿病和/或糖尿病相關病癥的生物標記，以及它們的使用方法，這些生物標記包括在表1和表2中的生物標記，如過氧化物還原酶2、補體C1q子成分亞基B、巰基氧化酶1和載脂蛋白A?IV。
【專利說明】與糖尿病前期、糖尿病及糖尿病相關病癥相關的生物標記
[00011 本申請是申請日為2011年09月20日，申請號為201180053583.9，發明名稱為"與糖 尿病前期、糖尿病以及糖尿病相關病癥相關的生物標記"的申請的分案申請。 發明領域
[0002] 本發明涉及與糖尿病前期、糖尿病以及糖尿病相關病癥(如糖尿病腎病)相關的生 物標記，使用生物標記來確定個體將產生糖尿病前期、糖尿病以及糖尿病相關病癥的風險 的方法，篩選一個群體來鑒定產生糖尿病前期、糖尿病以及糖尿病相關病癥風險的人的方 法，以及用于糖尿病前期、糖尿病以及糖尿病的藥物靶標。
[0003] 發明背景
[0004] 糖尿病是一種慢性疾病并且是我們這個時代的重大公共健康問題之一。在全世界 范圍內，患有糖尿病的患者群體不斷增加，這對衛生系統施加了很大的財政負擔。估計2000 年全世界范圍內所有年齡組的糖尿病患病率為2.8%，到2030年為4.4%。預測患有糖尿病 的總人數從2000年的1.71億上升到2030年的3.66億。2002年，糖尿病的發病率在25歲和25 歲以上的澳大利亞人群中為7.4%，并且自從1981年以來患有糖尿病的澳大利亞人的數量 增至三倍。
[0005] 至I」目前為止，2型糖尿病是最普遍的，例如，影響了美國糖尿病群體的90%至95%。 糖尿病發病率隨著年齡而增加，并且患有糖尿病的老人的數量預期隨著老年人口數量的增 加而增長。隨著糖尿病比率的上升，糖代謝受損的患病率也升高，這與患心臟病和糖尿病的 風險增加相關。肥糖病是一個涵蓋糖尿病、肥胖癥、糖代謝受損和高血壓相關風險因素以及 異常血漿脂質譜(血脂異常）的患病率的術語。即使肥胖程度保持不變，"糖尿病流行"將繼 續。鑒于增長的肥胖患病率，很有可能的是這些數據低估了未來的糖尿病患病率。
[0006] 糖尿病是一種機體不能維持正常血糖水平的病癥。大多數糖尿病案例分成三大 類:1型、2型和妊娠糖尿病。1型糖尿病是由機體不能產生胰島素引起的，并且目前需要患者 注射胰島素。2型糖尿病是由胰島素抵抗引起的，在這種情況下細胞不能適當利用胰島素， 有時合并有絕對胰島素缺乏。
[0007] 2型糖尿病通常可以通過規律的運動和飲食在初期控制。隨著疾病的進展可能需 要藥片以及最終的胰島素注射。隨著時間的推移，高血糖水平可能會損害血管和神經。這些 糖尿病的并發癥可能引起對眼、神經和腎臟的損傷，并且增加心臟病發作、中風、陽痿以及 足部問題的風險。如果長時間沒有發現患有糖尿病，這種損傷可能在個體知道其患有糖尿 病之前發生。因此，在非常早的階段診斷和控制糖尿病以及它的并發癥是重要的。
[0008] 糖尿病還是發達國家中的腎臟疾病（腎病）的最大病因，并且是造成巨額透析費用 的原因。10%到20%患有糖尿病的人將死于腎衰竭。糖尿病中的腎病并發癥背后的原因是 復雜的，并且包括高血糖水平的毒性作用；血壓升高；異常血脂水平以及小血管畸形。積累 的結果是腎臟中腎小球的增厚，這允許蛋白質（白蛋白）被排泄到尿中。
[0009] 糖尿病已經成為40%到50%的ESRD病例中的終末期腎功能衰竭(ESRF)的最常見 的單一原因，并且與所有其他原發性ESRD診斷相比，由糖尿病引起的患有ESRF的患者所占 的年度澳大利亞醫療保險開支最大。高達三分之一的新診斷患有2型糖尿病的成年人已經 患有慢性腎臟疾病，并且數據表明，這些患者中的很多可能已經發展到糖尿病前期狀態的 的過程中。這種疾病是進行性的并且對男性的影響多于女性。
[0010]最初通過測量排泄到尿中的白蛋白（蛋白尿)含量來檢測糖尿病腎病。通常使用白 蛋白肌酸比(ACR)來量度尿蛋白。這是在尿中的白蛋白與肌酸之間的比率。該比率考慮了相 對于腎小球濾過率的白蛋白濃度，該濃度通過尿中的肌酸的量確定。白蛋白尿被定義為： ACR>2 · 5mg/mmol (男性)或>3 · 5mg/mmol (女性）。
[0011] 盡管已經使用了很多研究和算法來評定糖尿病和相關病癥的風險，對于可以容易 地被最可能在初期遇到糖尿病前期或未診斷的早期糖尿病的初級保健醫生采用的評定這 樣的風險或病癥的準確方法仍然存在著需要。
[0012] 因此，對于用于篩選產生糖尿病前期、糖尿病和/或糖尿病相關病癥的風險的人以 及用于監測患有糖尿病前期、糖尿病和/或糖尿病相關病癥的患者的相對低廉并且方便的 方法仍然存在著需要。這樣的方法可以用于篩選大的群體以便鑒定處于糖尿病風險的人、 用于測試單個的人以便確定這個個體產生糖尿病的風險、用于監測糖尿病患者的健康并且 評定被設計為用來治療糖尿病、糖尿病前期和/或相關病癥的干預措施的功效。對于鑒定用 于糖尿病前期、糖尿病和/或糖尿病相關病癥的新藥物靶標(包括蛋白質藥物靶標）同樣存 在著需要。新藥物靶標的鑒定將使用于糖尿病前期、糖尿病和/或糖尿病相關病癥的新的干 預措施的開發成為可能。
[0013] 針對這種背景和與之相關的問題和困難而開發了本發明。
[0014] 發明概述
[0015] 在一個方面，本發明提供了 一種針對糖尿病前期、糖尿病和/或糖尿病相關病癥評 定受試者的方法，該方法包括測量來自受試者的樣品中的至少一種生物標記，其中所述至 少一種生物標記選自表1或表2中的生物標記列表。
[0016] 表1
[0017]
[0018]
[0019]
[0020]
[0021]
[0022]在一些實施方案中，該至少一種生物標記可以是表1或表2中的生物標記的至少二 個、三個或四個。
[0023]在另一方面，本發明提供了一種針對糖尿病前期、糖尿病和/或糖尿病相關病癥評 定受試者的方法，該方法包括測量來自受試者的樣品中的至少一種生物標記，其中所述至 少一種生物標記是過氧化物還原酶2、補體Clq子成分亞基B、巰基氧化酶1或載脂蛋白A-IV。 [0024]在另一方面，本發明提供了一種針對糖尿病前期、糖尿病和/或糖尿病相關病癥評 定受試者的方法，該方法包括測量來自受試者的樣品中的至少一種生物標記，其中所述至 少一種生物標記是過氧化物還原酶2、蛋白AMBP和補體Clq子成分中的一種或多種。
[0025] 在另一方面，本發明提供了一種針對糖尿病前期、糖尿病和/或糖尿病相關病癥評 定受試者的方法，該方法包括測量來自受試者的樣品中的至少一種生物標記，其中所述至 少一種生物標記是補體Clq子成分亞基B、蛋白AMBP、脂聯素和補體因子Η相關蛋白2中的一 種或多種。
[0026] 在另一方面，本發明提供了一種針對糖尿病前期、糖尿病和/或糖尿病相關病癥評 定受試者的方法，該方法包括測量來自受試者的樣品中的至少一種生物標記，其中所述至 少一種生物標記是過氧化物還原酶2、蛋白ΑΜΒΡ和補體Clq子成分亞基Β。
[0027] 在一些實施方案中，測量來自受試者的樣品中的至少一種生物標記的步驟可包括 質譜法的使用。
[0028] 在一些實施方案中，該質譜法可包括測量該至少一種生物標記的一個肽。
[0029] 在一些實施方案中，該肽可選自以下列表：
[0030] (i)來自表1或表2的蛋白質的一個10-15個氨基酸的肽；
[0031] (i i)來自表1或表2的蛋白質的一個5-25個氨基酸的肽；
[0032] (iii)來自表1或表2的蛋白質的一個5-20個氨基酸的肽；
[0033] (iv)來自表1或表2的蛋白質的一個10-20個氨基酸的肽;或 [0034] (v)在表3中的一個肽。
[0035] 在一些實施方案中，該質譜法可包括多反應監測(MRM)質譜法。
[0036] 在一些實施方案中，受試者可以沒有糖尿病前期、糖尿病和/或糖尿病相關病癥的 癥狀或可以僅僅顯示出其非特異性指標。
[0037] 在一些實施方案中，受試者可以已經被診斷患有糖尿病前期、糖尿病和/或糖尿病 相關病癥。
[0038] 在一些實施方案中，受試者可患有腎臟疾病。
[0039] 在一些實施方案中，受試者可患有微量白蛋白尿、大量白蛋白尿或終末期腎臟疾 病。
[0040] 在一些實施方案中，該樣品可包括血液樣品。
[0041] 在另一方面，本發明提供了一種試劑盒，該試劑盒包含用于測量來自受試者的樣 品中的至少一種生物標記的試劑，其中所述至少一種生物標記選自表1或表2中的生物標記 列表。
[0042] 在一些實施方案中，這些試劑中的至少一種可包括可檢測標記。
[0043] 在一些實施方案中，該試劑盒可進一步包括用于根據該至少一種生物標記的測量 評估個體產生腎臟疾病的風險的工具。
[0044] 在另一方面，本發明提供了用于針對糖尿病前期、糖尿病和/或糖尿病相關病癥評 定受試者的具有計算機可執行指令的計算機可讀介質，該計算機可讀介質包括:一個例行 程序，存儲在該計算機可讀介質上并且被適配成由一個處理器執行，以便存儲代表選自表1 或表2中的生物標記列表的至少一種生物標記的生物標記測量數據。
[0045] 在另一方面，本發明提供了一種評定用于受試者中的糖尿病前期、糖尿病和/或糖 尿病相關病癥的治療的方法，該方法包括測量來自經歷治療的受試者的樣品中的至少一種 生物標記，該至少一種生物標記選自表1或表2中的生物標記列表，在治療過程中至少測量 兩次。
[0046] 在一些實施方案中，生物標記可以是在至少兩個時間點測量的并且將來自這兩個 時間點的數據隨著時間的推移進行比較。
[0047] 在另一方面，本發明提供了一種評定受試者產生糖尿病前期、糖尿病和/或糖尿病 相關病癥的方法，該方法包括測量來自受試者的樣品中的至少一種生物標記，該至少一種 生物標記選自表1或表2中的生物標記列表。
[0048] 在另一方面，本發明提供了一種監測受試者中的糖尿病前期、糖尿病和/或糖尿病 相關病癥的方法，該方法包括測量來自受試者的樣品中的至少一種生物標記，該至少一種 生物標記選自表1或表2中的生物標記列表，并且將獲得的測量與至少一種生物標記的另一 次測量進行比較。
[0049] 在另一方面，本發明提供了一種診斷或鑒定受試者中的糖尿病前期、糖尿病和/或 糖尿病相關病癥的方法，該方法包括測量來自受試者的樣品中的至少一種生物標記，該至 少一種生物標記選自表1或表2中的生物標記列表。
[0050] 在另一方面，本發明提供了一種從同樣引起受試者中的蛋白尿的其他病癥鑒別診 斷腎臟疾病的方法，該方法包括測量來自受試者的樣品中的至少一種生物標記，該至少一 種生物標記選自表1或表2中的生物標記列表。
[0051]在另一方面，本發明提供了一種鑒別診斷受試者的糖尿病前期、糖尿病和/或糖尿 病相關病癥的亞類或階段的方法，該方法包括測量來自受試者的樣品中的至少一種生物標 記，該至少一種生物標記選自表1或表2中的生物標記列表。
[0052]在另一方面，本發明提供了一種測試系統，該測試系統包括：
[0053] (i)用于獲得來自受試者的樣品中的測試結果數據的裝置，這些測試結果數據代 表選自表1或表2中的生物標記列表的至少一種生物標記的水平；
[0054] (ii)用于收集和跟蹤在步驟(i)中產生的測試結果數據的裝置；
[0055] (iii)用于根據測試結果數據計算糖尿病前期、糖尿病和/或糖尿病相關病癥風險 指標值的裝置，其中所述風險指標值代表個體產生或患有糖尿病前期、糖尿病和/或糖尿病 相關病癥的風險；以及
[0056] (iv)用于報告所述風險指標值的裝置。
[0057]在另一方面，本發明提供了一種將一群個體進行分級或分組的方法，該方法包括： 獲得在所述群體中的個體的糖尿病前期、糖尿病和/或糖尿病相關病癥的風險指數數據;并 且基于包括所述獲得的風險指數數據的因素，將在該群體中的個體相對于該群體中的剩余 個體進行分級或將該群體劃分為至少兩個組。
[0058]在另一方面，本發明提供了一種將一群個體進行分級或分組的方法，該方法包括： 基于表1或表2中的至少一種生物標記獲得在所述群體中的個體的糖尿病前期、糖尿病和/ 或糖尿病相關病癥風險指數數據;并且基于包括所述獲得的風險指數數據的因素，將在該 群體中的個體相對于該群體中的剩余個體進行分級或將該群體劃分為至少兩個組。
[0059] 在另一方面，本發明提供了一種用于評估受試者中的糖尿病前期、糖尿病和/或糖 尿病相關病癥替代終點的方法，該方法包括:測量來自表1或表2中的生物標記列表中的至 少一種生物標記；以及基于所述測量評估受試者中的糖尿病前期、糖尿病和/或糖尿病相關 病癥的替代終點。
[0060] 在一些實施方案中，該替代終點可以是在受試者的尿中的蛋白質的量。
[0061] 在一些實施方案中，該替代終點可以是白蛋白肌酸比。
[0062] 在另一方面，本發明提供了一種評估受試者產生糖尿病前期、糖尿病和/或糖尿病 相關病癥的風險的方法，該方法包括測量來自受試者的樣品中的至少一種生物標記，其中 所述至少一種生物標記選自表1或表2中的生物標記列表。
[0063] 在另一方面，本發明提供了一種監測受試者產生糖尿病前期、糖尿病和/或糖尿病 相關病癥的風險的方法，該方法包括測量來自受試者的樣品中的至少一種生物標記，其中 所述至少一種生物標記選自表1或表2中的生物標記列表。
[0064] 在另一方面，本發明提供了一種診斷或鑒定受試者患有糖尿病前期、糖尿病和/或 糖尿病相關病癥的方法，該方法包括測量來自受試者的樣品中的至少一種生物標記，其中 所述至少一種生物標記選自表1或表2中的生物標記列表。
[0065] 在另一方面，本發明提供了一種診斷或鑒定患有糖尿病前期、糖尿病和/或糖尿病 相關病癥的受試者的方法，包括測量來自受試者的樣品中的至少一種生物標記，其中所述 至少一種生物標記選自表1或表2中的生物標記列表。
[0066] 在另一方面，本發明提供了一種監測糖尿病前期、糖尿病和/或糖尿病相關病癥的 治療或干預的方法，該方法包括測量來自受試者的樣品中的至少一種生物標記，其中所述 至少一種生物標記選自表1或表2中的生物標記列表。
[0067] 在另一方面，本發明提供了一種鑒別診斷糖尿病前期、糖尿病和/或糖尿病相關病 癥的疾病狀態或亞類的方法，該方法包括測量來自受試者的樣品中的至少一種生物標記， 其中所述至少一種生物標記選自表1或表2中的生物標記列表。
[0068] 在另一方面，本發明提供了一種治療受試者中的糖尿病前期、糖尿病和/或糖尿病 相關病癥的方法，該方法包括:使用來自表1或表2的至少一種生物標記評估受試者產生糖 尿病前期、糖尿病和/或糖尿病相關病癥的風險以及當受試者被鑒定為具有糖尿病前期、糖 尿病和/或糖尿病相關病癥的升高的風險時用一種治療方案治療受試者，從而延遲或防止 糖尿病前期、糖尿病和/或糖尿病相關病癥的發作。
[0069] 在另一方面，本發明提供了一種將一群受試者進行分級或分組的方法，該方法包 括:獲得代表包含在所述群體中的受試者的糖尿病前期、糖尿病和/或糖尿病相關病癥的風 險評分的數據，其中所述風險評分是使用來自表1或表2的至少一種生物標記計算的，以及 基于包括所述獲得的風險評分數據的因素將該群體中的受試者相對于在該群體中的剩余 個體進行分級或者將該將該群體劃分為至少兩個組。
[0070] 在另一方面，本發明提供了一種鑒定或評定一種藥劑用于治療糖尿病前期、糖尿 病和/或糖尿病相關病癥或降低其產生風險的方法，該方法包括：
[0071] (i)使表達來自表1或表2的至少一種生物標記的細胞與一種假定藥劑接觸;并且
[0072] (ii)將來自表1或表2的至少一種生物標記在與該假定藥劑接觸之前的細胞中的 表達和/或水平與來自表1或表2的至少一種生物標記在與該假定藥劑接觸之后的細胞中的 表達和/或水平進行比較；
[0073] 其中在水平或表達方面的變化將該藥劑鑒定為用于治療糖尿病前期、糖尿病和/ 或糖尿病相關病癥的藥劑。
[0074] 因此，在本發明的另一方面提供了表1或表2中的至少一種生物標記作為針對糖尿 病前期、糖尿病和/或糖尿病相關病癥的藥物靶標的用途。
[0075] 在另一方面，本發明提供了一種治療受試者中的糖尿病前期、糖尿病和/或糖尿病 相關病癥或降低其產生風險的方法，該方法包括向受試者給予有效量的被適配成改變表1 或表2中的至少一種生物標記的表達或水平的藥劑。
[0076] 在另一方面，本發明提供了被適配成改變表1或表2中的至少一種生物標記的表達 或水平的一種藥劑的用途，用于制備用于治療糖尿病前期、糖尿病和/或糖尿病相關病癥或 降低其產生風險的一種藥物。
[0077]附圖簡要說明
[0078]結合附圖可以理解下面的發明詳細說明（通過舉例給出，但不旨在將本發明限制 于描述的特定實施例），其中：
[0079]圖1為列出從三個研究獲得的通過多反應監測(MRM)測量的關于糖尿病患者中的 糖尿病腎病的存在的生物標記蛋白數據的表格；
[0080]圖2為一系列來自FDS1研究的列于圖1中的每個生物標記的盒須圖（左盒形圖：糖 尿病組；右盒形圖：患有嚴重腎病的糖尿病組；X軸：蛋白質/肽；y軸：相對豐度比；肽序列： ATA = ATAWDGAFK; TVA = TVAACNLPIVR; EYC = EYCGVP⑶⑶EELLR; LEP = LEPYADQLR;以及 ISA = ISASAEELR)
[0081]圖3為一系列來自FDS2研究的列于圖1中的每個生物標記的盒須圖（左盒形圖：糖 尿病組；右盒形圖：患有嚴重腎病的糖尿病組；X軸：蛋白質/肽；y軸：相對豐度比；肽序列： IAF = IAFSATR; LEP = LEPYADQLR; ISA = ISASAEELR; ALA = ALAQCAPPPAVCAELVR;以及FLN = FLNVLSPR;DAL = DALSSVQESQVAQQAR;TVA = TVAACNLPIVR;EYC = EYCGVPGD⑶EELLR;⑶I = GDIGETGVPGAEGPR；TGD = TGDIVEFVCK；LVY = LVYPSCEEK)；
[0082]圖4為一系列來自BDS研究的列于圖1中的每個生物標記的盒須圖（左盒形圖：糖尿 病組;右盒形圖：患有嚴重腎病的糖尿病組;X軸：蛋白質/肽;y軸：相對豐度比；肽序列：LVG = LVG⑶NLCSGR; IWL=IWLDNVR;SVS = SVSLPSLDPASAK;以及TEV = TEVIPPLIENR);以及 [0083]圖5為一個列出通過MRM測量的從BDS研究獲得的關于患有糖尿病腎病的患者以及 健康患者的生物標記蛋白數據的表格。
[0084]發明詳細說明
[0085] 本發明涉及與糖尿病前期、糖尿病和/或糖尿病相關病癥（如糖尿病腎病)相關的 生物標記的鑒定。因此，本發明以通過檢測在此披露的生物標記來鑒定具有產生糖尿病前 期、糖尿病和/或糖尿病相關病癥風險的受試者(包括沒有糖尿病前期、糖尿病和/或糖尿病 相關病癥的癥狀或僅僅顯示出其非特異性指標的那些受試者）的方法為特征。這些生物標 記對于監測正在經歷用于糖尿病前期、糖尿病和/或糖尿病相關病癥的治療和療法的患者， 以及用于選擇或修改在患有糖尿病前期、糖尿病和/或糖尿病相關病癥的受試者中將有效 的療法和治療是同樣有用的，其中這樣的治療和療法的選擇和使用減緩了糖尿病前期、糖 尿病和/或糖尿病相關病癥的進展，或者防止了它們的發作。本發明還以用于糖尿病前期、 糖尿病和/或糖尿病相關病癥的新的藥物靶標為特征，包括表1或表2中的至少一種生物標 記。
[0086]
[0087] "用于治療糖尿病前期、糖尿病和/或糖尿病相關病癥或降低其產生風險的藥劑" 包括:胰島素(如成熟胰島素、胰島素原和可溶性C-肽(SCP)、速效胰島素形式、普通胰島素、 中效胰島素以及長效胰島素形式）；降血糖藥;抗炎劑；降血脂劑；以及抗高血壓藥(如鈣通 道阻滯劑、腎上腺素能受體阻滯劑、包括C0X-2抑制劑的藥物前體的環氧合酶2抑制劑、包 括血管緊張素 II受體阻滯劑(ARBs)、ACE抑制劑及腎素抑制劑的血管緊張素系統抑制劑，包 括氨基酸及其衍生物、肽及其衍生物以及腎素抗體）。
[0088] "血管緊張素 II拮抗劑"是通過結合到血管緊張素 II受體上并且干擾它的活性來 干擾血管緊張素 II的活性的化合物，并且包括肽化合物和非肽化合物。大多數血管緊張素 II拮抗劑是被輕微修飾的同源物，其中通過用某種其他的氨基酸替代在8位的苯丙氨酸來 減弱激動活性。血管緊張素 II拮抗劑的例子包括:肽類化合物(例如，肌丙抗增壓素、血管緊 張素八肽（1-8)和相關類似物）；N-取代的咪唑-2-酮;咪唑乙酸酯衍生物(包括2-N-丁基-4-氯-1-(2-氯苯)咪唑-5-乙酸）；4,5,6,7_四氫-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-羧酸及類似物衍 生物;N2-四唑β-葡糖苷酸類似物;取代的吡咯、啦唑、和三唑類;苯酚和雜環衍生物，如1，3-咪唑;咪唑并稠合的 7元環雜環;血管緊張素 Π 的抗體；以及芳烷基咪唑化合物如聯苯-甲基 取代的咪唑;ES8891(N-嗎啉代乙酰基-(-1-萘基)-L-丙氨酰-1-(4,噻唑基)-L-丙氨酰(35， 45)-4-氨基-3-羥基-5-環-己戊酰-N-己酰胺）；SKF108566(E-a-2-[2-丁基-1-(羧基苯基） 甲基]1H-咪唑-5-基[亞甲基]-2-噻吩丙酸）；氯沙坦(DUP753/MK954);以及雷米克林。
[0089] "血管緊張素轉換酶(ACE)抑制劑"包括氨基酸和它們的衍生物、肽類，包括二肽和 三肽以及ACE抗體，它們通過抑制ACE活性在腎素-血管緊張素系統中進行干預，由此減少或 消除升壓物質血管緊張素 Π 的形成。已知作為ACE抑制劑有用的化合物類包括酰基巰基脯 氨酸和巰基烷酰基脯氨酸(如卡托普利和佐芬普利）、羧烷基二肽(如依那普利、賴諾普利、 喹那普利、雷米普利以及培哚普利）、羧烷基二肽模擬物(如西拉普利和貝那普利）、氧膦基 燒酰基脯氨酸(如福辛普利和群多普利）。
[0090] "抗炎"劑包括阿氯芬酸、阿氯米松雙丙酸酯、阿孕奈德;α淀粉酶;安西法爾；安西 非特;氨芬酸鈉;鹽酸氨普立糖;阿那白滯素;阿尼羅酸;阿尼扎芬;阿扎丙宗；巴柳氮二鈉； 芐達酸;苯噁洛芬;鹽酸芐達明；菠蘿蛋白酶;溴哌莫;布地奈德;卡洛芬;環洛芬;辛噴他宗； 克利洛芬;丙酸氯倍米松;丁酸氯倍他松;氯吡酸;丙酸氯硫卡松;醋酸三氟米松;可托多松； 地夫可特;地奈德;去羥米松;二丙酸地塞米松;雙氯芬酸鉀;雙氯酚酸鈉;雙醋二氟拉松;二 氟米酮鈉;二氟尼柳;二氟潑尼酯;地弗他酮;二甲亞砜;羥西奈德；甲地松;恩莫單抗;依諾 利康鈉;依匹唑;依托度酸;依托芬那酯;聯苯乙酸;非那莫;芬布芬;芬氯酸;苯克洛酸;芬度 柳;苯吡噁二酮;芬替酸;夫拉扎酮;氟扎可特;氟芬那酸;氟咪唑;醋酸氟尼縮松;氟尼辛;氟 尼辛葡胺;氟考丁酯；醋酸氟美松龍;氟喹宗;氟比洛芬;氟瑞托芬；丙酸氟替卡松；呋喃洛 芬;呋羅布芬；哈西奈德;丙酸鹵倍他索;醋酸鹵潑尼松;異丁芬酸;布洛芬;布洛芬鋁;布洛 芬吡甲酯;伊洛達普；吲哚美辛；吲哚美辛鈉；吲哚洛芬；吲哚克索；吲四唑;醋異氟龍;伊索 克酸;伊索昔康；酮洛芬；鹽酸洛非咪唑；氯諾昔康；依碳氯替潑諾；甲氯滅酸鈉；甲氯芬那 酸;二丁酸甲氯松；甲芬那酸;美沙拉秦;美西拉宗;磺庚甲潑尼龍;嗎尼氟酯;萘丁美酮;萘 普生;萘普生鈉;萘普索;尼馬宗;奧沙拉秦鈉;奧古蛋白；奧帕諾辛；奧沙普秦;羥布宗;鹽酸 瑞尼托林;木聚硫鈉;甘油保泰松鈉;吡非尼酮;吡羅昔康；肉桂酸吡羅昔康;吡羅昔康乙醇 胺;吡洛芬;普立非酮;潑那扎特;普立非酮;普羅度酸;普羅喹宗;普羅沙唑；枸櫞酸普羅沙 挫；利美索龍;氯馬扎利;柳膽來司；沙那西定;雙水楊酯；水楊酸酯（Salyci late);血根氯 銨；司克拉宗;絲美辛;舒多昔康;舒林酸;舒洛芬;他美辛;他尼氟酯;他洛柳酯;特丁非隆； 替尼達普;替尼達普鈉;替諾昔康;替昔康;芐叉異喹酮；四氫甲吲胺;硫平酸;替可的松匹伐 酯;托美丁;托美丁鈉;三氯奈德;三氟米酯;齊多美辛;糖皮質激素;佐美酸鈉;阿斯匹林;細 胞因子抑制劑如細胞因子拮抗劑(例如IL-6受體拮抗劑）、氮雜-烷基溶血磷脂(AALP)、以及 腫瘤壞死因子_α (TNF-α)抑制劑，如抗TNF-α抗體、可溶性TNF受體、TNF-α、反義核酸分子、多 價丙脒腙（CNI-1493)、N_乙酰半胱氨酸、己酮可可堿（pentoxiphyl line)、己酮可可堿 (oxpentifylline)、碳環核苷類似物、地塞比諾以及TNF-a抑制劑如依那西普和英夫利昔單 抗。
[0091] "β-腎上腺素能受體阻滯劑"拮抗兒茶酚胺在心絞痛、高血壓以及心律失常中的心 血管效應，并且包括阿替洛爾、醋丁洛爾、阿普洛爾、苯呋洛爾、倍他洛爾、布尼洛爾、卡替洛 爾、塞利洛爾、hydroxalol、茚諾洛爾、拉貝洛爾、左布諾洛爾、甲吲洛爾、美替洛爾、吲哚美 辛、美托洛爾、11^^420^11〇1〇1、氧烯洛爾、吲哚洛爾、心得安、普拉洛爾、心得寧、索他洛爾 納多洛爾（sotalolnadolol)、替普洛爾、tomalolol、噻嗎洛爾、布拉洛爾、噴布洛爾、三甲苯 心安、2-(3-(1，1_二甲基乙基)-氨基-2-羥基丙氧基)-3-鹽酸吡啶甲腈、1-丁基氨基-3-(2， 5-二氯苯氧基)-2-丙醇、1-異丙基氨基-3-(4-(2-環丙基甲氧基乙基)苯氧基)-2-丙醇、3- 異丙基氛基_1_(7_甲基諱滿_4_基氧基)_2_ 丁醇、2_ (3-叔丁基氛基_2_羥基-丙硫基)Ια-氨基 甲酰基 _2_ 噻吩基) 噻唑和7_( 2_ 羥基 _3_ 叔-丁基氨基丙氧基) 苯酞。
[0092] "鈣通道阻滯劑"屬于三大類化學藥物之一：二氫吡啶類（如硝苯地平）、苯基烷基 胺類(如維拉帕米）、以及苯并硫氮雜卓類(如地爾硫卓）。根據本發明的其他有用的鈣通道 阻滯劑包括氨力農、氨氯地平、芐環烷、非洛地平、芬地林、氟桂利嗪、伊拉地平、尼卡地平、 尼莫地平、哌克昔林（perhexylene)、戈洛帕米、噻帕米以及噻帕米類似物、苯妥英 (phenyloin)、巴比妥類、以及肽類強啡肽、Ω芋螺毒素以及Ω漏斗網蛛毒素。
[0093] "糖尿病"包括1型糖尿病(包括自身免疫性和特發性）、2型糖尿病和妊娠糖尿病。 糖尿病可以以復發性和持續性高血糖為特征，并且可以通過增加的血糖水平和糖化血紅蛋 白（彡6.5%)而被診斷。根據當前的定義，兩項空腹血糖測量值超過12611^/(1以7.〇1111]1〇1/1) 被認為診斷為糖尿病。
[0094] "糖尿病相關病癥"包括為糖尿病的結果或并發癥的或另外地與糖尿病關聯或相 關的任何病癥或疾病，包括由高于正常的血糖水平引起的病癥以及選自一個列表的病癥， 該列表包括:低血糖、糖尿病酮癥酸中毒、糖尿病神經病變、腎臟疾病包括糖尿病腎病、心血 管疾病、中風和糖尿病視網膜病以及動脈血管疾病(arteriovascular disease)。
[0095] 在本發明的上下文中的"生物標記"包含(不限于)在表1或表2中的蛋白質以及其 實際量度;編碼表1或表2中的蛋白質的核酸;表1或表2中的蛋白質的代謝物和降解產物;表 1或表2中的蛋白質的多晶型、突變、變體、修飾、亞基、肽類(如表3中的那些）以及片段；以及 蛋白質-配體復合物(包括表1或表2中的蛋白質）。生物標記還包括與表1或表2中的蛋白質 具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的一致性或相似性的 蛋白質以及表1或表2中的蛋白質的突變形式和編碼這樣的突變的核酸。這些生物標記可以 用來計算數學指數或其他量度，包括相對于本發明有用的時間趨勢和差異。
[0096] "妊娠糖尿病"是指在懷孕期間的葡萄糖耐受不良。這種病癥導致在懷孕過程中開 始的或首次被診斷的高血糖。
[0097] "降血糖"藥包括口服降血糖藥并且包括(但不限于）第一代磺脲類:醋磺己脲、氯 磺丙脲、甲磺丁脲;二代磺脲類:格列吡嗪、格列本脲、格列美脲;雙胍類:二甲雙胍;葡糖 苷酶抑制劑:阿卡波糖、米格列醇;噻唑烷二酮類:羅格列酮、吡格列酮、曲格列酮;氯茴苯酸 類:瑞格列奈；以及其他降血糖藥如阿卡波糖;丁福明；鹽酸丁氧胺;卡格列波糖;環格列酮； 恩格列酮鈉;達格列酮鈉;鹽酸依托雙胍;格列胺脲;格列波脲(G1 ibomuride);格列他尼;格 列齊特鈉;格列氟胺;胰高血糖素;格列己脲;格列嘧啶鈉;格列辛脲;格列帕脲;利諾格列； 富馬酸利諾格列；帕莫酸甲酯；帕莫酸鈉;酒石酸吡咯格列；人胰島素原;醋酸司格列肽;妥 拉磺脲；甲苯磺吡胺;唑泊司他。
[0098] "空腹血糖受損"（IFG)是一種與高于正常血糖水平但還沒有高到足以被分類為糖 尿病的血糖水平相關的糖尿病前期狀態。具有IFG的受試者可能具有低于或等于125mg/dL， 在100mg/dL與125mg/dL之間或在105mg/dL與125mg/dL之間的空腹血糖（葡萄糖）水平。
[0099]使用在此的術語"一致性"是指在兩個或更多個分子的序列間的關系，如通過比較 這些序列所確定的。"一致性"表示在多肽或核酸分子序列之間的序列相關性程度，如這種 情況可以是通過核苷酸或氨基酸序列串間的匹配而確定的。"一致性"量度了在兩個或多個 帶有空位比對的序列之間的相同匹配的百分比，該空位比對通過計算機程序的特定數學模 型解決。
[0100] "葡萄糖耐量降低"（IGT)是一種與高于正常血糖水平但還沒有高到足以被分類為 糖尿病的血糖水平相關的糖尿病前期狀態。患有IGT的受試者在75g 口服葡萄糖耐量試驗中 可能具有140mg/dL到199mg/dL(7.8mmoL到11. OmmoL)的兩小時葡萄糖水平。
[0101] "降血脂劑"包括吉非貝齊、考來烯胺(cholystyramine)、考來替泊、煙酸以及HMG-CoA還原酶抑制劑，如辛伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀鈉、氟伐他汀、阿托伐他汀和西立伐他 汀。
[0102] 如在此使用的術語"測量(measuring)"以及變體如"測量(measure)"關于在此描 述的生物標記是指確定給定的生物標記的存在和/或量。
[0103] "糖尿病前期"是一種其中滿足部分但不是所有糖尿病的診斷標準的狀態。它包括 其中受試者表現為在正常與糖尿病水平之間的血糖水平的情況、其中受試者經受葡萄糖耐 量降低（IGT)、空腹血糖受損（IFG)和/或在5.7%與6.4%之間的糖化血紅蛋白的情況。
[0104] 在本發明的上下文中的"樣品"是分離自受試者的生物樣品，并且可以包括(通過 舉例但不限于)全血、血液部分、血清、血漿、血細胞、內皮細胞、組織活檢樣品、淋巴液、腹水 液、組織間液(也被稱為"細胞外液"并且包括發現于細胞之間的間隙的液體，包括尤其是齦 溝液）、骨髓、腦脊液(CSF )、唾液、粘液、痰液、汗液、尿液或任何其他分泌物、排泄物或其他 體液。
[0105]術語"相似性"是與"一致性"有關的概念，但是相反地是指相似性的一種量度，包 括相同的匹配和保守置換匹配。由于保守置換應適用于多肽而不是核酸分子，相似性僅涉 及多肽序列的比較。例如，如果兩個多肽序列的20個氨基酸中有10個相同，并且剩余的都是 非保守置換，那么一致性和相似性百分比兩者都是50%。在相同的實例中，如果有另外的5 個位置存在保守置換，那么一致性百分比仍為50%，但是相似性百分比為75%(20個中的15 個）。因此，在存在保守置換的情況下，在兩個多肽序列之間的相似性程度將比這兩個序列 之間的一致性百分比高。
[0106] 術語"保守氨基酸置換"是指用一個標準的殘基置換一個天然的氨基酸殘基使得 對在該位置處的氨基酸殘基的極性或電荷影響很小或沒有影響。例如，用其他任何非極性 殘基置換一個多肽中的非極性殘基導致一個保守置換。此外，多肽中的任何天然殘基也可 以用丙氨酸置換。保守氨基酸置換的一般規則在下面的表中列出：
[0107]
[0108]
[0109] 保守氨基酸置換還包括典型地通過化學肽合成而不是在生物系統中合成的非天 然發生的氨基酸殘基。這些包括模擬肽，以及其他氨基酸部分的反轉形式或反向形式。預期 氨基酸序列的保守修飾(以及相應的對應于編碼核苷酸的修飾)將產生具有與表1中的那些 生物標記相似的功能特性和化學特性的多肽。相反，表1中的生物標記的功能特性和/或化 學特性的實質性修飾可以通過選擇與它們在維持(a)在該置換的區域中的分子主鏈的結 構，例如一個折疊或螺旋構象、（b)在目標位點的分子的電荷或疏水性、或(c)側鏈的體積的 作用方面的顯著不同的置換來實現。天然發生的殘基可以基于常見的側鏈性質分組：
[0110] 1)疏水的：正亮氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸；
[0111] 2)中性親水的:半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸；
[0112] 3)酸性的:天冬氨酸、谷氨酸；
[0113] 4)堿性的:天冬酰胺、谷氨酰胺、組氨酸、賴氨酸、精氨酸；
[0114] 5)影響鏈取向的殘基:甘氨酸、脯氨酸；以及
[0115] 6)芳香族的:色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸。
[0116]優選的用于確定一致性和/或相似性的方法被設計為在測試的序列之間給出最大 的匹配。用于確定一致性和相似性的方法被編入可公開獲得的計算機程序中。優選的用于 確定在兩個序列之間的一致性和相似性的計算機程序方法包括G C G程序包，包括G A P (Devereux等人，《核酸研究》(Nuc.Acids Res ·)，12:387( 1984);遺傳學電腦集團（Genetics Computer Group)，University of Wisconsi(威斯康辛大學），Madison(麥迪遜），威斯康 辛）、81^5了？、81^5了1以及?厶5了厶以七8吐111等人，《分子生物學雜志》(了.]\1〇1.81〇1)，215:403-10(1990))。131^\31 X程序從國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI)以及其他來源(Altschul等人，BLAST手冊(NCB NLM NIH，Bethesda(貝 塞斯達），Md.(馬里蘭州hAltschul等人，1990,上文)是可公開獲得的。熟知的史密斯-沃特 曼算法(Smith Waterman algorithm)也可以用來確定一致性。
[0117] 在本發明的上下文中的"受試者"優選地是哺乳動物。哺乳動物可以是人、非人靈 長類、小鼠、大鼠、狗、貓、馬、或奶牛。受試者可以是已經在先前被診斷或鑒定為患有糖尿 病、糖尿病前期或糖尿病相關病癥的受試者，并且任選地已經經歷或正在經歷用于糖尿病、 糖尿病前期或糖尿病相關病癥的治療性干預。可替代地，受試者可以是在先前未曾被診斷 為患有糖尿病前期、糖尿病和/或糖尿病相關病癥的受試者。例如，受試者可以是展現出糖 尿病前期、糖尿病和/或糖尿病相關病癥的一個或多個風險因素的受試者，或者是沒有展現 出這種風險因素的受試者或沒有糖尿病前期、糖尿病和/或糖尿病相關病癥的癥狀的受試 者。受試者還可以是正在遭受糖尿病前期、糖尿病和/或糖尿病相關病癥或處于其產生風險 的受試者。
[0118] 診斷和預測
[0119] 本發明提供了改進的糖尿病前期、糖尿病或糖尿病相關病癥的診斷和預測。可以 通過測量在此描述的一種或多種生物標記并且將測量值與參考或指標值比較來評定發生 糖尿病前期、糖尿病或糖尿病相關病癥的風險。這樣的比較可以用數學算法或公式進行，以 便將來自多個單獨的生物標記結果的信息和其他參數結合成單一的量度或指數。可以任選 地選擇被鑒定為具有增高的糖尿病前期、糖尿病或糖尿病相關病癥的風險的受試者來接受 治療方案，如給予預防性的或治療性的化合物或運動方案的實施或膳食補充劑來防止、治 療或延遲糖尿病前期、糖尿病或糖尿病相關病癥的發作。
[0120] 可以測量在一個測試樣品中的生物標記的量，并且與一個參照或正常水平比較， 利用例如參考限、鑒別限或風險定義閾值等技術來定義針對糖尿病前期、糖尿病或糖尿病 相關病癥的截止點和異常值。正常的對照水平是典型地發現于在沒有經受糖尿病前期、糖 尿病或糖尿病相關病癥的受試者中的一種或多種生物標記或組合的生物標記指數的水平。 正常水平、異常水平和截止點可能基于一種生物標記是單獨地被使用還是在公式中與其他 生物標記組合成指數而變化。可替代地，正常或異常水平可以是在臨床相關時間范圍中來 自產生或沒有產生或轉化成糖尿病前期、糖尿病或糖尿病相關病癥的先前測試的受試者的 生物標記模式或"特征"的數據庫。
[0121] 本發明可以用來進行產生或轉化為糖尿病前期、糖尿病或糖尿病相關病癥的風險 的連續或分類測量，從而用一個定義的臨床狀態診斷和定義受試者類別的風險譜。在分類 的情況下，本發明的方法可以用來在正常同期組群與患有糖尿病前期、糖尿病或糖尿病相 關病癥的同期組群之間進行辨別。在其他實施例中，本發明可以用來辨別糖尿病前期與糖 尿病、糖尿病與正常情況、不同的糖尿病相關病癥、或不同的糖尿病病癥與正常情況。這種 區分用途可能在單獨的組、數學算法、和/或截止點中需要不同的生物標記組合，但是為了 預期用途它們經受相同的前述的精確度測量。
[0122] 在產生糖尿病前期、糖尿病或糖尿病相關病癥之前鑒定受試者使得能夠選擇和開 始各種治療性干預或治療方案，以便延遲、減緩或防止受試者轉化到疾病狀態。監測至少一 種生物標記的水平還允許糖尿病前期、糖尿病或糖尿病相關病癥的治療過程被監測。例如， 可以從經歷治療方案或治療性干預的受試者提供樣品，例如用于糖尿病前期、糖尿病或糖 尿病相關病癥的藥物治療。這種治療方案或治療性干預可以包括運動方案、膳食調整、膳食 補充、肥胖手術干預、藥物給予以及用于被診斷為或被鑒定為患有糖尿病前期、糖尿病或糖 尿病相關病癥的受試者的治療性或預防性治療。可以在治療之前、過程中或之后的不同時 間點從受試者獲得樣品。
[0123] 本發明還可以用來篩選在不同情景下的群體。對于受試者群組，可以篩選:鑒定需 要干預的那些受試者；用于收集流行病學數據;評定他們用于健康保險目的。當與糖尿病前 期、糖尿病或糖尿病相關病癥的臨床量度相關聯時，通過群體篩選獲得的數據將會是特別 有價值的，并且可以被存儲到數據陣列中或機器可讀介質中的其他收集物中，以便于被衛 生保健服務提供者和聯盟保健產業使用，從而提高服務遞送和效率并因此改善患者的結 局。
[0124] 機器可讀存儲介質包括任何用機器可讀數據或數據陣列編碼的數據存儲材料，當 使用一種用指令編程的機器來使用所述數據時，能夠用于多種目的，如(但不限于)提供或 產生關于隨著時間的推移或者響應于干預或治療以及藥物發現的糖尿病前期、糖尿病或糖 尿病相關病癥風險因素的受試者信息。本發明的生物標記的評定或測量和/或由此確定的 風險可以在可編程計算機上的計算機程序執行中實施，可編程計算機包括(除了別的以外） 一個處理器、一個數據存儲系統(包括易失性存儲器和非易失性存儲器和/或存儲元件）、至 少一種輸入設備、以及至少一種輸出設備。應用程序代碼或軟件來輸入數據，以便進行需要 產生所需要的輸出的功能。
[0125] 該程序代碼或軟件可以進行一種或多種與關于生物標記的數據有關的功能，這些 功能包括:確定生物標記的正常或異常水平并且將生物標記的水平與參考值比較，例如，對 照受試者或其糖尿病前期、糖尿病或糖尿病相關病癥狀態已知的群體或指標值或基線值。 參考樣品或指標值或基線值可能取自或衍生自一個或多個已經暴露于治療的受試者，或者 可能取自或衍生自一個或多個具有低的產生糖尿病前期、糖尿病或糖尿病相關病癥風險的 受試者，或者可以取自或衍生自由于暴露于治療已經在一個或多個與糖尿病前期、糖尿病 或糖尿病相關病癥(包括建立的臨床參數)相關的風險因素方面顯示出改善的受試者。該參 考樣品或指標值或基線值也可以取自或衍生自一個或多個未曾暴露于治療的受試者。例 如，可以從受試者收集樣品來監測治療的進展，這些受試者已經接受用于糖尿病前期、糖尿 病或糖尿病相關病癥的初期治療以及用于糖尿病前期、糖尿病或糖尿病相關病癥的后續治 療。參考值還可以包括衍生自風險預測算法的值或衍生自群體研究的計算指數。
[0126] 因此，本發明的生物標記可以用來產生受試者的生物標記特征譜或特征：（i)不具 有或預期不會產生糖尿病前期、糖尿病或糖尿病相關病癥的受試者和/或（ii)具有或者預 期會產生糖尿病前期、糖尿病或糖尿病相關病癥的受試者。受試者的生物標記譜可以與預 設或參考生物標記譜比較，以便診斷或鑒定具有產生糖尿病前期、糖尿病或糖尿病相關病 癥的風險的受試者，監測疾病的進展、以及疾病進展的速率，并且監測糖尿病前期、糖尿病 或糖尿病相關病癥治療的效果。優選地，本發明的生物標記譜被包含在機器可讀介質中并 且在它們在可以用接到的另外的數據更新的范圍內是"活的"，從而提高這些生物標記的強 度和臨床意義。關于本發明的生物標記的數據也可以與其他數據或測試結果相結合或相關 聯，如(但不限于）臨床參數的測量或其他用于糖尿病前期、糖尿病或糖尿病相關病癥的算 法。其他數據包括年齡、種族、體重指數(BMI)、總膽固醇水平、葡萄糖水平、血壓、LDL以及 HDL水平。機器可讀介質還可以包括受試者信息，如病史和任何其他相關家族史。
[0127] 本發明還提供了用于鑒定用于治療糖尿病前期、糖尿病或糖尿病相關病癥的藥劑 的方法，這些藥劑對于特定的受試者是適當的或另外地定制的。在這方面，可以從來自暴露 于治療劑或藥物的受試者取得測試樣品，并且可以確定一種或多種生物標記的水平。一種 或多種生物標記的水平可以與在治療之前或之后從衍生自受試者的樣品比較，或者可以與 衍生自由于這樣的治療或暴露在風險因素方面已經顯示出改善的受試者中的樣品比較。
[0128] 迴延
[0129] 本發明的生物標記及其組可以在一系列的測試系統中實施。典型地，測試系統包 括一個用于從樣品獲得測試數據的裝置、一個用于針對樣品用于收集、存儲、處理和/或跟 蹤測試結果的裝置(通常在一個數據庫中）、以及一個用于報告測試結果的裝置。用于獲得 測試結果的裝置可以包括被適配成利用生化分析、免疫分析以及核酸檢測分析的一種或多 種進行自動測試的一個模塊。一些測試系統可以處理多種樣品并且可以對給定樣品運行多 次測試。用于收集、存儲、處理和/或跟蹤測試結果的裝置可以包括物理和/或電子數據存儲 設備，如硬盤驅動器或閃速存儲器或紙打印裝置。用于報告測試結果的裝置可以包括一個 可視顯示器、一個連接到數據結構或數據庫的連接、或一臺打印機。在這方面，該報告裝置 可以簡單地是一個數據連接，它被適配成向另一個設備(如數據庫、可視顯示器、或打印機） 發送結果。
[0130] 因此，本發明提供了一種測試系統，該測試系統被適配成輔助鑒定具有產生糖尿 病前期、糖尿病或糖尿病相關病癥的風險、或被診斷為糖尿病前期、糖尿病或糖尿病相關病 癥的個體，該測試系統包括使用關于在此描述的至少一種生物標記數據的一個裝置。典型 地，來自本發明的系統的測試結果作為向電腦或微處理器的輸入，該電腦或微處理器用機 器碼或軟件編程，其帶有關于在此描述的至少一種生物標記的數據并且確定產生或者已經 具有糖尿病前期、糖尿病或糖尿病相關病癥的風險。
[0131] 生物標記選擇
[0132] 表1中的生物標記已經被鑒定為發現在患有糖尿病或糖尿病腎病患者中具有改變 的或調整的存在或濃度水平。因此，本發明的生物標記和方法允許本領域的技術人員鑒定、 診斷或者另外地評定受試者，這些受試者沒有展現出糖尿病前期、糖尿病或糖尿病相關病 癥的任何癥狀，但是盡管如此可能患有糖尿病前期、糖尿病或糖尿病相關病癥或者具有產 生它們的風險。
[0133] 可以選擇表1或表2中的一種或多種生物標記來形成一組標記物。例如，本發明的 一個實施例是一種評估產生糖尿病前期、糖尿病或糖尿病相關病癥的方法，該方法包括測 量來自表1或表2的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13種生物標記的水平的步驟。優選 地，該組包括下列中的至少一種:過氧化物還原酶2(P32119)、蛋白AMBP(P02760);載脂蛋白 A-IV(P06727)以及補體Clq子成分亞基B(P02746);脂聯素(Q15848)、補體因子Η相關蛋白2 (Ρ36980)、血紅蛋白亞基β(Ρ68871)、載脂蛋白Β-100(Ρ04114)以及巰基氧化酶1(000391)中 的至少一種；或者載脂蛋白C-III(P02656)、胰島素樣生長因子結合蛋白3(P17936)、CD5抗 原樣蛋白（043866)以及補體成分C8f3鏈(P07358)中的至少一種。
[0134] 臨床算法
[0135] 使用本發明的生物標記獲得的結果可以使用任何一種或多種公式結合到在發明 的實踐中有用的指數中。如上所述(但不限于），在多種其他指示中，這些指數可能表明從一 種疾病狀態轉化到另一種疾病狀態的概率、可能性、絕對或相對風險、時間或速率，或者預 測糖尿病前期、糖尿病或糖尿病相關病癥的未來生物標記量度。這可能持續一個特定的時 期或范圍，或者持續剩余的壽命風險，或者簡單地被提供作為相對于另一個參考受試者群 體的指數。
[0136] 優選的公式包括廣泛類的統計分類算法，如相對操作特性(R0C)、判別分析例如線 性判別分析（LDA)的使用。可以使用具有不同閾值的基于特征基因（eigengene)的方法 (ELDA)或基于多元方差分析(MAN0VA)的步進算法來鑒定LDA特征。可以基于霍特林-勞利 (Hotel 1 ing-Lawley)統計進行前向算法、后向算法以及逐步算法將未分離的可能性降到最 低限度。也可以分開地使用或組合使用其他的公式包括支持向量機(SVM)、隨機森林或遞歸 分割來鑒定最重要的生物標記組合。
[0137] 可以使用其他的公式，以便在進一步處理之前將單獨的生物標記測量的結果預處 理成更有價值的形式的信息。預處理包括使用數學轉換(如對數函數或邏輯函數)將生物標 記結果進行反向轉換和平方根轉換、歸一化。基于臨床參數（如年齡、性別、種族、BMI或性 另IJ)的歸一化是特別優選的。
[0138] -個或多個臨床參數可以結合本發明的生物標記用于本發明的實踐中，作為公式 的輸入或作為使用特定的生物標記組和公式測量的定義相關群體的預篩選標準。臨床參數 還可以在生物標記的歸一化和預處理、或者在生物標記的選擇、組構建、公式類型選擇和衍 生、以及公式結果后處理中是有用的。
[0139] 本發明的生物標記組可以針對預期的群體和終點或用途而被定制。例如，生物標 記組和公式可以用于評定受試者的一級預防和診斷以及二級預防和管理。對于初步評定， 這些組和公式可以用于病癥的預測和風險分層、糖尿病病癥的診斷、血糖水平和變化速率 的預測以及未來診斷的指示。對于二級預防和管理，這些組和公式可以用于糖尿病并發癥 的預測和風險分層。這些組和公式可以用于臨床決策支持，例如確定是否推遲到下一次就 診的干預、是否推薦常規的預防性檢查、是否推薦增加的就診頻率、是否推薦增加的測試以 及是否推薦治療性干預。這些組和公式對于具有糖尿病病癥的受試者中的干預可能也是有 用的，如治療選擇和反應、治療的調整和給藥、監測進行中的治療效果以及在治療性干預中 變化的指示。
[0140] 本發明的疾病終點包括糖尿病前期、糖尿病或糖尿病相關病癥。在此的組和公式 可以通過輔助診斷和/或確定糖尿病前期、糖尿病或糖尿病相關病癥的嚴重性和/或確定疾 病或病癥的亞類來評估疾病終點的當前狀態在此的組和公式對于確定干預的未來狀態也 是有用的，例如確定用療法、干預和藥物療法的未來糖尿病前期、糖尿病或糖尿病相關病癥 的預后。本發明可以被定制為特定的干預、藥物類、治療類或療法或藥物療法或它們的組 合。
[0141] 本發明的替代終點包括測量HBAIc、葡萄糖（I7PG和0GTT)、以及葡萄糖類(正常葡 萄糖耐量(NGT)、IGT、IFG以及T2DM)。在此的組和公式對于通過診斷空腹或不空腹的葡糖糖 類來確定替代終點的當前狀態是有用的。可以使用在此的生物標記組來確定替代終點的未 來狀態，如確定未來葡萄糖組的預后。生物標記組和公式對于確定干預的未來狀態也是有 用的，例如確定用藥物療法的未來葡萄糖組的預后。
[0142] 糖尿病病癥的并發癥終點包括在此的糖尿病相關病癥，如腎臟疾病、眼睛視網膜 病變、微血管損傷、肝損傷、截肢以及心血管并發癥。這些生物標記組和公式可以通過輔助 診斷糖尿病前期、糖尿病或糖尿病相關病癥來評估疾病終點的當前狀態。可以使用生物標 記組和公式來確定并發癥終點的未來狀態，例如確定未來糖尿病前期、糖尿病或糖尿病相 關病癥的預后。這些組和公式對于確定干預的未來狀態也是有用的，例如確定具有治療的 未來糖尿病前期、糖尿病或糖尿病相關病癥的預后。
[0143] 用于治療糖尿病前期、糖尿病或糖尿病相關病癥或降低其產生風險的藥劑
[0144] 本發明的生物標記也可以用來鑒定或評定用于治療糖尿病前期、糖尿病或糖尿病 相關病癥或降低其產生風險的藥劑。因此，本發明還提供了一種鑒定或評定用于治療糖尿 病前期、糖尿病和/或糖尿病相關病癥或降低其產生風險的藥劑的方法，該方法包括：
[0145] (i)使表達來自表1或表2的至少一種生物標記的細胞與一種假定藥劑接觸;并且
[0146] (ii)將來自表1或表2的至少一種生物標記在與該假定藥劑接觸之前的細胞中的 表達或水平與來自表1或表2的至少一種生物標記在與該假定藥劑接觸之后的細胞中的表 達進行比較；
[0147] 其中表達或水平的變化將該藥劑鑒定為用于治療糖尿病前期、糖尿病和/或糖尿 病相關病癥的藥劑。
[0148] 這些細胞可以在體內與這些假定藥劑接觸，如在動物模型中，或者在體外接觸，如 在細胞培養物或細胞系中。可以使用計算機驅動的程序或軟件來比較該表達或水平。
[0149] 本發明還提供了一種治療在受試者中的糖尿病前期、糖尿病和/或糖尿病相關病 癥或降低其產生風險的方法，該方法包括向受試者給予有效量的被適配成改變表1或表2中 的至少一種生物標記的表達或水平的藥劑。
[0150] 可以根據如由有適當資格的從業者選擇的任何已知的方法來給予該藥劑。這些藥 劑可以作為包含有效量的與藥學上可接受的物質（例如藥學上可接受的載體)混合的藥劑 的組合物的一部分而被給予。該載體材料可以是注射用水，優選補充有用于向哺乳動物給 予的常用于溶液中的其他材料。如果需要，可以包括標準的藥學上可接受的物質，例如載 體、稀釋劑、以及賦形劑。其他示例性的組合物包括pH大約7.0到8.5的三羥甲基氨基甲烷緩 沖液，或pH大約4.0到5.5的醋酸鹽緩沖液，還可以進一步包括山梨醇或其適合的替代物。
[0151] 可以由本領域的一位技術人員根據給藥途徑、遞送形式以及所希望的劑型確定該 藥劑的最優配方。參見，例如《雷明頓藥物科學》（Remington ' s Pharmaceut i cal Sciences)，1435-1712(第 18版，A.R.Gennaro編輯，馬克出版公司（Mack Pub 1 ishing Company)，1990)。這樣的組合物可能影響物理狀態、穩定性、體內釋放速率以及體內清除速 率。
[0152] 因此，在本發明還提供了一種藥劑用于制備用于治療糖尿病前期、糖尿病和/或糖 尿病相關病癥或降低其產生風險的用途，該藥劑被適配為改變表1或表2中的至少一種生物 標記的表達或水平。
[0153] 優選地，該被適配為改變表1或表2中的至少一種生物標記的表達或水平的藥劑是 一種用于治療如在此定義的糖尿病前期、糖尿病和/或糖尿病相關病癥或降低期產生風險 的藥劑。其他用于治療糖尿病前期、糖尿病和/或糖尿病相關病癥或降低其產生風險的藥劑 包括脂肪酶抑制劑如新利司他;合成糊精類似物如含有或不含有瘦素的醋酸普蘭林肽制 劑;鈉-葡萄糖協同轉運蛋白2抑制劑如舍格列凈、YM543、達格列凈、雙重脂肪甘油三酯脂酶 和PI3激酶活化劑如Adyvia;神經肽Y2、Y4和Y5受體的的拮抗劑，人激素 PYY3-36合成類似物 和胰多肽;大麻素受體CB1受體拮抗劑如利莫納班、泰倫那班、CP-945，598、激素如油酰雌 酮;血清素、多巴胺以及去甲腎上腺素的抑制劑(在本領域中也被稱為"三單胺再攝取抑制 劑"），如特索芬辛；去甲腎上腺素以及多巴胺再攝取抑制劑，如Contrave(安非他酮加上阿 片拮抗劑納曲酮）以及Excalia(安非他酮加上抗驚厥藥唑尼沙胺）；1型111.?3羥基類固醇脫 氫酶類（1 lb-HSDl)抑制劑;皮質醇合成抑制劑如酮康唑;糖異生抑制劑;葡糖激酶激活劑； 蛋白酪氨酸磷酸酶-1B的反義抑制劑；以及其他藥劑，像胃泌素和表皮生長因子(EGF)類似 物的注射劑如胰島新生療法(El-I .N.T.);以及倍他司汀。
[0154] 生物標記測量
[0155] 可以使用一系列的技術中的一種或多種測量生物標記。優選地，以一種使受試者 變異性最小化的方式測量這些生物標記。例如，可以在空腹狀態下測量它們，并且最常見地 是在早晨，由于食物消耗和代謝以及晝夜變化，提供了降低水平的受試者變異性。在本發明 中，可以使用任何空腹的或基于時間的取樣程序。
[0156] 可以使用本領域已知的任何方法在蛋白質水平或核酸水平上確定在此的生物標 記的水平的實際測量。例如，在核酸水平，可以使用Northern和Southern雜交分析、以及使 用特異性識別這些序列中的一種或多種的核糖核酸酶保護測定來確定基因表達。還可以使 用基于反轉錄的PCR測定(RT-PCR)，例如，使用用于基因的差異表達序列的引物來測量生物 標記水平。優選地，可以在蛋白質水平上，例如通過測量由在此描述的基因產物編碼的肽的 水平、或者其活性來確定生物標記水平。這樣的方法包括，例如基于針對由這些基因編碼的 蛋白質的抗體的免疫測定、適配體或分子印跡。
[0157] 可以以任何適合的方式檢測表1或表2中的生物標記、多肽、肽、突變以及其多晶 型，但是典型地通過使來自受試者的樣品與結合生物標記蛋白、多肽、突變或多晶型的一種 抗體接觸并且然后檢測反應產物的存在或不存在來進行檢測。抗體可以是單克隆抗體、多 克隆抗體、嵌合抗體或前述抗體的一個片段，并且檢測反應產物的步驟可以用任何適合的 免疫測定來進行。
[0158] 根據本發明實施的免疫測定可以是均相測定或非均相測定。在均相測定中，免疫 反應通常涉及針對該生物標記的特異性抗體、標記的分析物、以及感興趣的樣品。在該抗體 與該標記的分析物結合后，直接或間接地改變了由該標記產生的信號。該免疫反應和其檢 測程度兩者都可以在一個均相溶液中進行。可能被采用的免疫化學標記包括自由基、放射 性同位素、熒光染料、酶、噬菌體、或輔酶。
[0159] 在非均相測定方法中，這些試劑通常是樣品、抗體以及用于產生可檢測信號的裝 置。可以使用以上所述的樣品。該抗體可以被固定到支持物上，如小球(如蛋白A和蛋白G瓊 脂糖小球）、板或載玻片，并且與在液相中的被懷疑含有抗原的標本接觸。然后將該支持物 從該液相中分離，并且采用用于產生這樣的信號的裝置來檢測該支持物相或該液相的可檢 測信號。這種信號與在樣品中的分析物的存在有關。用于產生可檢測信號的裝置包括放射 性標記、熒光標記或酶標記的使用。例如，如果待檢測的抗原含有第二結合部位，則與該部 位結合的抗體可以與可檢測基團結合并且在分離步驟之前將其添加到液相反應溶液中。在 固相支持物上的可檢測基團的存在指示了在該測試樣品中抗原的存在。適合的免疫測定的 實例包括寡核苷酸、免疫印跡法、免疫沉淀法、免疫熒光法、化學發光法、電化學發光(ECL) 或酶聯免疫測定。
[0160] 使用表1中的由生物標記數據庫入口提供的序列信息，可以使用本領域的普通技 術人員熟知的方法檢測和測量生物標記序列的表達(如果存在的話），如Northern印跡雜交 分析或特異性地并且優選地定量擴增特定核酸序列的方法。作為另一個實例，這些序列可 以用來構建用于特異性地擴增生物標記序列的引物，例如在基于擴增的檢測方法中，如基 于反轉錄的聚合酶鏈式反應(RT-PCR)。當基因表達中的改變與基因擴增、缺失、多態性或突 變相關時，可以通過比較在測試細胞群與參考細胞群中的被檢驗的DNA或RNA序列的相對量 來進行在測試群和參考群中的序列比較。
[0161] 還可以使用本領域技術人員已知的多種方法中的一種或多種來測量生物標記蛋 白和/或核酸代謝物，包括折射率光譜(RI)、紫外線光譜(UV)、熒光分析、放射化學分析、近 紅外光譜(近IR)、核磁共振光譜(匪R)、光散射分析(LS)、質譜法(包括多重反應監測(MRM) 質譜法、熱解質譜法）、比濁法、色散拉曼光譜、氣相色譜質譜聯合分析法、液相色譜質譜聯 合分析法、基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜法(MALDI-T0F)、離子噴霧光譜質譜聯合分 析法、毛細管電泳、NMR以及IR檢測。
[0162] 當使用質譜法測量這些生物標記時，它們可以通過一種肽來測量，該肽選自以下 列表：
[0163] (i)來自表1或表2的蛋白質的一個5-25個氨基酸的肽；
[0164] (ii)來自表1或表2的蛋白質的一個5-20個氨基酸的肽；
[0165] (iii)來自表1或表2的蛋白質的一個10-20個氨基酸的肽；
[0166] (iv)來自表1或表2的蛋白質的一個10-15個氨基酸的肽;或者
[0167] (v)表3中的一個肽。
[0168] 試劑盒
[0169] 本發明還提供了一種生物標記檢測試劑，例如一種對于表1或表2中的生物標記蛋 白或表3中的肽特異的抗體，或一種通過具有同源的核酸序列特異性地識別或結合到一種 或多種編碼表1或表2中的生物標記蛋白或表3中的肽的核酸，如寡核苷酸序列或適配體，其 與以試劑盒的形式包裝在一起的核酸的一部分互補。除了別的以外，該試劑盒可以在分開 的容器中含有一種核酸或一種抗體（已經結合到固相基質上或者與用于將它們結合到該基 質上的試劑分開包裝）、對照制劑（陽性和/或陰性）、和/或可檢測標記如熒光素、綠色熒光 蛋白、羅丹明、花青染料、亞歷克薩染料、螢光素酶、放射性示蹤標記。進行測定的說明書也 可以包括在試劑盒中。例如，測定可以是Northern雜交、夾心ELISA或蛋白質抗體陣列的形 式。
[0170] 用于檢測本發明的生物標記的試劑可以被固定到固體基質（如多孔條)上以便形 成至少一個生物標記檢測位點。該多孔條的測量或檢測區域可以包括多個含有抗體或核酸 的位點。一個測試條也可以含有用于陰性和/或陽性對照的位點。可替代地，對照位點可以 位于與測試條分開的帶上。任選地，不同的檢測位點可以含有不同量的固定的抗體或核酸， 如在第一檢測位點上的量較高而在隨后的位點上的量較低。在添加測試樣品后，顯示出可 檢測信號的位點的數目提供了存在于該樣品中的生物標記的量的定量指示。這些檢測位點 可以被配置成任何適合的可檢測形狀，并且典型地呈跨過測試條的寬度的條或點的形狀。
[0171] 可替代地，試劑盒含有核酸基質陣列，該核酸基質陣列包含一個或多個核酸序列。 位于該陣列上的核酸特異性地識別一種或多種核酸序列，這種核酸序列被適配為結合編碼 表1或表2中的生物標記的核酸序列。該基質陣列可以在例如固體基質或"芯片"上。可替代 地，該基質陣列可以是溶液陣列。
[0172] 實例
[0173] 實例1-糖尿病生物標記的鑒定和確認
[0174] 1.材料/方法
[0175] A.同期組群說明
[0176] A.I.弗里曼特爾糖尿病研究（1期)
[0177] 理論:本n)Sl同期組群包括1294位患有2型糖尿病的患者。選擇具有和不具有糖尿 病腎病的糖尿病受試者，以便提供顯著不同的表型展示，使得能夠在蛋白質表達中差異最 大。
[0178] I期弗里曼特爾研究(FDS)是在來自穩定的郵政編碼限定的120，097人的城市社區 的患者中的糖尿病護理、控制、并發癥以及花費的縱向觀察研究。當在1991年構思I期時，還 很少有公開的糖尿病自然病史數據。
[0179]
[0] A. 2.弗里曼特爾糖尿病研究(2期)
[0181] 理論:FDS2同期組群招募了在弗里曼特爾地區以及其他來自FDS1同期組群數據庫 中的被臨床醫生提及的糖尿病患者。選擇具有和不具有糖尿病腎病的糖尿病受試者，以便 提供顯著不同的表型展示，使得能夠在蛋白質表達中差異最大。
[0182] II期在2007年被構思用于改進的和擴展的數據收集，以便表征在同時期的澳大利 亞的城市的糖尿病的性質。
[0183]
[0184」A. 3.巴瑟爾頓糖尿病研艽
[0185] 理論:從一個鄉村社區擴展關于糖尿病患者的信息。完善從rosi和FDS2城市研究 中獲得的信息。包括匹配的非糖尿病對照受試者。
[0186] 巴瑟爾頓健康研究是世界上運行時間最長的流行病學研究計劃之一。自從1966 年，在西澳大利亞的西南的一個沿海社區的巴瑟爾頓城市的居民已經參與一系列健康調 查。迄今為止，超過16,000的各年齡的男性、女性以及小孩已經參加到調查中并且已經為幫 助許多常見疾病和健康狀況的了解做出貢獻。
[0187]
[0188] B.使用iTRAQ和2D LC MALDI T0F/T0F的蛋白質生物標記發現
[0189] 該發現方法學涉及用化學方法標記不同組(例如糖尿病腎病相對于沒有腎病的糖 尿病患者）的患者的血漿并且用質譜法確定特定蛋白質的存在的相對比。在分析之后具有 顯著的改變的濃度的蛋白質指示了與其他組相比的一組患者在生物化學方面的變化。本技 術被用來測量每個樣品中的130-200種蛋白質的相對濃度。鑒定了在組間具有顯著不同的 濃度的蛋白質，并且選擇這些蛋白質用于進一步通過MRM方法學進行檢驗(下面的C部分）。
[0190] B.I.樣品制備
[0191] 在免疫耗竭之前使用MARS 14HPLC柱(安捷倫科技)匯集具有14種最豐富的蛋白質 的血漿樣品(N=10或20)。使用10kDa截留自旋過濾器(賽多利斯)將免疫耗竭的樣品緩沖交 換為1M三乙基碳酸氫銨。根據iTRAQ方案(應用生物系統公司）將蛋白質樣品還原、烷基化、 胰蛋白酶消化并且標記。
[0192] B. 2.儀器分析
[0193] 在用強陽離子交換液相色譜(30乂)在安捷倫1100冊^：上用一種聚磺乙基柱(4.6111111 X 100mm，5ym，3()0 A)在分離之前，在一個Strata-X 33μΜ聚合物反相柱(菲羅門）上對肽脫 鹽。用OmM到400mM的線性梯度的KC1洗脫肽。將SCX組分脫鹽并加載到終極3000納米HPLC系 統（戴安<^18，？6口1&1。100,3以111)上并且使用？1'〇13〇1:(]^填料）機械點漬（1'〇13〇1:;[08。01^61')用 10 % -40 %梯度的乙腈(0.1 %甲酸)分離。在4800MALDI T0F/T0F分析儀上分析產生的斑點。
[0194] B0.3.數據分析
[0195] 使用Pr〇teinPil〇tTM2.0.1軟件(應用生物系統公司）進行數據分析。使用PSPEP算 法計算錯誤發現率，該PSPEP算法與ProteinPi lot?2.0.1-起使用，并且只接受總體錯誤發 現率(FDR)〈5 %的來自來健康受試者的蛋白質。
[0196] C.使用多重反應檢測(MRM)確認生物標記候選物
[0197] 多重反應檢測(MRM)是一種基于質譜法的方法，用來特異性地靶向針對特征肽的 轉換(前體-片段離子對），這種肽代表整個生物標記候選蛋白的替代物。對于每個候選物， 使用對這種蛋白質是唯一的（當與SwissProt人類數據庫57.1版本相比較時）一個或兩個 肽。這種高通量方法被用來確認來自在大量的單獨的患者血漿樣品中的發現階段的生物標 記(見以上B部分）。
[0198] C1.樣品制備
[0199] 制備與先前iTRAQ實驗相同的匯集的樣品以及與先前iTRAQ池(確認樣品）不同的 單獨的樣品（每組N = 10)。使用MARS 14HPLC免疫耗竭樣品中的14種最豐富的蛋白質。用 10kDa截留自旋過濾器緩沖交換免疫耗竭的樣品。將蛋白質樣品還原、烷基化、胰蛋白酶消 化并且脫鹽。另外，用 18〇標記一種血漿參照樣品（健康個體的集合)并且最后在LC-MRM/MS分 析之前摻入每個同期組群樣品中（1:1)。
[0200] C. 2.將生物標記列表翻譯為MRM轉換列表
[0201] 通過一系列的步驟產生預備MRM轉換列表，這些步驟包括下載蛋白序列、結合過濾 器在電腦中消化蛋白質（例如，7-21個氨基酸，漏切率0)，以及選擇每個肽的最少4個轉變 (通常前體帶電z2,產物帶電zl)。關于來自文獻和資料檔案庫(PeptideAtlas，MRMaid)的蛋 白質特異性肽(proteotypic peptide)的有用信息同樣被結合，并且轉換的選擇由波譜庫 (138、見31\6?1、8訃1丨〇3?6〇)支持。一種被稱為31^1丨116的開源軟件(1&1(^〇88研究室，華盛 頓大學，西雅圖，華盛頓，美國）被用來產生并改進MRM轉換以及用于分析MRM轉換數據。 [0202]將lyg的血漿消化物的等分部分直接加載到納米柱上(戴安C18，PepMap100 ,3ym)， 并且用100分鐘梯度的2%-30%的乙腈(0.1%甲酸)將肽洗脫到裝備有一個納升電噴霧電 離源的4000Qtrap中。每次運行最多需要200次MRM，停留時間20毫秒，一個循環5秒。分析這 些運行（即刪除沒有合理的轉換的肽），并且使改進的這些肽和轉換的列表經受MRM觸發的 MS/MS實驗，以便確認肽分配。由于低豐度蛋白的肽分配是一個沒有標準的相當挑戰性的工 作，產物離子掃描(EPI)設置不同，例如，掃描速率（1000-4000)，LIT填充時間（20-300毫 秒）。選擇每個肽中兩個最強烈的轉換用于確認，并且當一個轉換超過閾值lOOOcps時被發 送，用于MS/MS(質量范圍200-1200)。每次運行使用總共40次MRM，停留時間20毫秒，并且一 個循環約7秒。使用MASCOT針對具有人類分類學過濾器(human taxonomy filter)的當前 SwissProt數據庫來搜索獲得的MS/MS。鑒定的肽與MRM數據相匹配(肽序列、保留時間）。最 后，測試這些確認的肽與MRM 180標記方法一起使用的適合性。每個同期組群研究的最終轉 換列表由每種候選蛋白質(參見表1)的1-2個肽(參見表3)以及每個肽3個轉換組成。如果可 能，排除對候選蛋白非獨特性的肽序列以及具有氨基酸M、W、N末端Q或E等的肽。
[0203]表 3
[0206]
[0207] C. 3.儀器分析
[0208] 復原所有的樣品并且在LC-MRM/MS分析之前以1:1摻入180標記的參考血漿(健康個 體的集合），以便校正這些輪之間的噴霧效率和電離差異。每個樣品一式兩份地直接注射到 納米柱上(戴安(：18辦?1^100,3以111)，并且用100分鐘梯度的2%-30%的乙腈(0.1%甲酸） 將肽洗脫到裝備有納升電噴霧電離源的4000Qtrap中。針對所有的數據采集使用預定的MRM 選項，具有4秒的目標掃描時間（跨過一個峰至少8個數據點）和6-8分鐘的MRM檢測窗口，最 少產生50-60毫秒的停留時間。
[0209] C. 4.數據分析
[0210] 整合所有的轉換，并且針對每個肽(加權的)計算未標記的肽的區域與標記的肽的 區域的比率。基于蛋白質的不變組，針對基于群體的差異，將比率歸一化。最后，將針對非參 數數據的曼-懷二氏(Mann-Whitney)檢驗應用于該歸一化的比率，并且計算p值，該p值定義 了在兩個受試者組(例如健康組與患病組)之間的顯著差異性表達的蛋白質。
[0211] 針對一些列的標記(單變量的和多變量的），還繪制了敏感性、或真陽性率與假陽 性率(相對操作特征曲線）。使用多個統計轉換來提高效能，包括自然對數(ln)、倒數(inv) 和平方根（V)。
[0212] 2.結果
[0213] D.生物標記
[0214] D1.用于糖尿病患者中的糖尿病腎病的生物標記
[0215] 圖1中的表顯示了來自巴瑟爾頓和弗里曼特爾糖尿病研究兩者中關于在所有患有 糖尿病的受試者中糖尿病腎病的存在的生物標記蛋白數據。解決的問題是'用于糖尿病患 者中的糖尿病腎病的生物標記是什么？'
[0216] 圖1中的表格的結果作為盒須圖展示在圖2(研究FDS1)、圖3(研究FDS2)以及圖4 (研究BDS)中。對于每個生物標記候選物，通過MRM測量了每種蛋白質的一個到兩個特征肽。 (左盒形圖：糖尿病組;右盒形圖：具有嚴重腎病的糖尿病組;X軸:蛋白質/肽;y軸:相對豐度 比）。
[0217] 表4-表8中的R0C數據進一步展示了生物標記可以被用作糖尿病腎病的診斷。
[0218] 表4單變量分析
[0219]
[0224] 表7多變量分析(模型n)S2)
[0225]
[0228] D2.患有腎病的糖尿病患者與健康患者的生物標記
[0229] 圖5中的表格描述了發現的患有糖尿病腎病的患者與沒有糖尿病的健康對照組的 生物標記。這些數據源于巴瑟爾頓研究。
[0230] 將顯而易見的是，在不背離本發明的精神和范圍下，可以提供各種變更和等同形 式。這包括在所附權利要求書的范圍之內的修改連同所有修改、可替代構建物和等同物。
[0231] 在本說明書中，特定特征的存在并不排除另外的特征的存在。術語"包括" (comprising)、"包含"（including)以及"具有"（having)應當被解釋為包含在內而不是一 種排除意義。
【主權項】
1. 用于獲得涉及來自受試者的樣品中的至少一種生物標記的測試結果數據的裝置在 制備用于針對腎臟疾病評定所述受試者的測試系統中的用途，其中所述至少一種生物標記 選自表1或表2中的生物標記列表。2. 根據權利要求1所述的用途，其中所述至少一種生物標記是表1或表2中的生物標記 的至少二個、三個或四個。3. 根據權利要求1所述的用途，其中所述至少一種生物標記是CD5抗原樣蛋白、補體Clq 子成分亞基B、胰島素樣生長因子-結合蛋白3、補體因子Η相關蛋白2或載脂蛋白A-IV的至少 一個。4. 根據權利要求1所述的用途，其中用于獲得測試結果數據的所述裝置包括質譜儀。5. 根據權利要求1所述的用途，其中用于獲得測試結果數據的所述裝置包括用于進行 免疫測定的裝置。6. 根據權利要求1所述的用途，其中所述樣品包括血液樣品。7. -種測試系統，所述測試系統包括： (i) 用于獲得代表來自受試者的樣品中的至少一種生物標記的水平的測試結果數據的 裝置，所述至少一種生物標記選自表1或表2中的生物標記列表；以及 (ii) 用于處理在步驟(i)中產生的所述測試結果數據以確定所述受試者產生腎臟疾病 的風險或確定所述受試者是否患有腎臟疾病的裝置。8. 根據權利要求7所述的測試系統，所述測試系統還包括用于報告所述確定的裝置。9. 根據權利要求7所述的測試系統，所述測試系統包括質譜儀。10. 根據權利要求7所述的測試系統，所述測試系統包括用于進行免疫測定的裝置。11. 一種用于監測應用于受試者的腎臟疾病的治療或干預的測試系統，所述測試系統 包括： (i) 用于獲得代表來自所述受試者的樣品中的表1或表2中的至少一種生物標記的水平 的測試結果數據的裝置;以及 (ii) 用于處理在步驟(i)中產生的所述測試結果數據以確定所述治療或干預的效果的 裝置。12. 表1或表2中的至少一種生物標記作為針對腎臟疾病的藥物靶標的用途。
【文檔編號】C12Q1/28GK105974123SQ201610302678
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2011年9月20日
【發明人】托馬斯·斯托爾, 斯科特·伯林根斯, 凱耶·溫菲爾德, 塔米·凱西, 溫迪·戴維斯, 柯爾斯頓·彼得斯, 蒂莫西·戴維斯, 理查德·利普斯科姆
【申請人】普羅蒂阿米克斯國際有限公司, 西澳大利亞大學