用于檢測大腸桿菌o157:h7的夾心型免疫層析試紙的制作方法

用于檢測大腸桿菌o157:h7的夾心型免疫層析試紙的制作方法
【專利摘要】本發明一種用于檢測大腸桿菌O157:H7的夾心型免疫層析試紙，包括一個支撐層，支撐層的上側面上設置有吸附層，吸附層從測試端依次為吸附纖維層、熒光抗體纖維層、纖維素膜層及手柄端的吸水材料層，在纖維素膜層上設有檢測線和質控線，檢測線由抗大腸桿菌O157:H7的單克隆抗體或多克隆抗體構成，質控線由羊抗或兔抗小鼠IgG抗體、或羊抗兔IgG抗體構成，熒光抗體纖維層上吸附有熒光抗體，熒光抗體由FITC標記的抗大腸桿菌O157:H7的單克隆抗體或多克隆抗體構成。本發明還公開了上述夾心型免疫層析試紙的制備方法。本發明的試紙檢測方法簡單，特異性強，靈敏度高，直觀，準確，最低可檢測1CFU/mL的痕量污染。
【專利說明】
用于檢測大腸桿菌0157: H7的夾心型免疫層析試紙
技術領域
[0001 ]本發明屬于生物工程領域，涉及一種免疫層析試紙，特別是一種用于檢測大腸桿 菌0157:H7的夾心型免疫層析試紙。
【背景技術】
[0002] 大腸桿菌0157:H7型(Escherichia coli 0157:H7)是一種腸道出血性大腸桿菌， 是主要食源致病菌之一。由大腸桿菌〇157:H7引起的腸道感染性疾病已經成為全球關注的 公共衛生問題。大腸桿菌0157:H7感染能引起出血性結腸炎(HC)，闌尾炎和結腸穿孔等嚴重 胃腸道并發癥，嚴重的可引起血栓性血小板紫癜(TTP)和溶血性尿路綜合癥(HUS)等全身性 并發癥，其中3-5 %病人死亡，約有12 %病人有嚴重的后遺癥。而且人的感染劑量極低，攝入 10-100個活菌就可引起發病。近年來，大腸桿菌0157: H7在我國食品樣本，尤其是動物肉制 品中檢出率較高。在福建、北京、廣東等省市的多種食品中都檢測到了該菌。大腸桿菌0157: H7對外界環境具有較強適應性，對溫度、pH和干燥有一定的抗性，可以在食物、沙土、水、肥 料和人工微環境中存活長達數月。
[0003] 目前大腸桿菌0157 :H7快速檢測方法主要包括生化方法、分子生物學方法、生物傳 感器、代謝學方法和免疫學方法等。生化方法耗時耗力，而且容易漏檢自然變異株。分子生 物學方法由于其操作復雜對設備依賴度高，加之檢測的準確性和重復性有待提高等原因， 故在致病菌的檢測、診斷領域尚未得到廣泛應用。生物傳感器檢測技術與傳統的檢測方法 相比具有選擇性好、靈敏度高、分析速度快、成本低、能在線檢測等優點，但它往往需要光學 或化學原件，檢測需要儀器輔助，檢測成本較高。代謝組學方法方便、靈敏，具有極大的應用 潛力，但只能用于菌落總數鑒定，不能用于菌種鑒定。免疫學方法是基于抗原-抗體的特異 性結合反應發展而成的蛋白質水平上的系列檢測方法，主要包括酶聯免疫吸附法(ELISA)、 乳膠凝集反應、免疫層析技術和蛋白芯片技術。免疫層析試紙技術在檢測速度和方便性是 最為優越的免疫學檢測方法。
[0004] 免疫層析試紙目前的主要發展方向是提高靈敏度、定量檢測和多元檢測。針對靈 敏度問題目前所采用的方法歸為兩類:采用純度高、親和力強的單克隆抗體和采用新型標 記物。上轉換熒光納米顆粒、量子點和熒光微球等為代表的新型發射光譜型標記物，光學特 性優良，納米材料發光強度高，將它們功能化后與致病菌抗體的氨基偶聯，形成穩定的發光 復合體，借助特定光源通過檢測光信號強度便可將靈敏度得以一定程度的提高。但這些新 材料的制備工藝較復雜，成本較高，原材料難以獲取，離實際應用距離甚遠。
[0005] 熒光標記物FITC是目前應用最為廣泛的熒光素，它的最大吸收光波長為490-495nm，最大發射光波長為525-530nm，呈現明亮的黃綠色焚光，在pH為9.0-9.5的條件下可 與氨基進行反應形成硫脲，FITC熒光標記技術較為成熟，標記方法簡單易行，但其作為標記 物應用于免疫層析試紙并未研究。

【發明內容】

[0006] 針對現有技術中的上述技術問題，本發明提供了一種用于檢測大腸桿菌〇157:H7 的夾心型免疫層析試紙，所述的這種用于檢測大腸桿菌〇157:H7的夾心型免疫層析試紙要 解決現有技術中檢測食品中大腸桿菌〇157:H7的方法靈敏度不高、檢測時間長、檢測過程復 雜的技術問題。
[0007] 本發明提供了一種用于檢測大腸桿菌〇157:H7的夾心型免疫層析試紙，包括一個 支撐層，所述的支撐層的上側面上設置有吸附層，所述的吸附層從測試端依次為吸附纖維 層、熒光抗體纖維層、纖維素膜層及手柄端的吸水材料層，所述的吸附纖維層和應該抗體纖 維層緊密連接，所述的熒光抗體纖維層和所述的纖維素膜層緊密連接，所述的纖維素膜層 和所述的吸水材料層緊密連接，在纖維素膜層上設有檢測線和質控線，所述的檢測線由抗 大腸桿菌〇157:H7的單克隆抗體或多克隆抗體構成，所述的質控線由羊抗或兔抗小鼠 IgG抗 體、或羊抗兔IgG抗體構成，所述熒光抗體纖維層上吸附有熒光抗體，所述的熒光抗體由 FITC標記的抗大腸桿菌0157:H7的單克隆抗體或多克隆抗體構成。
[0008] 進一步的，所述的吸附層的上端設置有保護層，
[0009]進一步的，所述的FITC標記的抗大腸桿菌0157 :H7的單克隆抗體或多克隆抗體的 制備方法包括如下步驟：
[0010] (1)一個配置交聯反應液的步驟，在每升反應液中加入7.56g NaH⑶3，1.06g Na2C03和7.36g NaCl，余量為超純水，將純化后的抗大腸桿菌0157:H7的單克隆抗體于4°C對 交聯反應液中透析2~4次，至pH=9.0;
[0011] (2)將透析后的反應液轉移至反應容器中，放于磁力攪拌器上，按照抗大腸桿菌 015 7: H7的單克隆抗體:FITC的量為lmg: 150yg的比例滴加 FITC的DMS0溶液，避光，4 °C反應 過夜，加入5mol/L的NH4CI 4°C至終濃度為5mmol/L，終止反應2h;
[0012] ⑶將交聯物在PBS中透析8次以上，至透析液清亮，4°C暗處保藏備用。
[0013] 進一步的，所述的吸附纖維層的材料為玻璃纖維棉、尼龍膜、聚偏二氟乙烯膜或聚 酯膜中的任意一種;所述熒光抗體纖維層的材料為玻璃纖維棉、尼龍膜、聚偏二氟乙烯膜 或聚酯膜中的任意一種;所述的吸水材料層的材料為吸水濾紙，所述的支撐層的材料為不 吸水的韌性材料;所述的纖維素膜層的材料為硝酸纖維素膜、純纖維素膜或羧化纖維素膜 中的任意一種。
[0014] 進一步的，所述檢測線中的隱形檢測印跡和質控線中的隱形對照印跡為平行排列 的? Γ直線式印跡，或為"十十"字型排列印跡，或為"π"字型排列印跡，或為字型 排列印跡，或為"卜卜"字型排列印跡，或為Μ十'字型排列印跡，或為點狀排列印 跡。
[0015] 進一步的，在所述吸附纖維層、熒光抗體纖維層及吸水材料層上覆蓋有保護膜，在 吸附纖維層與熒光抗體纖維層交界處對應的保護膜上印制有樣品標記線，該標記線偏向吸 附纖維層一側0.3-0.7cm。
[0016] 本發明還提供了上述的一種用于檢測大腸桿菌0157:H7的夾心型免疫層析試紙的 制備方法，包括以下步驟：
[0017] 1) 一個制備大腸桿菌0157: H7單克隆抗體或多克隆抗體的步驟；
[0018] 2)-個制備熒光抗體的步驟；
[0019] 3)-個制備吸附纖維層的步驟，所述的吸附纖維層采用玻璃纖維棉、尼龍膜、聚偏 二氟乙烯膜或聚酯膜制成；
[0020] 4)-個制備熒光抗體纖維層的步驟，在所述的熒光抗體纖維層上吸附有熒光抗 體；
[0021] 5)-個制備纖維素膜層的步驟，所述的纖維素膜層采用硝酸纖維素膜、純纖維素 膜或羧化纖維素膜，用點樣儀在纖維素膜上噴點檢測印跡，烘干后備用；
[0022] 6)-個組裝試紙的步驟，將吸附纖維層、熒光抗體纖維層、纖維素膜層、吸水材料 層從左至右依次貼在帶有粘合劑的支撐層上，依次將支撐層、吸附層和保護層組裝成試紙。
[0023] 進一步的，所述的吸附纖維層的制備方法如下：將玻璃纖維棉、尼龍膜、聚偏二氟 乙烯膜或聚酯膜浸入TBS緩沖溶液中，所述的緩沖溶液的濃度為0.01M，pH為7.8，所述的緩 沖溶液中，還含有PVP、蔗糖、Tw-20、BSA，在所述的緩沖溶液中，PVP的質量百分比濃度為 0.5%，蔗糖的質量百分比濃度為1%，Tw-20的質量百分比濃度為0.5%，BSA的質量百分比 濃度為1 %，以浸濕為準，凍干，備用。
[0024] 本發明還提供了采用上述的夾心型免疫層析試紙檢測大腸桿菌0157:H7的方法， 包括如下步驟：
[0025] 1)樣品前增菌:將FITC溶于DMS0,在增菌培養基中加入FITC溶液，再加入樣品進行 增菌培養；
[0026] 2)試紙檢測：將試紙插入樣品溶液，10~20秒后拿出平放，5-10min后通過觀察檢 測試紙的檢測線有無熒光，判斷樣品中是否含有大腸桿菌〇157:H7,或通過熒光讀條儀進行 半定量分析。
[0027]本發明的試紙具有以下優點：
[0028] (1)制作簡單、成本低、特異性強，靈敏度高。本發明試紙及檢測方法將免疫熒光技 術與免疫層析技術相結合，待檢樣品中的目標大腸桿菌0157:H7經帶有FITC的增菌培養基 培養后便可發熒光，無需任何標記流程、制作成本低、光穩定性強，將FITC標記抗體引入試 紙后，達到了抗原抗體雙重信號放大的效果，能獲得比普通膠體金試紙更高的靈敏度。且 FITC標記成本較膠體金低。該試紙條保持了傳統膠體金試紙條簡便快速、靈敏度高、特異性 好的的優點，最低可檢測lCFU/mL的痕量污染。
[0029] (2)簡便、快速。該試紙可對食品樣品增菌處理后直接檢測，在紫外光下直接觀測 結果，也可借助熒光閱讀器直接讀值，實現半定量檢測。檢測時只需將試紙插入被檢樣品10 ~20秒，5-10min內即可判定檢測結果，省時省力，操作簡便，一步完成。
[0030] (3)結果顯示形象、直觀、準確。試紙條以顯示黃綠色?"和? Γ (或"十"、"丁"、 "1"、"K'、"十' "·"）印跡作為檢測的陰性和陽性標記，即在纖維素膜上顯示一條黃綠色 ?"印跡，表示被檢樣品中不含大腸桿菌〇157:H7;顯示兩條黃綠色? Γ印跡，表示被檢樣品 中含有大腸桿菌〇157:H7。此結果可用肉眼直接觀測，判定形象、直觀、準確，簡單明了，不易 出現假陽性和假陰性等人為誤判。
[0031] (4)節省費用。該試紙條檢測時無需另配儀器設備和其它試劑，可隨時隨地進行檢 測，既能定性檢測又能定量檢測;檢測費用低廉，能節省大量貴重儀器和設備的投入費用。
[0032] (5)適用范圍廣，便于推廣應用。該試紙能滿足不同層次人員的需要，包括專業化 驗、海關檢疫、衛生檢疫、質量監測、畜產品加工、養殖戶以及消費者個人等，既適于單個樣 品的檢測，又適于大量樣品的篩查，能應用于疾病診斷、細菌檢測和環境檢測等領域。本發 明在保障食品安全、保護消費者健康方面具有極其重要意義，具有明顯的經濟效益和社會 效益。
[0033]本發明和已有技術相比，其技術進步是顯著的。本發明的試紙及其檢測方法簡單， 特異性強，靈敏度高，直觀，準確，可進行定性和半定量檢測，最低可檢測lCFU/mL的痕量污 染，適用范圍廣，成本低，易于推廣應用。
【附圖說明】
[0034] 圖1夾心型試紙原理圖。
[0035]圖2夾心型試紙的結構示意圖。
[0036]圖3夾心型試紙的俯視圖結構示意圖。
[0037]圖4夾心型試紙的靈敏度檢測結果。
[0038]圖5夾心型試紙半定量分析結果。
[0039]圖6夾心型試紙交叉反應實驗結果。
[0040]圖7夾心型試紙模擬帶菌實驗結果。
【具體實施方式】 [0041 ] 實施例1
[0042]本發明試紙的制備過程包括:大腸桿菌0157:H7單克隆或多克隆抗體的制備、吸附 纖維層的制備、纖維素膜層的制備和試紙條的組裝等步驟。
[0043] (1)抗大腸桿菌0157 :H7單克隆抗體或多克隆抗體的制備
[0044] 單抗制備：以滅活的濃度為108cfu/mL的大腸桿菌0157:H7全菌免疫6~8周齡 Balb/C小鼠3~4次，每次免疫間隔時間3~5周，確定抗體效價符合要求后超強免疫，之后3 ~4天，將免疫小鼠眶下竇采血，分離陽性血清;脫頸致死，用75%的酒精浸泡小鼠5~lOmin 消毒體表，無菌取其脾臟，將脾臟剪碎并研磨，經120目尼龍紗布過濾，lOOOrpm離心10min， 收集脾細胞。將1X10 8的脾細胞與NS0骨髓瘤細胞按10:1的比例混合，lOOOrpm離心10min， 棄上清，細胞沉淀物于37°C水浴中緩緩加入0.7~1. OmL大腸桿菌0157 :H7的50%PEG4000， 作用lmin，然后緩緩加入無血清1640培養基15mL，以終止PEG的作用，37°C水浴5~lOmin， lOOOrpm離心10min，棄上清，將細胞沉淀物重懸于HAT選擇培養基中，并加入96孔細胞培養 板孔（l〇〇yL~200yL/孔），置于37°C、5%C0 2培養箱中培養10~14天，用間接ELISA法進行陽 性孔篩選，選擇強陽性、抑制率高、細胞生長旺盛的孔進行3次有限稀釋克隆化，而后擴大培 養，建立雜交瘤細胞株所制備的雜交瘤細胞，分泌的單克隆抗體可特異地與大腸桿菌0157: H7反應，親和力常數達到101()~1012,針對大腸桿菌0157:H7特異抗原決定簇的單克隆抗體， 用于T線的印制。（本實施例只是為了描述單克隆抗體的制備過程，任何市售的與大腸桿菌 0157:H7反應的單克隆抗體在本發明中都可以使用）
[0045]多抗制備：用滅活的大腸桿菌0157:H7免疫新西蘭白兔，免疫原濃度為108cfu/mL， 背部皮下分4~6點注射。首免，免疫原中加入弗式完全佐劑，充分乳化;加強免疫，免疫原中 加入弗氏不完全佐劑，充分乳化，首免后2~3周進行連續免疫4~5次，每次間隔2~3周，最 后一次免疫后10~15天，以間接ELISA測其定效價達到10 5以上時，采血并分離收集高免血 清。以飽和硫酸銨鹽析法提取IgG抗體，即取1份高免血清加2份PBS(pH7.2)混勻，加等體積 飽和硫酸銨溶液混勻，置4 °C冰箱12h，4 °C、2500rpm離心15min，棄上清；再以適量PBS (p Η 7.2)溶解沉淀，加飽和硫酸銨溶液至終濃度3 3 %，置4 °C冰箱2 h，4 °C、2 5 0 0 r p m離心 15min，棄上清；以適量PBS (pH7.2)溶解沉淀，置4 °C冰箱內用PBS (pH7.2)透析48~72h，中間 換液數次，4°C、12000rpm離心15min，收集上清，得純化的抗大腸桿菌0157: H7多克隆抗體，-20°C凍存，用于T線的印制。
[0046] (2)熒光抗體纖維層(結合墊)的制備
[0047] 熒光抗體纖維層的制備，首先需要制備FITC熒光抗體，具體步驟為：
[0048] 1)配置交聯反應液：7.56g NaHC03，1.06g Na2C03,7.36g NaCl，加超純水定容至 1L。將純化后的單抗于4°C對交聯反應液透析3次，至pH=9.0。
[0049] 2)將透析后的反應液轉移至玻璃瓶放于磁力攪拌器上，按照抗體:FITC的量為 lmg:150yg的比例滴加 FITC的DMS0溶液，避光，4°C反應過夜。加入5mol/L的NH4CI 4°C至終 濃度為5mmol/L，終止反應2h。
[0050] 3)將交聯物在PBS中透析8次以上，至透析液清亮。4°C暗處保藏備用。
[0051]其次，用點樣儀在纖維層膜上噴點FTIC抗體，制作熒光跡帶，于37°C避光烘干備 用。
[0052] (3)吸附纖維層(樣品墊)的制備
[0053]測試端吸附纖維層用玻璃纖維棉、尼龍膜、聚偏二氟乙烯PVDF膜或聚酯膜制備，將 纖維材料剪成寬1.5cm的條帶，將其放入樣品墊處理液中浸泡30min，于37 °C烘干，備用。 [0054] (4)纖維素膜層(分析墊)的制備
[0055] 纖維素膜層用硝酸纖維素膜、純纖維素膜或羧化纖維素膜，剪切成寬1.5cm規格的 條帶，用點樣儀在纖維素膜上噴點大腸桿菌0157 :H7單克隆抗體或多克隆抗體和羊抗或兔 抗小鼠 IgG抗體或羊抗兔IgG抗體，制作隱形的檢測印跡帶和對照印跡帶，于37°C烘干備用。
[0056] (5)夾心型試紙的組裝:將吸附纖維層(樣品墊）、熒光抗體纖維層(結合墊）、纖維 素膜層(分析膜）、吸水材料層從右至左依次貼在帶有粘合劑的支撐層(底板)上，并切成3-4cm寬的試紙條即可。（如圖1B所示）。
[0057] (6)本發明試紙條的檢測反應原理：
[0058]當檢測大腸桿菌0157:H7試紙測試端插入待測樣品溶液后，待測溶液通過虹吸作 用帶動待測發光大腸桿菌〇157:H7向纖維素膜層擴散，并最終滲入手柄端的吸水材料層。在 擴散過程中，待測大腸桿菌0157 :H7可與結合墊上的FITC熒光抗體形成FITC-菌-抗體-FITC 的復合物，流至T線時又會被其上的大腸桿菌0157:H7抗體捕獲從而顯示檢測印跡，在紫外 線激發下（或使用熒光閱讀器直接讀值)形成黃綠色檢測印跡帶?"，即為陽性表示；反之 樣品溶液中無大腸桿菌〇157:H7時，則不能與結合墊上的熒光抗體結合，并與纖維素膜上的 大腸桿菌〇157:H7抗體檢測印跡結合，不顯示黃綠色檢測印跡帶即為陰性表示;無論樣 品是否含有大腸桿菌0157 :H7，FITC熒光抗體都會與纖維素膜上的羊抗或兔抗小鼠 IgG(或 羊抗兔IgG)抗體捕獲，形成一個黃綠色對照印跡帶?"（如圖1C所示）。
[0059] 本發明的夾心型免疫層析試紙的檢測方法如下：
[0060] (1)樣品前增菌:樣品采集后應盡快檢驗。若不能即使檢測，可在2_4°C保存18h。無 菌操作取樣25g(mL)加入到含有FTIC溶液的225mLEC或NB肉湯中，將上述溶液放入均質器 中，在拍擊式均質器上連續均質l-2min，或放入盛有225mLEC或NB肉湯（含FITC)的均質杯 中，8000-10000r/min均質l-2min，于37°C培養若干小時（如圖1A所示）。同時做陽性及陰性 對照。
[0061] (2)試紙檢測:將試紙插入樣品溶液，10~20秒后拿出平放，5-10min后通過觀察檢 測試紙的檢測線有無熒光，判斷樣品中是否含有大腸桿菌〇157:H7,或通過熒光讀條儀進行 半定量分析。
[0062] 以下實施例具體說明試紙條的結構和檢測方法。
[0063] 實施例2
[0064] 參見圖2、圖3。
[0065] 圖中1為支撐層，用塑膠薄片條制成，2為吸附纖維層，用玻璃纖維棉制成，熒光抗 體纖維層3上吸附有FITC熒光單克隆抗體，纖維素膜層4采用硝酸纖維素膜，手柄端的吸水 材料層5用吸水濾紙制成，將吸附纖維層2、熒光抗體纖維層3、纖維素膜層4、吸水材料層5各 層從右至左依次粘貼固定在支撐層1上，彼此之間交界處纖維互相交叉滲透。在纖維素膜層 4上設有隱形檢測印跡6,用大腸桿菌0157:H7單克隆抗體制成；隱形對照印跡7用羊抗小鼠 IgG抗體溶液在纖維素膜上印跡制成兩條印跡帶平行排列，形成組合印跡帶
[0066] 8-1為覆蓋在吸附纖維層2和熒光抗體纖維層3上面的樣品端白色保護膜，8-2為覆 蓋在吸水材料層5上面的其它顏色保護膜(如黃色），9為樣品標記線，該標記線位于吸附纖 維層2與熒光抗體纖維層3交界處對應的白色保護膜偏向吸附纖維層2-側約0.5cm處，在標 記線右側保護膜上印有箭頭及max字樣。
[0067] (1)本發明試紙靈敏度檢測：將大腸桿菌0157: H7單菌落接種于含有0.4mg/mL的 FITC培養基中培養，采用平板計數法計數，將菌液分別稀釋為108-104CFU/mL，用夾心型試紙 檢測，5-10min后在紫外燈下觀察檢測結果，目測最低檢測限（L0D)為T線可見時的最低菌 濃度，結果如圖4所示，試紙的L0D為10 6CFU/mL。用熒光讀條儀對試紙進行半定量分析，結果 如圖5所示，試紙在菌濃度為105_10 8CFU/mL時呈線性相關，且L0D為105CFU/mL。
[0068] (2)本發明試紙特異性檢測：采用交叉反應試驗鑒定其特異性。將濃度為108CFU/ mL的常見食源性致病菌，如表1所示，用夾心型試紙檢測，若為陽性即有交叉，檢測結果如圖 6所示，大腸桿菌夾心型試紙只能檢出三株大腸桿菌，其他常見食源性致病菌均不能檢出， 即該試紙具有較好的特異性。
[0069] 表1交叉反應所用的常見食源性致病菌及來源
[0070]
[0071]
[0072] (3)本發明試紙穩定性的測定:對同一批次的夾心型試紙密封后加入干燥劑，避光 放置于4°C。在保存1天，1、5、10、15和20周后分別檢測其靈敏度，結果表明保存20周后的試 紙的靈敏度與保存1天后的無變化，故該試紙至少可在4°C保存20周而保持性能穩定。
[0073] (4)模擬帶菌實驗：從本地超市購買面包、牛奶、果凍樣品，用PCR法鑒定三種樣品 均無大腸桿菌〇157:H7污染。以無菌操作取每種樣品25g至于帶FITC的225mL培養基中培養， 培養基中加入活菌溶液使菌濃度為lCFU/mL，培養瓶放于37 °C搖床培養，每隔2h取樣檢測， 結果如圖7所示。結果表明面包、牛奶樣品培養10h后可檢出，果凍培養8h可檢出；夾心型試 紙可檢出初始菌濃度為lCFU/mL的樣品。
[0074] 實施例3
[0075] 試紙條結構和實施例1相同。不同之處在于：熒光抗體纖維層3吸附有FITC標記的 抗大腸桿菌〇157:H7多克隆抗體，吸附纖維層2用尼龍膜制成，纖維素膜層4采用純纖維素 膜，隱形印記為羊抗兔IgG抗體。隱形檢測印跡帶和隱形對照印跡帶均為"十"，8-2為覆蓋在 吸水材料層5上面的手柄端蘭色保護膜。
[0076] 待測樣品的制備及檢測操作步驟：
[0077] 檢測面包:無菌操作取樣25g加入到含有FTIC溶液的225mLEC或NB肉湯中，將上述 溶液放入均質器中，在拍擊式均質器上連續均質l-2min，于37°C培養若干小時。
[0078]操作方法:將試紙插入樣品溶液，10~20秒后拿出平放，5-10min后通過觀察檢測 試紙的檢測線有無熒光，判斷樣品中是否含有大腸桿菌〇157:H7,或通過熒光讀條儀進行半 定量分析。
[0079]結果判定：（a)陽性如果在纖維素膜上顯示有兩條黃綠色印跡帶"十"，表示檢測結 果為陽性，說明在待測樣品中含有大腸桿菌〇157:H7;(b)陰性如果在纖維素膜上顯示有一 條黃綠色印跡帶"十"，表示檢測結果為陰性，說明在待測樣品中不含大腸桿菌〇157:H7;(c) 失效如果在纖維素膜上沒有黃綠色條帶顯示，則表明試紙條已失效。
[0080] 實施例4
[0081]試紙結構和實施例2基本相同，不同之處在于：纖維素膜層3吸附有抗大腸桿菌 0157:H7的多克隆抗體，吸附纖維層2用尼龍膜制成，纖維素膜層3采用純纖維素膜，隱形檢 測印跡為6-2為覆蓋在吸水材料層4上面的手柄端綠色保護膜。
[0082]用于檢測牛奶樣:無菌操作取樣25mL加入到含有FTIC溶液的225mLEC或NB肉湯中， 將上述溶液放入均質器中，放入盛有225mLEC或NB肉湯(含FITC)的均質杯中，8000-10000r/ min均質l_2min，于37 °C培養若干小時。
[0083] 操作方法:將試紙插入樣品溶液，10~20秒后拿出平放，5-10min后通過熒光閱讀 器直接讀值，數值為T線的熒光強度，根據峰值或峰面積繪制標準曲線，計算實際含量。 [0084] 實施例5
[0085]試紙結構和實施例2基本相同，不同之處在于：吸附纖維層2用聚偏二氟乙烯PVDF 膜制成，纖維素膜層3采用羧化纖維素膜，6-2為覆蓋在吸水材料層4上面的手柄端綠色保護 膜，隱形檢測印跡帶為"1"。
[0086] 用于檢測果凍:樣品前增菌、結果判定和操作方法均同實施例二，不重述。
[0087] 實施例6
[0088] 試紙結構和實施例2基本相同，不同之處在于:吸附纖維層2用聚酯膜制成，纖維素 膜層3采用羧化纖維素膜，隱形檢測印跡帶為" 。
[0089] 用于檢測肉樣，樣品前增菌、結果判定和操作方法均同實施例二，不重述。
[0090] 實施例7
[0091] 試紙結構和實施例2基本相同，不同之處在于:吸附纖維層2用尼龍膜制成。檢測印 跡帶為"十'。檢測樣品、結果判定和操作方法同例二。
[0092] 實施例8
[0093]和實施例2基本相同，不同之處在于:纖維素膜層3吸附有抗大腸桿菌0157:Η7的多 克隆抗體，檢測印跡帶為" ?"。檢測樣品為面包樣。
[0094] 實施例9
[0095]和實施例2基本相同，不同之處在于:纖維素膜層3吸附有抗大腸桿菌0157:Η7的多 克隆抗體，檢測樣品為牛奶樣。
[0096] 實施例8
[0097]和實施例2基本相同，不同之處在于:纖維素膜層3吸附有抗大腸桿菌0157:Η7的多 克隆抗體，檢測樣品為果凍樣。
[0098] 實施例10
[0099]和實施例2基本相同，不同之處在于:纖維素膜層3吸附有抗大腸桿菌0157:Η7的多 克隆抗體，檢測樣品為肉樣。
【主權項】
1. 一種用于檢測大腸桿菌〇157:H7的夾屯、型免疫層析試紙，包括一個支撐層，所述的支 撐層的上側面上設置有吸附層，所述的吸附層從測試端依次為吸附纖維層、巧光抗體纖維 層、纖維素膜層及手柄端的吸水材料層，所述的吸附纖維層和應該抗體纖維層緊密連接，所 述的巧光抗體纖維層和所述的纖維素膜層緊密連接，所述的纖維素膜層和所述的吸水材料 層緊密連接，在纖維素膜層上設有檢測線和質控線，其特征在于:所述的檢測線由抗大腸桿 菌0157:H7的單克隆抗體或多克隆抗體構成，所述的質控線由羊抗或兔抗小鼠 IgG抗體、或 羊抗兔IgG抗體構成，所述巧光抗體纖維層上吸附有巧光抗體，所述的巧光抗體由FITC標記 的抗大腸桿菌〇157:H7的單克隆抗體或多克隆抗體構成。2. 根據權利要求1所述的用于檢測大腸桿菌0157:H7的夾屯、型免疫層析試紙，其特征在 于:所述的吸附層的上端設置有保護層。3. 根據權利要求1所述的用于檢測大腸桿菌0157:H7的夾屯、型免疫層析試紙，其特征在 于:所述的FITC標記的抗大腸桿菌0157:H7的單克隆抗體或多克隆抗體的制備方法包括如 下步驟， (1) 一個配置交聯反應液的步驟，在每升反應液中加入7.56g化H(X)3，1.06g化2(X)3和 7.36g NaCl，余量為超純水，將純化后的抗大腸桿菌0157: H7的單克隆抗體于4°C對交聯反 應液中透析2~4次，至pH=9.0; (2) 將透析后的反應液轉移至反應容器中，放于磁力攬拌器上，按照抗大腸桿菌0157: H7的單克隆抗體:FITC的量為lmg:15化g的比例滴加 FITC的DMS0溶液，避光，4°C反應過夜， 加入5mol/L的NH4C1 4°C至終濃度為5mmol/L，終止反應化； (3) 將交聯物在PBS中透析8次W上，至透析液清亮，4°C暗處保藏備用。4. 根據權利要求1所述的用于檢測大腸桿菌0157:H7的夾屯、型免疫層析試紙，其特征在 于:所述的吸附纖維層的材料為玻璃纖維棉、尼龍膜、聚偏二氣乙締膜或聚醋膜中的任意一 種;所述巧光抗體纖維層的材料為玻璃纖維棉、尼龍膜、聚偏二氣乙締膜或聚醋膜中的任意 一種;所述的吸水材料層的材料為吸水濾紙，所述的支撐層的材料為不吸水的初性材料;所 述的纖維素膜層的材料為硝酸纖維素膜、純纖維素膜或簇化纖維素膜中的任意一種。5. 根據權利要求1所述的用于檢測大腸桿菌0157:H7的夾屯、型免疫層析試紙，其特征在 于:所述檢測線中的隱形檢測印跡和質控線中的隱形對照印跡為平行排列的? Γ'直線式印 跡，或為"十十"字型排列印跡，或為"-Γ T"字型排列印跡，或為《-L _L"字型排列印跡，或 為l· K字型排列印跡，或為? Η "字型排列印跡，或為"??"點狀排列印跡。6. 根據權利要求1所述的用于檢測大腸桿菌0157:Η7的夾屯、型免疫層析試紙，其特征在 于:在所述吸附纖維層、巧光抗體纖維層及吸水材料層上覆蓋有保護膜，在吸附纖維層與巧 光抗體纖維層交界處對應的保護膜上印制有樣品標記線，該標記線偏向吸附纖維層一側 0.3-0.7cm。7. 權利要求1所述的用于檢測大腸桿菌0157:H7的夾屯、型免疫層析試紙的制備方法，其 特征在于包括W下步驟： 1) 一個制備大腸桿菌〇157:H7單克隆抗體或多克隆抗體的步驟； 2) -個制備巧光抗體的步驟； 3) -個制備吸附纖維層的步驟，所述的吸附纖維層采用玻璃纖維棉、尼龍膜、聚偏二氣 乙締膜或聚醋膜制成； 4) 一個制備巧光抗體纖維層的步驟，在所述的巧光抗體纖維層上吸附有巧光抗體； 5) -個制備纖維素膜層的步驟，所述的纖維素膜層采用硝酸纖維素膜、純纖維素膜或 簇化纖維素膜，用點樣儀在纖維素膜上噴點檢測印跡，烘干后備用； 6) -個組裝試紙的步驟，將吸附纖維層、巧光抗體纖維層、纖維素膜層、吸水材料層從 左至右依次貼在帶有粘合劑的支撐層上，依次將支撐層、吸附層和保護層組裝成試紙。8. 根據權利要求7所述的制備方法，其特征在于所述的吸附纖維層的制備方法如下:將 玻璃纖維棉、尼龍膜、聚偏二氣乙締膜或聚醋膜浸入TBS緩沖溶液中，所述的緩沖溶液的濃 度為0.01M，抑為7.8，所述的緩沖溶液中，還含有PVP、薦糖、Tw-20、BSA，在所述的緩沖溶液 中，PVP的質量百分比濃度為0.5%，薦糖的質量百分比濃度為l%，Tw-20的質量百分比濃度 為0.5%，BSA的質量百分比濃度為1%，W浸濕為準，凍干，備用。9. 采用權利要求1所述的夾屯、型免疫層析試紙檢測大腸桿菌0157:H7的方法，其特征在 于包括如下步驟： 1) 樣品前增菌:將FITC溶于DMSO,在增菌培養基中加入FITC溶液，再加入樣品進行增菌 培養； 2) 試紙檢測：將試紙插入樣品溶液，10~20秒后拿出平放，5-lOmin后通過觀察檢測試 紙的檢測線有無巧光，判斷樣品中是否含有大腸桿菌0157: H7，或通過巧光讀條儀進行半定 量分析。
【文檔編號】G01N33/569GK105974113SQ201610288500
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年5月3日
【發明人】宋春美, 劉箐, 劉金鑫, 李建武
【申請人】上海理工大學