一種類風濕因子(IgM型)及其他抗原特異性IgM抗體聯合檢測的方法

一種類風濕因子(IgM型)及其他抗原特異性IgM抗體聯合檢測的方法
【專利摘要】本發明提供一種類風濕因子(IgM型)及其他抗原特異性IgM抗體聯合檢測試紙條，所述試紙條包括在聚氯乙烯膠板上依次貼附的樣品墊、結合物墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，所述硝酸纖維素膜上依次分別包被有第一檢測線、吸附線、一條或多條檢測線和質控線；所述第一檢測線為變性兔/人IgG，所述吸附線為抗人IgG的抗體，所述質控線為人IgM，所述一條或多條檢測線分別選自以下一種或多種特異性抗原：肺炎支原體特異性抗原、流感B型特異性抗原、弓形蟲病原體特異性抗原、自身免疫性抗原和過敏原。本發明還提供了包括該試紙條的試劑盒，該試紙條的制備方法，使用該試紙條或試劑盒進行檢測的方法，和該試紙條或試劑盒的應用。
【專利說明】
一種類風濕因子（I gM型)及其他抗原特異性I gM抗體聯合檢測 的方法
技術領域
[0001] 本發明涉及一種試紙條。具體而言，本發明涉及一種類風濕因子(IgM型)及其他抗 原特異性IgM抗體聯合檢測試紙條，以及包括該試紙條的試劑盒，該試紙條的制備方法，使 用該試紙條或試劑盒進行檢測的方法，和該試紙條或試劑盒的應用。
【背景技術】
[0002] 類風濕因子(RF)是一種以變性免疫球蛋白G(IgG)為靶抗原的自身抗體，無種屬特 異性。類風濕性關節炎(RA)病人和約50%的健康人體內有產生RF的B細胞克隆，在某些病理 因素如變性IgG或EB病毒直接作用下，可大量合成產生RFAF與天然IgG結合能力較差，但易 與免疫復合物中的IgG或聚合IgG反應。RF有IgG、IgA、IgM、IgD、IgE5種類型，檢測RF的方法 主要是測定IgM類RF。檢測RF對類風濕性關節炎(RA)的診斷、分型和療效觀察有重要意義。
[0003] 免疫球蛋白M(IgM)是人類或者動物體內非常重要的一種抗體。當機體感染病原體 或其他抗原后，在體內，最早出現的是病原體或其他抗原特異性的IgM抗體，之后再出現病 原體或其他抗原特異性的IgG抗體。因此，通過檢測機體內抗原特異性IgM的存在與否，可以 診斷人或者動物近期感染病原體或其他抗原的免疫反應狀態。血清內若檢測出特異性的病 原體IgM或其他類型抗原引起的特異性IgM，可以證明該機體有近期病原體感染或其他抗原 引起的如自身性免疫疾病的發生，可以作為病原體感染及免疫疾病等的診斷及用藥依據， 能夠盡早地給予病人更好的治療。準確、快速的診斷方法可以避免抗生素或其他藥物的不 必要使用，并可以及時給出準確地治療方案，因此病原體或其他抗原特異性IgM檢測方法的 建立具有非常重要的意義。
[0004] 從檢測免疫反應原理的角度分析，檢測抗原特異性IgM通常使用捕獲法和間接法。 捕獲法，一般會提高檢測的特異性，但由于抗IgM抗體并不能識別特異性和非特異性IgM，常 常會造成漏檢現象，導致檢測靈敏度偏低;而如果使用間接法原理檢測，一般認為檢測特異 性IgM抗體前，若不去除患者樣本中的IgG類抗體，很容易造成類風濕因子(IgM型)與特異性 IgG及特異性抗原復合物反應導致IgM假陽性，也會造成特異性IgG與特異性IgM競爭抗原結 合位點而導致IgM假陰性。
[0005]目前通過酶聯免疫試劑盒檢測樣品中的類風濕因子或抗原特異性IgM已經是一種 成熟的技術。檢測產品基本分為三類：
[0006] -類是傳統的微孔板產品，但它的檢測過程所耗費時間較長（一般需要幾個小 時），使用的試劑和樣品量也較大，不能滿足少量樣品或臨床及時檢測的需求，檢測原理是 單純的捕獲法或間接法，均存在一定的不足。
[0007] -類是熒光標記檢測玻片產品，該類產品試劑用量減少，但檢測時間仍較長，并且 大部分此類產品的結果還需要借助昂貴的熒光顯微鏡來觀察判讀，這種直觀判斷需要技術 人員的豐富經驗且耗費時間，因此不適合臨場快速檢測。
[0008] 另一類是免疫層析類產品，多為膠體金試紙條，比較快速和簡便，但已有產品的應 用有一定局限性，例如多數產品僅使用捕獲法原理檢測IgM抗體，致使漏檢率較高，而且不 能滿足多指標、多樣本同時檢測。另外，有較少產品使用間接法原理聯合檢測，但如果該產 品沒有對特異性IgG及類風濕因子的干擾進行處理和消除，容易出現假陽性和假陰性，導致 結果不準確。
[0009] 免疫層析技術是一種快速現場檢測技術，操作簡便，如膠體金試紙條產品一般15 分鐘內即可肉眼讀出結果，其基本構造為所述層析試紙條在聚氯乙烯(PVC)背板上一端順 次相互搭接地貼附有樣品墊、復合物墊、硝基纖維素膜，另一端貼附有吸收墊。所述復合物 墊為涂覆有抗體一膠體金復合物(或其他微粒復合物)的玻璃纖維素膜。已有多篇文獻報道 采用膠體金試紙條檢測IgM抗體，有的沒有對IgG和類風濕因子的干擾進行處理，容易造成 結果不準確;有的只簡單增加了能夠吸附人IgG和類風濕因子的一條吸附線或吸附處理步 驟，沒有增加類風濕因子的檢測線，不能實現類風濕因子的檢測。
[0010] 但隨著市場需求的增長，醫院和病人急需能夠聯合、快速檢測的產品，這也成為當 今檢測產品發展的趨勢。因此，基于類風濕因子對抗原特異性IgM抗體檢測時的干擾和原理 上分析，進行二者的聯合、快速檢測產品的研發非常有意義。

【發明內容】

[0011] 因此，基于上述已有技術的缺陷，本發明的目的是提供一種類風濕因子（IgM型)及 其他抗原特異性IgM抗體聯合檢測試紙條，以及包括該試紙條的試劑盒，該試紙條的制備方 法，使用該試紙條或試劑盒進行檢測的方法，和該試紙條或試劑盒的應用。
[0012] 針對上述發明目的，本發明是通過下述技術方案實現的：
[0013]本發明提供一種類風濕因子(IgM型)及其他抗原特異性IgM抗體聯合檢測試紙條， 其中，所述試紙條包括在聚氯乙烯膠板上依次貼附的樣品墊、結合物墊、硝酸纖維素膜和吸 水墊，所述硝酸纖維素膜上包被有第一檢測線(下文中可簡稱為T1線）、吸附線(下文中可簡 稱為A線）、一條或多條檢測線（下文中可分別簡稱為T2線、T3線、……）和質控線（下文中可 簡稱為C線）；所述第一檢測線為變性兔/人IgG，所述吸附線為抗人IgG的抗體，所述質控線 為人IgM，所述檢測線分別選自以下一種或多種特異性抗原:肺炎支原體特異性抗原、流感B 型特異性抗原、弓形蟲等病原體特異性抗原、自身免疫性抗原和過敏原等。優選地，所述特 異性抗原為培養病原體經裂解和/或滅活后并經過純化后得到的多表位抗原。其中，涉及病 原體抗原包被所述檢測線時，所述病原體抗原可以為提取天然純化后多表位病原體抗原， 所述多表位病原體抗原比重組抗原具有更高靈敏度。
[0014] 優選地，根據前述的試紙條，其中，所述樣品墊為玻璃纖維膜。和/或所述吸水墊為 吸水紙。
[0015] 更優選地，根據前述的試紙條，其中，所述結合物墊為覆有抗人IgM抗體-膠體金結 合物的玻璃纖維膜。所述抗人IgM抗體的免疫原優選為人IgM的Fc5y片段;和/或所述抗人 IgM抗體優選為羊抗人IgM的IgG抗體，更優選為所述羊源的IgG抗體的F(ab '）2片段。其中， 所述結合物墊也可以為覆有抗人IgM抗體-其他有色或微粒結合物的玻璃纖維膜。其中，所 述抗人IgM抗體-膠體金結合物具有高度特異性，不會與所述吸附線吸附的IgG抗體進行交 叉反應而顯色。所述抗人I gM抗體-膠體金結合物的高度特異性也可以表現為:所述抗人I gM 抗體可以為IgG抗體去除Fc片段后的F(ab'）2片段，該抗人IgM抗體在結合血清樣本特異性 IgM形成復合物后，不會被類風濕因子(結合變性IgG的Fc段)結合反應而造成類風濕因子檢 測線的假陰性，從而提高了本發明中類風濕因子檢測線的特異性。
[0016] 再優選地，根據前述的試紙條，其中，所述試紙條的寬度為適宜寬度。優選為3~ 5mm 〇更優選為4mm 〇
[0017] 還優選地，根據前述的試紙條，其中，所述第一檢測線、吸附線、檢測線和質控線的 各相鄰線的間隔為適宜寬度。優選為3~8mm。更優選為3mm。所述樣品墊與結合物墊之間重 疊1~2mm，優選為1mm。所述結合物墊與硝酸纖維素膜之間重疊1~2mm，優選為1mm。和/或所 述硝酸纖維素膜與吸水墊之間重疊1~2_，優選為1_。
[0018] 本發明還提供了上述的試紙條的制備方法，其中，所述制備方法包括：
[0019] (1)采用檸檬酸鈉還原氯金酸法制備膠體金溶液：向燒杯中加入1000mL三蒸水，然 后加入10mL的1質量％的檸檬酸鈉溶液，加熱至沸騰后，再加入10mL的1質量％的氯金酸溶 液，煮沸15min后至冷卻，得到所述的膠體金溶液；
[0020] (2)制備結合墊：取20mL步驟（1)制備的膠體金溶液置于燒杯中，加入150yL 0.1M 的K2C〇3溶液調節溶液的pH至7.6，攪拌均勻，然后加入離心好的抗人IgM抗體，攪拌20min，然 后加入2mL 10質量％的牛血清蛋白溶液，進行離心，離心時間為40Min，轉速為lOOOOrpm，然 后棄去上清液，再加入1質量％的牛血清蛋白溶液繼續離心，棄去上清液，采用恢復液對沉 淀物進行恢復，將其涂覆在200平方厘米大小的玻璃纖維膜上面，-45 °C冷凍后，作為結合物 墊，其中所述恢復液的成分為150mM的NaCl，1質量％的牛血清蛋白溶液，0.5質量％的蔗糖 和0.5質量％的酪蛋白鈉，所制備的結合物墊凍干后可以室溫避光保存備用；
[0021] (3)組裝試紙條:將樣品墊、步驟(2)制備的結合物墊、硝酸纖維素膜和吸水墊順次 相互搭接地貼附在聚氯乙烯底板上，得到組裝試紙條；
[0022] (4)包被硝酸纖維素膜:通過劃膜儀將變性兔/人IgG、抗人IgG的抗體、抗原特異性 IgM抗體的抗原和人IgM依次分別包被在步驟(3)的組裝試紙條的硝酸纖維素膜上，即為所 述試紙條。該試紙條還可進一步進行剪切、包裝、密封保存等操作以按需制備相應產品，例 如將所述試紙條的PVC膠板及貼附材料切成寬度為4mm的試紙條；
[0023] 優選地，步驟(2)中所述抗人IgM抗體事先通過以下方法處理:使用胃蛋白酶消化 抗人IgM的IgG抗體，親和純化處理獲得所述抗人IgM抗體F(ab'）2片段。
[0024] 其中，所用的玻璃儀器可以事先用洗液過夜浸泡，然后沖洗干凈。
[0025] 優選地，根據前述的試紙條的制備方法，其中，步驟(4)中所述變性兔/人IgG、抗人 IgG的抗體、抗原特異性IgM抗體的抗原和人IgM的濃度分別獨立為0.3mg/mL。
[0026] 本發明還提供一種類風濕因子（IgM型）及其他抗原特異性IgM抗體聯合檢測試劑 盒，其中，所述試劑盒包括上述的試紙條或采用上述的方法制備的試紙條。優選地，所述試 劑盒進一步包括鋁箱袋以及密封在所述鋁箱袋中干燥劑。和/或滴管。
[0027]本發明還提供了一種類風濕因子（IgM型）和其他抗原特異性IgM的檢測方法，所述 檢測方法基于上述的試紙條、采用上述的方法制備的試紙條或上述的試劑盒，其中，所述檢 測方法包括：
[0028] (1)將所述試紙條平放在檢測臺面上，向樣品墊滴加100μ1樣品，所述樣品為全血 或血清，10~15分鐘后觀察第一檢測線、檢測線和質控線的顯色結果，30分鐘后的顯色結果 視為無效；
[0029] (2)根據標準判斷所述樣品中類風濕因子(IgM型）和其他抗原特異性IgM抗體的情 況：
[0030] 當第一檢測線、檢測線和質控線均顯示紅色條帶，結果判定為；類風濕因子（IgM 型）陽性和其他抗原特異性IgM抗體陽性，
[0031] 當第一檢測線未顯示紅色條帶，檢測線和質控線均顯示紅色條帶，結果判定為;類 風濕因子(IgM型）陰性和其他抗原特異性IgM抗體陽性，
[0032]當第一檢測線和質控線均顯示紅色條帶，檢測線未顯示紅色條帶，結果判定為;類 風濕因子(IgM型）陽性和其他抗原特異性IgM抗體陰性，
[0033]當第一檢測線和檢測線未顯示紅色條帶，質控線顯示紅色條帶，結果判定為;類風 濕因子(IgM型）陰性和其他抗原特異性IgM抗體陰性，
[0034]當質控線未顯示紅色條帶，結果判定為;檢測無效。
[0035] 具體地，也可用下表判斷所述樣品中類風濕因子(IgM型）和其他抗原特異性IgM抗 體的情況：
[0036] 其中"+"表示顯示紅色條帶，表示未顯示紅色條帶，7"表示顯示或未顯示紅色 條帶：
[0037]
[0038] 本發明還提供了上述的試紙條、采用上述的方法制備的試紙條或上述的試劑盒在 制備用于檢測和/或診斷以下一種或多種的產品中的應用:類風濕免疫疾病，優選地，所述 類風濕免疫疾病為類風濕性關節炎；病原體近期感染，優選地，所述病原體為肺炎支原體 和/或B型流感病毒等多種病原體;優生優育，優選地，所述優生優育為檢測弓形蟲；自身免 疫系統疾病，優選地，所述自身免疫系統疾病為系統性紅斑狼瘡(SLE)和/或干燥癥(SS)等。
[0039] 具體地，本發明涉及一種能夠聯合檢測類風濕因子(IgM)及其他抗原特異性IgM抗 體的方法。在該方法中，樣本依次通過類風濕因子（IgM)檢測區（即T1線）、IgG吸附區（BPA 線）、其他抗原特異性IgM檢測區（即T2線、T3線、……）。并提供了所述方法應用在基于免疫 層析快速檢測膠體金試紙條中的制備方法。
[0040] 具體內容如下：
[0041] 在聚氯乙烯(PVC)膠板上一端順次相互搭接地貼上樣品墊、結合物墊、硝酸纖維素 膜、吸水紙，然后將PVC膠板及貼附的材料切成適合(4mm)寬度的試紙條。
[0042] 其中，所述樣品墊為玻璃纖維膜，所述結合物墊為覆有抗人IgM抗體-膠體金結合 物或其他有色或微粒結合物的玻璃纖維膜，優選膠體金結合物;所述硝酸纖維素膜上包被 至少三條線，分別為:T1線即變性兔/人IgG，用于檢測人類風濕因子(IgM);A線即抗人IgG的 抗體，用于吸附樣本中的IgG抗體;T2(T3、T4……）線即不同病原體或其他類引起抗體反應 的特異性抗原;C線即人IgM(如圖1所示）。
[0043] 其中，T1線即人類風濕因子（IgM)檢測線，T2(T3、T4……）線即優化的不同病原特 異性抗原或其他類疾病可引起人體IgM抗體反應的經純化的天然多表位特異性抗原，如感 染病原體引起肺炎的肺炎支原體抗原、自身免疫性疾病如系統性紅斑狼瘡檢測的dsDNA抗 原等、優生優育如弓形蟲抗原等或其他用于IgM抗體檢測用途的任意一種特異性或多種特 異性抗原。根據檢測項目需求，可實現多種抗原的特異性IgM抗體的檢測，并提高靈敏度。 [0044]本發明還涉及一種能夠聯合檢測類風濕因子（IgM)及其他特異性IgM抗體的分析 方法，包括膠體金試紙條技術在類風濕免疫疾病、病原體近期感染和自身免疫系統疾病或 其他檢測用途的特異性IgM抗體檢測中的應用，具體內容如下：
[0045] 在加樣區（即樣品墊)加入被檢測樣品后，通過層析/毛細作用，樣品中IgM類抗體 和抗人IgM-膠體金的結合物向吸水紙一端的方向移動。如果被檢測樣品中含有類風濕因子 (IgM型），當樣品移動到T1線即變性的IgG的包被線時，類風濕因子(IgM型）和抗人IgM-膠體 金的結合物被捕獲，在T1線顯示一條紫紅色條帶，并且類風濕因子（IgM型）不再向后移動造 成對特異性I gM檢測區的干擾。樣品繼續流動，樣品中的I gG抗體則與A線即抗人I gG的抗體 結合，用于吸附樣本中的IgG抗體，將特異性IgG抗體捕獲在A線上，不再與針對的同一抗原 反應的特異性IgM競爭反應位點，增強特異性IgM檢測的靈敏度與特異性。樣品繼續流動，含 有針對某種或多種一次包被的特異性抗原的IgM抗體，當樣品通過T2(T3、T4……）線即不同 病原體或其他類引起抗體反應的特異性抗原包被線時，樣品中的特異性IgM抗體和抗人IgM 抗體-膠體金的結合物被捕獲，通過間接法的原理在T2(T3、T4……）線顯示一條或多條紫紅 色條帶，本檢測區特異性IgM的檢測不再受樣本中可能存在的類風濕因子及IgG造成的假陽 性或假陰性的干擾。樣品繼續移動至C線時，樣品攜帶的抗人IgM抗體-膠體金結合物則與C 線處的人IgM抗體結合，在C線顯示一條紫紅色條帶。
[0046] 優選的，被檢測樣品為全血或血清。
[0047] 若T1，T2(T3、T4……）線都顯示紅色條帶，說明樣品中同時含有類風濕因子（IgM) 和對應的某種特異性的IgM;若T1線未顯示紅色條帶，而T2(T3、T4……）線顯示紅色條帶，則 說明含有對應某種特異性的IgM;若Τ1線顯示紅色條帶，而Τ2(Τ3、Τ4……）線未顯示紅色條 帶，則含有類風濕因子（IgM);若Τ1和Τ2(Τ3、Τ4……）線未顯色，則表示類風濕因子（IgM)和 某種特異性IgM均為陰性;無論T1，T2(T3、T4……）線情況如何，只要C線處未顯示紅色條帶， 則該試紙條判定為無效。
[0048]如果特異性IgM是陽性，表明該機體有近期感染某種病原體，或有自身免疫抗體異 常反應;如果RF(IgM型）是陽性，表明該機體可能有導致類風濕類子產生的異常因素，提示 存在類風濕免疫性疾病的風險;如果RF (I gM型）和特異性I gM都是陽性，表明該機體近期感 染某種病原體，并存在可能有導致類分濕類子產生的異常因素；如果RF(IgM型）和特異性 IgM都是陰性，表明未曾感染某種病原體，類分濕類子產生的異常因素風險較低;無論T1，和 T2 (T3、T4……)處情況如何，如果C線不顯色，該檢測試紙條被視為無效。
[0049]本發明提供的試紙條基于這種樣本依次通過類風濕因子（IgM)檢測區、IgG吸附 區、其他抗原特異性IgM檢測區的分析方法，改變傳統的單獨檢測特異性IgM抗體或類風濕 因子（IgM型）的方法，克服在常規檢測中類風濕因子易于對特異性IgM抗體檢測造成干擾的 不足，并且聯合檢測通過同一個樣本中是否存在類風濕因子（IgM型）的檢測結果來排除是 否有類風濕因子會對后面的特異性IgM抗體檢測造成假陽性干擾的影響，例如若一個樣本 檢測類風濕因子（IgM型）的檢測結果為陰性，則首先可排除該樣本不存在類風濕因子（IgM 型）對后面的特異性IgM抗體檢測的干擾;若一個樣本檢測類風濕因子（IgM型）的檢測結果 為陽性，則表明我們的檢測方法先明確了這是一例會存在類風濕因子(IgM型)對特異性IgM 抗體檢測造成干擾的樣本，但由于我們的設計增加了該項檢測已經捕獲了樣本中的類風濕 因子（IgM型），因此避免了對后面的特異性IgM抗體檢測的干擾該試紙條在特異性抗原IgM 抗體檢測線前，增加類風濕因子
[0050] (IgM)檢測線及吸附IgG線，不僅可以在一次檢測中同時檢測多種特異性IgM抗體 并去除IgG的干擾，還實現了類風濕因子（IgM型）的同時檢測，并減去了樣本中類風濕因子 和IgG抗體對利用間接法檢測特異性IgM抗體造成的假陽性干擾，充分體現了本檢測方案中 間接法原理檢測特異性IgM的靈敏度和特異性的優勢。
[0051] 基于免疫層析技術，該試紙條更加突出了多指標的膠體金免疫層析技術快速檢 測、價格低廉、讀取結果快捷而直觀等特點，不需要特殊儀器設備，也不需要專業人員的操 作，檢測結果的總體符合率較高，可以大大縮短檢測時間和降低檢測費用，達到現場檢測的 目的。
[0052]除此之外，該試紙條改進了以往免疫層析技術中常用捕獲法原理檢測特異性IgM 抗體的不足，因為使用捕獲法原理的檢測區不能識別特異性IgM和非特異性IgM，而可能造 成只捕獲非特異性IgM，而特異性IgM漏檢的情況，使得靈敏度降低;其次改進了以往免疫層 析技術使用間接法原理多包被重組抗原，而導致抗原表位單一而使靈敏度降低的情況，本 方法包被優化的天然培養的病原體經后續處理和純化后的多表位抗原，提高了靈敏度;也 改進了以往免疫層析技術使用間接法原理，但沒有去除IgG和類風濕因子影響的檢測方法， 而造成檢測特異性IgM抗體出現假陽性和假陰性的情況，或有的間接法中雖有IgG吸附處 理，但沒有實現類風濕因子
[0053] (IgM)的同時檢測，不能明確和排除某樣本是否真的存在類風濕因子造成IgM檢測 干擾的判讀。換言之，本發明提供的試紙條在一次檢測中既能夠避免樣本中IgG抗體及類風 濕因子對檢測的干擾，又能夠利用間接法提高靈敏度，并實現同時檢測并清除區分特異性 IgM和類風濕因子（IgM)的陰性和陽性結果，從而獲取更多的相關信息，具有重要的臨床意 義。
【附圖說明】
[0054] 以下，結合附圖來詳細說明本發明的實施方案，其中：
[0055] 圖1示出了一種類風濕因子（IgM型)及其他抗原特異性IgM抗體的檢測方法的示意 圖；
[0056] 圖2示出了類風濕因子（IgM型）及其他抗原特異性IgM抗體聯合檢測試紙條示意 圖；
[0057] 圖3示出了圖3~5所用標記以及所述試紙條結構；
[0058] 圖4示出了所述試紙條有效的檢測結果；
[0059] 圖5示出了所述試紙條無效的檢測結果；
[0060] 附圖標記說明：
[00611 1、加樣區；2、抗人I gM抗體-微粒結合物區；3、硝酸纖維素膜;4、RF (I gM型)檢測區； 5、吸附IgG抗體區;6、特異性IgM抗體檢測區；7、質檢區;8、吸收墊；
[0062] 9、樣品墊；10、結合物墊（可以是覆有抗人IgM抗體-膠體金結合物的結合物墊）； 11、T1線（即檢測類風濕因子（IgM型）區）；12、A線（即吸附IgG抗體區）；13、T2線（即特異性 IgM抗體檢測區）；14、C線（即質控區）；15、吸水墊(可以是吸水紙）；
[0063] 16、變性IgG(可以是變性兔/人IgG); 17、抗人IgG的抗體；18、類風濕因子(可以是 類風濕因子(I gM型））；19、特異性I gM; 20、人IgM; 21、特異性I gM的抗原;22、金標抗體結合物 (可以是抗人IgM抗體-膠體金結合物）；23、納米顆粒(可以是膠體金）；24、抗人IgM抗體;25、 人 IgG;
[0064] 26、檢測結果為RF(IgM)陽性和特異性抗體IgM陽性；27、檢測結果為RF(IgM)陰性 和特異性抗體IgM陽性;28、檢測結果為RF(IgM)陽性和特異性抗體IgM陰性;29、檢測結果為 RF(IgM)陰性和特異性抗體IgM陰性；
[0065] 30~33、分別為檢測結果無效的四種情況。
【具體實施方式】
[0066]下面通過具體的實施例進一步說明本發明，但是，應當理解為，這些實施例僅僅是 用于更詳細具體地說明之用，而不應理解為用于以任何形式限制本發明。
[0067] 以下實施例中，除具體指明的試驗材料、條件以及操作方法外，實施例中所使用的 許多材料和操作方法是本領域公知的。因此，本領域技術人員清楚，在上下文中，如果未特 別說明，本發明所用材料和操作方法是本領域公知的。
[0068] 以下實施例中使用的試劑和儀器如下：
[0069] 試劑：
[0070]變性兔/人IgG:菲鵬生物股份有限公司；
[0071]抗人IgM的抗體、抗人IgG的抗體:北京博奧森生物技術有限公司；
[0072] 人 IgM:sigma;
[0073] 硝酸纖維素膜:默克密理博；
[0074] PVC膠板、吸水紙、玻璃纖維膜:上海金標生物科技有限公司；
[0075] 肺炎支原體IgM抗體檢測試劑盒(酶聯免疫法）：深圳市安群生物工程有限公司；
[0076] 類風濕因子IgM抗體檢測試劑盒(膠體金法）：濰坊市康華生物技術有限公司。
[0077] 儀器：
[0078]三維平面劃膜儀:上海金標生物科技有限公司；
[0079] 冷凍干燥機:北京博醫康實驗儀器有限公司；
[0080] 切條機:上海金標生物科技有限公司。
[0081 ] 實施例1
[0082]本實施例用于說明本發明選用的高度特異性抗人IgM抗體的驗證方法和結果。 [0083]方法1包括:純化的人IgG，濃度為lug/ml，100ul/孔在聚苯乙烯微孔板4度過夜包 被;使用3%牛血清白蛋白（BSA)，200ul/孔，37度2小時進行封閉；然后加入抗人IgM-HRP， lOOul/孔，37度30分鐘，洗滌后，加入TMB顯色液，避光10分鐘后進行酶標儀檢測0D45Qr?-630nm; 并做包被人IgM的陽性對照孔和空白對照孔;均為多孔平行，求均值。檢測結果如表1。
[0084] 方法2包括:試紙條包括在聚氯乙烯膠板上依次貼附的樣品墊、結合物墊、硝酸纖 維素膜和吸水墊;所述樣品墊為玻璃纖維膜;所述結合物墊為具有抗人IgM抗體-膠體金結 合物的玻璃纖維膜;所述硝酸纖維素膜上依次分別包被有檢測線和質控線;所述檢測線為 人IgG，所述質控線為人IgM;所述吸水墊為吸水紙。向樣品墊滴加 100μΙ pbs緩沖液，10~15 分鐘后觀察檢測線和質控線的顯色結果，30分鐘后的顯色結果視為無效。檢測結果如表2。
[0085] 從本實施例中方法1和方法2的檢測結果可知，本發明使用的抗人IgM抗體具有高 度特異性，不與人IgG交叉反應。
[0086] 表 1
[0087]
[0088]
[0089]
[0090] 實施例2
[0091]本實施例用于說明本發明的類風濕因子（IgM型）及其他抗原特異性IgM抗體聯合 檢測試紙條和試劑盒及其制備方法。
[0092]如圖2所示，本實施例的試紙條包括在聚氯乙烯膠板上依次貼附的樣品墊、結合物 墊、硝酸纖維素膜和吸水墊;所述樣品墊為玻璃纖維膜;所述結合物墊為具有抗人IgM抗體-膠體金結合物的玻璃纖維膜;所述硝酸纖維素膜上依次分別包被有第一檢測線、吸附線、一 條檢測線和質控線;所述第一檢測線為變性兔/人IgG，所述吸附線為抗人IgG的抗體，所述 質控線為人IgM，所述檢測線為經過純化后的肺炎支原體特異性天然多表位抗原;所述吸水 墊為吸水紙。
[0093] 其中，第一檢測線、吸附線、檢測線和質控線的各相鄰線的間隔為3~8mm。所述樣 品墊與結合物墊之間重疊1~2mm，所述結合物墊與硝酸纖維素膜之間重疊1~2mm，所述硝 酸纖維素膜與吸水墊之間重疊1~2_。所述試紙條的寬度為適宜寬度。在本實施例中，第一 檢測線、吸附線、檢測線和質控線的各相鄰線的間隔為3mm。所述樣品墊與結合物墊之間重 疊1mm，所述結合物墊與硝酸纖維素膜之間重疊1mm，所述硝酸纖維素膜與吸水墊之間重疊 1mm，所述試紙條的寬度為4mm。
[0094] 上述試紙條的制備方法如下：
[0095] (1)采用檸檬酸鈉還原氯金酸法制備膠體金溶液：向燒杯中加入1000mL三蒸水，然 后加入10mL的1質量％的檸檬酸鈉溶液，加熱至沸騰后，再加入10mL的1質量％的氯金酸溶 液，煮沸15min后至冷卻，得到所述的膠體金溶液；
[0096] (2)制備結合墊：取20mL步驟（1)制備的膠體金溶液置于燒杯中，加入150yL 0.1M 的K2C〇3溶液調節溶液的pH至7.6，攪拌均勻，然后加入離心好的抗人IgM抗體，攪拌20min，然 后加入2mL 10質量％的牛血清蛋白溶液，進行離心，離心時間為40Min，轉速為lOOOOrpm，棄 去上清液，再加入1質量％的牛血清蛋白溶液繼續離心，棄去上清液，采用恢復液對沉淀物 進行恢復，將其涂覆在200平方厘米大小的玻璃纖維膜上面，-45 °C冷凍后，作為結合物墊， 在凍干后在室溫下避光保存備用，所述恢復液的成分為150mM的NaCl，l質量％的牛血清蛋 白溶液，〇. 5質量％的蔗糖和0.5質量％的酪蛋白鈉；
[0097] (3)組裝試紙條:將樣品墊、步驟(2)制備的結合物墊、硝酸纖維素膜和吸水墊順次 相互搭接地貼附在聚氯乙烯底板上，相鄰部分重疊1mm，得到組裝試紙條；
[0098] (4)包被硝酸纖維素膜:采用三維平面劃膜儀將變性兔/人IgG、抗人IgG的抗體、肺 炎支原體特異性抗原和人IgM依次分別包被在步驟(3)的組裝試紙條的硝酸纖維素膜上，其 中劃膜儀的設定參數為:劃線間隔均為3mm，劃線濃度為0.3mg/mL;
[0099] (5)將步驟(4)處理后的組裝試紙切割為寬度4mm的試紙條。本實施例還可進一步 提供試劑盒，其包括鋁箱袋和密封在所述鋁箱袋中的干燥劑、滴管以及上述制備的試紙條。 [0100]該試劑盒的制備方法為:將上述制備的試紙條裝在鋁箱袋中，再裝入一個干燥劑 和滴管，進行密封并在室溫下保存。
[0101] 實施例3
[0102] 本實施例用于說明使用實施例2制備的試紙條或試劑盒在RF(IgM型）和肺炎支原 體樣本檢測中的應用。
[0103] 所述試紙條的使用方法步驟如下：
[0104] (1)收集血清樣品；
[0105] (2)將試紙條平放在檢測臺面上，向樣品墊滴加100μ1步驟（1)的血清樣品，10~15 分鐘后觀察第一檢測線、檢測線和質控線的顯色結果，30分鐘后的顯色結果視為無效；
[0106] (3)結果判斷:根據表3判定結果，其中"+"表示顯示紅色條帶，表示未顯示紅色 條帶，7"表示顯示或未顯示紅色條帶：
[0107] 表3
[0108]
Λ
[0109] 采用實施例2制備的測試紙條對臨床已經確診的陽性血清和陰性血清進行檢測， 結果見表4。
[0110] 表4實施例2檢測結果
[0111]
[0112] 實施例4
[0113]本實施例用于說明本發明的類風濕因子（IgM型）及其他抗原特異性IgM抗體聯合 檢測試紙條和試劑盒及其制備方法。
[0114]如圖2所示，本實施例的試紙條包括包括在聚氯乙烯膠板上依次貼附的樣品墊、結 合物墊、硝酸纖維素膜和吸水墊;所述樣品墊為玻璃纖維膜;所述結合物墊為具有抗人IgM 抗體-膠體金結合物的玻璃纖維膜;所述硝酸纖維素膜上依次分別包被有第一檢測線、吸附 線、兩條檢測線和質控線;所述第一檢測線為變性兔/人IgG，所述吸附線為抗人IgG的抗體， 所述質控線為人IgM，所述檢測線分別為經過純化后的肺炎支原體特異性天然多表位抗原 和經過純化后的流感B型特異性天然多表位抗原;所述吸水墊為吸水紙。
[0115] 其中，第一檢測線、吸附線、檢測線和質控線的各相鄰線的間隔為3_。所述樣品墊 與結合物墊之間重疊1mm，所述結合物墊與硝酸纖維素膜之間重疊1mm，所述硝酸纖維素膜 與吸水墊之間重疊1_。所述試紙條的寬度為4_。
[0116] 上述試紙條的制備方法如下：
[0117] (1)采用檸檬酸鈉還原氯金酸法制備膠體金溶液：向燒杯中加入1000mL三蒸水，然 后加入10mL的1質量％的檸檬酸鈉溶液，加熱至沸騰后，再加入10mL的1質量％的氯金酸溶 液，煮沸15min后至冷卻，得到所述的膠體金溶液；
[0118] (2)制備結合墊：取20mL步驟（1)制備的膠體金溶液置于燒杯中，加入150yL 0.1M 的K2C〇3溶液調節溶液的pH至7.6，攪拌均勻，然后加入離心好的抗人IgM抗體，攪拌20min，然 后加入2mL 10質量％的牛血清蛋白溶液，進行離心，離心時間為40Min，轉速為lOOOOrpm，棄 去上清液，再加入1質量％的牛血清蛋白溶液繼續離心，棄去上清液，采用恢復液對沉淀物 進行恢復，將其涂覆在200平方厘米大小的玻璃纖維膜上面，-45 °C冷凍后，作為結合物墊， 在凍干后在室溫下避光保存備用，所述恢復液的成分為150mM的NaCl，l質量％的牛血清蛋 白溶液，〇. 5質量％的蔗糖和0.5質量％的酪蛋白鈉；
[0119] (3)組裝試紙條:將樣品墊、步驟(2)制備的結合物墊、硝酸纖維素膜和吸水墊順次 相互搭接地貼附在聚氯乙烯底板上，相鄰部分重疊1mm，得到組裝試紙條；
[0120] (4)包被硝酸纖維素膜:采用三維平面劃膜儀將變性兔/人IgG、抗人IgG的抗體、肺 炎支原體特異性抗原、流感B型特異性抗原和人IgM依次分別包被在步驟(3)的組裝試紙條 的硝酸纖維素膜上，其中劃膜儀的設定參數為:劃線間隔均為3mm，劃線濃度為0.3mg/mL;
[0121] (5)將步驟(4)處理后的組裝試紙切割為寬度4mm的試紙條。本實施例還可進一步 提供試劑盒，其包括鋁箱袋和密封在所述鋁箱袋中的干燥劑、滴管以及上述制備的試紙條。
[0122] 該試劑盒的制備方法為:將上述制備的試紙條裝在鋁箱袋中，再裝入一個干燥劑 和滴管，進行密封并在室溫下保存。
[0123] 實施例5
[0124] 本實施例用于說明使用實施例4制備的試紙條或試劑盒在RF(IgM型）和肺炎支原 體、流感B型樣本檢測中的應用。
[0125] 所述試紙條的使用方法步驟如下：
[0126] (1)收集血清樣品；
[0127] (2)將試紙條平放在檢測臺面上，向樣品墊滴加 100μΙ步驟（1)的血清樣品，10~15 分鐘后觀察第一檢測線、檢測線和質控線的顯色結果，30分鐘后的顯色結果視為無效；
[0128] (3)結果判斷:根據表3判定結果。
[0129] 采用實施例4制備的測試紙條對臨床已經確診的陽性血清和陰性血清進行檢測， 其中，RF(IgM型）和肺炎支原體IgM抗體陽性樣本與實施案例2中相同，新增加流感Β型特異 性IgM陽性樣本100例和三指標IgM共同陰性樣本150例進行檢測。
[0130] 結果見表5。
[0131] 表5實施例5檢測結果
[0132]
[0133] 試驗例1
[0134] 本試驗例用于說明實施例2制備的試紙條和商購檢測產品的檢測對比試驗。
[0135] 受試樣品為100例臨床已經確診的類風濕因子（IgM型）陽性樣品、100例臨床已經 確診的肺炎支原體陽性樣品以及150例共陰性樣品。
[0136] 實施例2制備的試紙條采用實施例3的方法進行檢測。
[0137] 肺炎支原體IgM抗體檢測試劑盒(酶聯免疫法)和類風濕因子IgM抗體檢測試劑盒 (膠體金法)采用其說明書中使用方法進行檢測。
[0138] 檢測結果見表6。從檢測結果可知，與肺炎支原體IgM抗體檢測試劑盒（酶聯免疫 法)相比，實施例2制備的試紙條對受試樣品具有更高的符合率;而與類風濕因子IgM抗體檢 測試劑盒(膠體金法)相比，實施例2制備的試紙條對類風濕因子的檢測結果穩定且更加準 確。
[0139] 表6
[0140]
[0141] 盡管在此，已對本發明進行了一定程度的描述，明顯地，在不脫離本發明的精神和 范圍的條件下，所屬領域技術人員可進行各個條件的適當變化。可以理解的是，本發明不限 于所述實施方案概括和具體實例，其權利歸于權利要求的范圍，并包括所述每個因素的等 同替換。
【主權項】
1. 一種類風濕因子（IgM型）及其他抗原特異性IgM抗體聯合檢測試紙條，其特征在于， 所述試紙條包括在聚氯乙烯膠板上依次貼附的樣品墊、結合物墊、硝酸纖維素膜和吸水墊， 所述硝酸纖維素膜上依次分別包被有第一檢測線、吸附線、一條或多條檢測線和質控線;所 述第一檢測線為變性兔/人IgG，所述吸附線為抗人IgG的抗體，所述質控線為人IgM，所述檢 測線分別選自以下一種或多種特異性抗原:肺炎支原體特異性抗原、流感B型特異性抗原、 弓形蟲病原體特異性抗原、自身免疫性抗原和過敏原;優選地，所述特異性抗原為培養病原 體經裂解和/或滅活后并經過純化后得到的多表位抗原。2. 根據權利要求1所述的試紙條，其特征在于，所述樣品墊為玻璃纖維膜;和/或所述吸 水墊為吸水紙。3. 根據權利要求1或2所述的試紙條，其特征在于，所述結合物墊為覆有抗人IgM抗體-膠體金結合物的玻璃纖維膜;所述抗人IgM抗體的免疫原優選為人IgM的Fc5y片段;和/或所 述抗人IgM抗體優選為羊抗人IgM的IgG抗體，更優選為所述羊源的IgG抗體的F(ab '）2片段。4. 根據權利要求1至3中任一項所述的試紙條，其特征在于，所述試紙條的寬度為適宜 寬度，優選為3~5mm，更優選為4mm。5. 根據權利要求1至4中任一項所述的試紙條，其特征在于， 所述第一檢測線、吸附線、檢測線和質控線的各相鄰線的間隔為適宜寬度，優選為3~ 8mm，更優選為3mm; 所述樣品墊與結合物墊之間重疊1~2mm，優選為1mm; 所述結合物墊與硝酸纖維素膜之間重疊1~2mm，優選為1mm;和/或 所述硝酸纖維素膜與吸水墊之間重疊1~2mm，優選為1mm。6. 權利要求1至5中任一項所述的試紙條的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括： (1) 采用檸檬酸鈉還原氯金酸法制備膠體金溶液：向燒杯中加入lOOOmL三蒸水，然后加 入10mL的1質量％的檸檬酸鈉溶液，加熱至沸騰后，再加入10mL的1質量％的氯金酸溶液，煮 沸15min后至冷卻，得到所述的膠體金溶液； (2) 制備結合墊：取20mL步驟（1)制備的膠體金溶液置于燒杯中，加入150yL 0.1M的 K2C03溶液調節溶液的pH至7.6，攪拌均勻，然后加入離心好的抗人IgM抗體，攪拌20min，然后 加入2mL 10質量％的牛血清蛋白溶液，進行離心，離心時間為40Min，轉速為lOOOOrpm，棄去 上清液，再加入1質量％的牛血清蛋白溶液繼續離心，棄去上清液，采用恢復液對沉淀物進 行恢復，將其涂覆在200平方厘米大小的玻璃纖維膜上面，-45 °C冷凍后，作為結合物墊，所 述恢復液的成分為150mM的NaCl，1質量％的牛血清蛋白溶液，0.5質量％的蔗糖和0.5質 量％的酷蛋白納； (3) 組裝試紙條:將樣品墊、步驟(2)制備的結合物墊、硝酸纖維素膜和吸水墊順次相互 搭接地貼附在聚氯乙烯底板上，得到組裝試紙條； (4) 包被硝酸纖維素膜:采用劃膜儀將變性兔/人IgG、抗人IgG的抗體、抗原特異性IgM 抗體的抗原和人IgM依次分別包被在步驟(3)的組裝試紙條的硝酸纖維素膜上； 優選地，步驟(2)中所述抗人IgM抗體事先通過以下方法處理:使用胃蛋白酶消化抗人 IgM的IgG抗體，親和純化處理獲得所述抗人IgM抗體。7. 根據權利要求6所述的試紙條的制備方法，其特征在于，步驟(4)中所述變性兔/人 I gG、抗人I gG的抗體、抗原特異性I gM抗體的抗原和人I gM的濃度分別獨立為0.3mg/mL。8. -種類風濕因子（IgM型）及其他抗原特異性IgM抗體聯合檢測試劑盒，其特征在于， 所述試劑盒包括:如權利要求1至5中任一項所述的試紙條或采用權利要求6或7所述的方法 制備的試紙條;優選地，所述試劑盒進一步包括： 鋁箱袋以及密封在所述鋁箱袋中的干燥劑;和/或 滴管。9. 一種類風濕因子（IgM型）及其他抗原特異性IgM抗體的檢測方法，所述檢測方法基于 權利要求1至5中任一項所述的試紙條、采用權利要求6或7所述的方法制備的試紙條或權利 要求8所述的試劑盒，其特征在于，所述檢測方法包括： (1) 將所述試紙條平放在檢測臺面上，向樣品墊滴加1〇〇μ1樣品，所述樣品為全血或血 清，10~15分鐘后觀察第一檢測線、檢測線和質控線的顯色結果，30分鐘后的顯色結果視為 無效； (2) 根據以下標準判斷所述樣品中類風濕因子(IgM型)和其他抗原特異性IgM抗體的情 況： 當第一檢測線、檢測線和質控線均顯示紅色條帶，結果判定為;類風濕因子（IgM型）陽 性和其他抗原特異性IgM抗體陽性， 當第一檢測線未顯示紅色條帶，檢測線和質控線均顯示紅色條帶，結果判定為;類風濕 因子(IgM型）陰性和其他抗原特異性IgM抗體陽性， 當第一檢測線和質控線均顯示紅色條帶，檢測線未顯示紅色條帶，結果判定為;類風濕 因子(IgM型）陽性和其他抗原特異性IgM抗體陰性， 當第一檢測線和檢測線未顯示紅色條帶，質控線顯示紅色條帶，結果判定為;類風濕因 子(IgM型）陰性和其他抗原特異性IgM抗體陰性， 當質控線未顯示紅色條帶，結果判定為;檢測無效。10. 權利要求1至5中任一項所述的試紙條、采用權利要求6或7所述的方法制備的試紙 條或權利要求8所述的試劑盒在制備用于檢測和/或診斷選自以下一種或多種的產品中的 應用： 類風濕免疫疾病，優選地，所述類風濕免疫疾病為類風濕性關節炎； 病原體近期感染，優選地，所述病原體為肺炎支原體和/或B型流感病毒； 優生優育，優選地，所述優生優育為檢測弓形蟲； 和自身免疫系統疾病，優選地，所述自身免疫系統疾病為系統性紅斑狼瘡和/或干燥 癥。
【文檔編號】G01N33/558GK105974111SQ201610576315
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年7月20日
【發明人】蔣興宇, 張曉青
【申請人】國家納米科學中心