一種同時檢測血漿中福沙匹坦和阿瑞匹坦的方法
【專利摘要】本發明公開了一種同時檢測血漿中福沙匹坦和阿瑞匹坦的方法，其特征在于，采用高效液相色譜串聯質譜技術檢測經預處理的校正標樣和經預處理的血漿樣品，利用內標法定量，以福沙匹坦和阿瑞匹坦校正標樣的濃度為X軸，福沙匹坦和阿瑞匹坦與內標的峰面積比值為Y軸，建立標準曲線方程，將血漿樣品中福沙匹坦和阿瑞匹坦與內標峰面積的比值代入標準曲線方程中，計算福沙匹坦和阿瑞匹坦的濃度。本發明方法快速、準確、靈敏度高、特異性強、操作簡便，適合于同時測定血漿中福沙匹坦和阿瑞匹坦的濃度。
【專利說明】
一種同時檢測血漿中福沙匹坦和阿瑞匹坦的方法
技術領域
[0001] 本發明屬于藥物分析技術領域，涉及體內藥物的分析測定方法，具體涉及同時檢 測血漿中福沙匹坦和阿瑞匹坦的方法。
【背景技術】
[0002] 阿瑞匹坦(Aprep i tant) 口服制劑是美國FDA批準的首個P物質/NK-1受體拮抗劑。 在臨床上，阿瑞匹坦與其他止吐藥聯用可以預防抗癌藥及化療藥引起的急性和延遲性惡 心、嘔吐。但是，對于有嚴重嘔吐癥狀的病人來說，連續服用阿瑞匹坦制劑難以實現。福沙匹 坦雙葡甲胺(Fosaprepitant dimeglumine)是阿瑞匹坦(Aprepitant)水溶性的前體藥物， 靜滴后能在體內能迅速轉化為阿瑞匹坦。因此，同時測定體內福沙匹坦和阿瑞匹坦的濃度， 評價這兩個化合物在機體內的藥代動力學過程，對于福沙匹坦制劑的研發、評價其質量有 至關重要的作用。
[0003] 由于福沙匹坦和阿瑞匹坦性質差異大，且福沙匹坦中特殊的磷酸基團結構，目前 測定生物樣品中這兩種化合物的方法為:分別用不同的方法提取分離并測定。
【發明內容】
[0004] 本發明所要解決的技術問題是提供一種同時檢測血漿中福沙匹坦和阿瑞匹坦的 方法。
[0005] 為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下：
[0006] -種同時檢測血漿中福沙匹坦和阿瑞匹坦的方法，采用高效液相色譜串聯質譜技 術檢測經預處理的校正標樣和經預處理的血漿樣品，利用內標法定量，以福沙匹坦和阿瑞 匹坦校正標樣的濃度為X軸，福沙匹坦和阿瑞匹坦與內標的峰面積比值為Y軸，建立標準曲 線方程，將血漿樣品中福沙匹坦和阿瑞匹坦與內標峰面積的比值代入標準曲線方程中，計 算福沙匹坦和阿瑞匹坦的濃度，具體色譜條件為：
[0007] (1)高效液相色譜條件：
[0008] 流動相A: 10mM乙酸銨和0.02g/100mL EDTA水溶液；
[0009] 流動相B:乙腈；
[0010] 色譜柱:Waters XTerra MS C18,2.1X50mm，3.5ym;
[0011] 采用梯度洗脫方式，見表1;
[0012] 柱溫：30°C;
[0013] 進樣量 5yL;
[0014] 表1流動相梯度洗脫參數
[0015]
[0016] 表2福沙匹坦、阿瑞匹坦和內標的質譜參數
[0017]
[0018] (2)質譜條件:采用ESI離子源、正離子MRM模式檢測，離子源參數如下:CAD:4;CUR: 10 ;GS1:60 ;GS2:50; IS: 5000;TEM: 600;主要化合物其他相關參數見表2。
[0019] 其中，所述的血漿為人或動物的血漿。
[0020] 其中，所述的經預處理的血漿樣品按照如下方法制備得到：取血漿樣品100yL，加 入甲醇和稀釋液各l〇yL，加入內標0.999yg · mL-1格列苯脲30yL，加入乙腈300yL，渦旋lmin 混勻，12000rmp 1 Omin，4 °C離心，吸取上清液，即得。
[0021]其中，經預處理的校正標樣按如下方法制備得到：
[0022] 精密稱取10.89mg福沙匹坦雙葡甲胺對照品至10mL容量瓶中，加入稀釋液定容至 刻度，混勻得到〇.666mg · ml/1福沙匹坦標準曲線儲備液;精密量取適量儲備液以稀釋液稀 釋至濃度為l〇〇yg · ml/1福沙匹坦溶液;再以稀釋液依次稀釋，配成濃度分別為0.200yg · mL-1、0 · 400yg · mL-1、1 · 00yg · mL-1、2 · 50yg · mL-1、5 · 00yg · mL-1、20 · Oyg · mL-1 和50 · Oyg · ml/1的福沙匹坦標準曲線工作液，于-20°C冰箱中保存備用；
[0023] 精密稱取12.16mg阿瑞匹坦對照品至10mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，混勻得 到1.216mg · ml/1阿瑞匹坦標準曲線儲備液，于-20°C冰箱中保存備用;精密量取適量儲備液 以甲醇稀釋至濃度為50 . Oyg · ml/1阿瑞匹坦溶液;再以甲醇液依次稀釋，配成濃度分別為 O.lOOyg · mL-^OJOOyg · mL-^OjOOyg · mL-^l.OOyg · mL-ij.SOyg · mL-^lO.Oyg · mL-1 和20.Oyg · ml/1的阿瑞匹坦標準曲線工作液，于-20°C冰箱中保存備用；
[0024] 分別精密吸取10此各濃度的福沙匹坦和阿瑞匹坦標準曲線工作液置于1.5mL EP 管中，向其中分別加入lOOyL空白血漿，渦旋混勻，即得含福沙匹坦和阿瑞匹坦濃度分別為 0.0200yg · mL-1 和0.0100yg · mL-^O.CMOOyg · mL-1 和0.0200yg · mL-\〇· 100yg · mL-1 和 0.0400yg · mL-· mL-1和 O.lOOyg · mL-^O.SOOyg · mL-1 和0.250yg · mL-ij.OOy g · mL-1和 1.00yg · mL-^S.OOyg · mL-1和2.00yg · mL-^lO.Oyg · mL-1和5.00yg · mL-1 的校正 標樣。其中lO.Oyg · mL-1和5.00yg · mL-1的校正標樣是由100yg · mL-1福沙匹坦溶液和50.0μ g · ml/1阿瑞匹坦溶液配制而成。
[0025] 其中，所述的稀釋液按如下方法制備得到:取磷酸二氫銨5.76g，加1000mL水使溶 解，用氨水調節pH值至9.0得磷酸鹽緩沖液，再按照8: 2的體積比將磷酸鹽緩沖液與乙腈混 合，即得稀釋液。
[0026] 有益效果：本發明建立了一種同時測定血漿中福沙匹坦和阿瑞匹坦濃度的方法， 快速、準確、靈敏度高、操作簡便。通過該方法測定人靜脈滴注福沙匹坦雙葡甲胺后血漿中 各時點的福沙匹坦和阿瑞匹坦的濃度，計算藥代動力學參數，評價福沙匹坦和阿瑞匹坦在 人體內的藥代動力學特征，為福沙匹坦雙葡甲胺的藥物研制提供合理的依據。
【附圖說明】
[0027] 圖1為血漿中福沙匹坦和阿瑞匹坦的LC-MS/MS色譜圖其中A為空白血漿;B為校正 標樣最低定量限樣品（福沙匹坦:0.02? · ml/1，阿瑞匹坦:0.01yg · ml^hC為校正標樣BQ-4樣品（福沙匹坦:0.5yg · ml/1，阿瑞匹坦:0.25yg · ml/1);D為實際血漿樣品；其中1代表福 沙匹坦;2代表阿瑞匹坦;3代表內標格列苯脲。
【具體實施方式】
[0028]根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實 施例所描述的內容僅用于說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本 發明。
[0029] 實施例1:人血漿中福沙匹坦和阿瑞匹坦濃度的同時測定。
[0030] 一、實驗材料與儀器
[0031] 材料:福沙匹坦雙葡甲胺對照品：江蘇豪森藥業股份有限公司，批號:RS20140413， 含量：99.8 %。阿瑞匹坦對照品：江蘇豪森藥業股份有限公司，批號：RS20140830，含量： 99.8 %。格列苯脲（內標)對照品：中國藥品生物制品檢定所，批號：100135-200404，供含量 測定用。乙腈:Merck Company，HPLC級。甲醇:Merck Company，HPLC級。氨水：上海久億化學 試劑有限公司，分析純。乙酸銨:ROE Scientific Inc.，HPLC級。EDTA:東京化成工業株式會 社。磷酸二氫銨:成都市科龍化工試劑廠，分析純。水由Millipore Milli-Q Advantage A10 超純水機制備。
[0032] 儀器：API 4000LC-MS/MS 液質聯用儀，含：（l)Pump Agilent 1260G1312A;(2) Column Oven Agilent 1260G1316A；(3)Auto Sampler Agilent 1260G1367E；(4)Mass spectrometer API4000;(5)Value Valeo 2-Position，由Analyst 1.6Software控制。WH-2 微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠）<XPA225D電子天平（德國賽多利斯公司）。 Millipore Drict_Q5純水機(法國Millipore公司）aBiofuge PrimoR冷凍高速離心機(德國 Heraeus公司）。
[0033]二、液質條件 [0034] 1.液相色譜條件
[0035]色譜柱：恥七6^父了〇1抑]\^(：18,2.1\5〇111111，3.54111;保護柱 ：厶81161^201^父58-C18，2.1 X 12.5mm，5μπι;流動相：乙腈:水（10mM乙酸銨和0.02g/100mL EDTA)，梯度洗脫，見 表1;柱溫：30°C;進樣量5yL。
[0036] 2 ·質譜條件
[0037] 采用AB公司API 4000MS/MS質譜儀進行化合物檢測。采用ESI離子源、正離子MRM模 式檢測，離子源參數如下:CAD: 4; CUR: 10; GS1:60; GS2:50; IS: 5000; TEM: 600;主要化合物其 他相關參數見表2。
[0038] 三、實驗過程：
[0039] 1.福沙匹坦和阿瑞匹坦標準溶液的配制：
[0040] 精密稱取10.89mg福沙匹坦雙葡甲胺對照品至10mL容量瓶中，加入稀釋液定容至 刻度，混勻得到〇.666mg · ml/1福沙匹坦標準曲線儲備液;精密量取適量儲備液以稀釋液稀 釋至濃度為l〇〇yg · ml/1福沙匹坦溶液;再以稀釋液依次稀釋，配成濃度分別為0.200yg · mL-1、0 · 400yg · mL-1、1 · OOyg · mL-1、2 · 50yg · mL-1、5 · OOyg · mL-1、20 · Oyg · mL-1 和50 · Oyg · ml/1的福沙匹坦標準曲線工作液，于-20°C冰箱中保存備用。
[0041 ] 精密稱取12.16mg阿瑞匹坦對照品至10mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，混勻得 到1.216mg · ml/1阿瑞匹坦標準曲線儲備液，于-20°C冰箱中保存備用;精密量取適量儲備液 以甲醇稀釋至濃度為50 . Oyg · ml/1阿瑞匹坦溶液;再以甲醇液依次稀釋，配成濃度分別為 O.lOOyg · mL-^OJOOyg · mL-^OjOOyg · mL-^l.OOyg · mL-ij.SOyg · mL-^lO.Oyg · mL-1 和20.Oyg · ml/1的阿瑞匹坦標準曲線工作液，于-20°C冰箱中保存備用。
[0042] 2.福沙匹坦和阿瑞匹坦質控溶液的配制：
[0043] 精密稱取10.37mg福沙匹坦雙葡甲胺對照品至10mL容量瓶中，加入稀釋液定容至 刻度，混勻得到〇.634mg · ml/1福沙匹坦質控儲備液。精密量取適量質控儲備液以稀釋液稀 釋至濃度為80、8和0.5yg · ml/1福沙匹坦溶液，分別得高、中和低濃度的福沙匹坦質控工作 液，于-20 °C冰箱中保存備用。
[0044] 精密稱取10.65mg阿瑞匹坦對照品至10mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，混勻得 至ljl.065mg · ml/1阿瑞匹坦質控儲備液。精密量取適量質控儲備液以甲醇稀釋至濃度為40、2 和0.25yg · ml/1阿瑞匹坦溶液，分別得高、中和低濃度的阿瑞匹坦質控工作液，于-20°C冰箱 中保存備用。
[0045] 3.內標格列苯脲工作液的配制：
[0046] 精確稱取9.99mg格列苯脲對照品至10mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，混勻得到 999yg · ml/1的內標儲備液，于4 °C冰箱中保存備用。以乙腈為溶劑，取lmL儲備液定容于 1 OOOrnL容量瓶中制得內標工作液，于4 °C冰箱中保存備用。
[0047] 4.血漿樣品的采集：
[0048] 2名健康受試者靜脈滴注福沙匹坦雙葡甲胺0.15g，30min滴完，于滴注前及滴注后 5min、10min、15min、30min、40min、lh、1 · 5h、2h、4h、6h、8h、12h、1811、24]1、36]1、48]1、72]1于輸 液對側前臂靜脈取血4mL。米集血樣置EDTA化試管中，3500rpm離心10min，分離血衆于1.5mL 離心管中，-20°C冷凍并轉入_80°C保存備用。
[0049] 5.樣品的前處理和測定：
[0050] (1)空白血漿樣本的處理和測定
[0051] 自-80°C低溫冰箱中取出空白血漿樣品，室溫解凍后，渦旋振蕩30s充分混勻， 12000rpm 4°C超速離心10min。精密吸取離心后血漿中層100yL于1.5mL EP管中，加入甲醇 和稀釋液各10yL，加入乙腈330yL，禍旋lmin混勾，12000rpml0min，4°C離心，吸取上清液5yL 進行LC-MS/MS分析。
[0052] (2)實際血漿樣本的處理和測定
[0053]自_80°C低溫冰箱中取出受試者的含藥血漿樣品，室溫解凍后，渦旋振蕩30s充分 混勻，12000rpm 1 Omin，4°C，超速離心。精密吸取離心后血漿中層100yL于1.5mL EP管中，加 入甲醇和稀釋液各l〇yL，加入內標格列苯脲（0.999yg · mL-^OyL，加入乙腈300yL，渦旋 lmin混勾，12000rmp 10min，4°C離心，吸取上清液5yL進行LC-MS/MS分析。
[0054] (3)血漿校正標樣的制備和測定
[0055] 分別精密吸取10此各濃度的福沙匹坦和阿瑞匹坦標準曲線工作液置于1.5mL EP 管中，向其中分別加入l〇〇yL空白血漿，渦旋混勻，即得含福沙匹坦濃度為0.02、0.04、0.1、 0·25、0·5、2、5和 10yg · mL-1和阿瑞匹坦濃度為0.01、0.02、0.04、0.1、0.25、1、2和5以8·!!!!/ 1 的血漿校正標樣，按"實際血漿樣本的處理和測定"項處理和測定。
[0056] (4)血漿質控樣本的制備和測定
[0057] 分別精密吸取10此各濃度的福沙匹坦和阿瑞匹坦質控工作液置于1.5mL EP管中， 向其中分別加入l〇〇yL空白血漿，渦旋混勻，即得含福沙匹坦濃度為0.05、0.8和8yg · ml/1和 阿瑞匹坦濃度為0.025、0.2和4yg · ml/1的血漿質控樣品，按"實際血漿樣本的處理和測定" 項處理和測定。
[0058] 6.方法驗證
[0059] (^專屬性：
[0060] 取人空白血漿室溫解凍后，渦旋振蕩30s充分混勻，12000rpm 4°C超速離心10min。 精密吸取離心后血漿中層l〇〇yL于1.5mL EP管中，加入甲醇和稀釋液各10yL，加入乙腈330μ L，禍旋lmin混勾，12000rpml0min，4°C離心，吸取上清液5yL進行LC-MS/MS分析。
[0061 ] 結果顯示，在選定的LC-MS/MS條件下（如圖1所示），福沙匹坦、阿瑞匹坦和內標的 保留時間分別為4.6min、5.6min和5. Omin左右，空白血衆無雜質峰影響測定的準確度，本測 定方法可以用于福沙匹坦和阿瑞匹坦血漿濃度的測定。
[0062] (2)最低定量限和線性范圍
[0063] 分別精密吸取10此各濃度的福沙匹坦和阿瑞匹坦標準曲線工作液置于1.5mL EP 管中，向其中分別加入l〇〇yL空白血漿，渦旋混勻，即得含福沙匹坦濃度為0.0200、0.0400、 0.100、0.250、0.500、2.00、5.00和10.(^8*111廠 1和阿瑞匹坦濃度為0.0100、0.0200、0.0400、 0 · 100、0 · 250、1 · 00、2 · 00和5 ·00yg · mL-1的血漿校正標樣，加入內標格列苯脲(0 · 999yg · mL-加入乙腈300yL，禍旋lmin混勾，12000rmp 10min，4°C離心，吸取上清液5yL進行 LC-MS/MS分析。記錄福沙匹坦、阿瑞匹坦和內標峰面積。以福沙匹坦或阿瑞匹坦濃度CSX 軸，以樣品峰面積與內標的峰面積比值f為Y軸進行權重回歸(權重系數為1/C2)，計算HI。 結果顯示，血漿中福沙匹坦濃度在0.0200-10.Oyg · ml/1范圍內、阿瑞匹坦濃度在0.0100-5.00yg · ml/1范圍內，濃度與峰面積的比值具有良好的線性關系，福沙匹坦的r值均在 0.9967~0.9987之間，阿瑞匹坦的r值均在0.9974~0.9991之間。本方法中福沙匹坦和阿瑞 匹坦的LL0Q分別為20ng · mL-1 和 10ng · mL-1。
[0064] (3)準確度和精密度
[0065] 按血漿標準曲線方法制備含福沙匹坦和阿瑞匹坦濃度分別為0.0500、0.800和 8.0(^8，1111/1以及0.0250、0.200和4.0(^8.1111/1的血漿質控樣本，每個濃度制備5個樣本， 并測定3批，每批隨行一條標準曲線。記錄色譜圖及福沙匹坦、阿瑞匹坦和內標峰面積。計算 樣品和內標峰面積的比值f，將f值代入隨行標準曲線求得實測濃度及其準確度。結果如表3 顯示，福沙匹坦低、中、高3個濃度質控樣本實測濃度的批內準確度為90.26%~103.9%、 RSD為2.75%~4.17%，批間準確度為99.83%~102.0%、RSD為3.91 %~7.50%;阿瑞匹坦 低、中、高3個濃度質控樣本實測濃度的批內準確度為89.47%~112.2 %、RSD為1.29 %~ 4.94 %，批間準確度為92.64 %~111.2 %、RSD為1.65 %~5.24%，即方法的批內、批間精密 度和準確度均在可接受范圍內。
[0066] 表3福沙匹坦和阿瑞匹坦在血漿中的精密度和準確度
[0067]
[0068」（4)回收率
[0069] 按"血漿質控樣本的制備和測定"項配制處理并測定福沙匹坦和阿瑞匹坦低、中、 高3種濃度的血漿質控樣本，每個濃度平行3個樣本。記錄福沙匹坦峰面積AS1、阿瑞匹坦峰面 積As2和內標峰面積Ais。
[0070] 按"空白血漿樣本的處理和測定"項處理空白血漿用于配置未經提取含藥血漿樣 品：空白血衆和乙腈按照1:3的比例禍旋lmin混勾，12000rpm 1 Omin，4°C離心，吸取上清液 400yL于1.5mL EP管中，分別精密吸取福沙匹坦和阿瑞匹坦低、中、高質控工作液各10yL，向 其中分別依次加入內標工作液30yL、渦旋混勻，吸取5yL進樣分析。每個濃度平行3個樣本。 記錄福沙匹坦峰面積Asi，、阿瑞匹坦峰面積As2,和內標峰面積Ais，。
[0071] 福沙匹坦和阿瑞匹坦的提取回收率REfAsi/Asr X100%和RE2=AS2/As2' X100%
[0072] 結果顯示：福沙匹坦低、中、高3個濃度血漿質控樣本的平均提取回收率分別為 82.54%、97.85 %和90.13%，阿瑞匹坦低、中、高3個濃度血漿質控樣本的平均提取回收率 分別為93.36%、107.8%和103.8%。結果表明，該方法中福沙匹坦、阿瑞匹坦和內標的提取 回收率精密且可重現。
[0073] 6.測定結果
[0074] 2名健康受試者靜脈滴注福沙匹坦雙葡甲胺0.15g后血漿中福沙匹坦和阿瑞匹坦 的濃度見表4。
[0075] 表4 2名健康受試者靜脈滴注福沙匹坦雙葡甲胺0.15g后血漿中福沙匹坦和阿瑞 匹坦的濃度
[0076]
[0077] N.D 表示低于 LLOQ。
[0078] 四、討論
[0079] 本研究采用蛋白沉淀法提取了血漿中的福沙匹坦和阿瑞匹坦。目前，從生物樣品 中分離阿瑞匹坦和福沙匹坦的方法分別主要為液液提取法(LLE)和固相萃取法(SPE)，但是 由于這兩個化合物極性相差大，以往的方法不能同時將這兩個化合物提取出來。本發明采 用蛋白沉淀法，不僅較LLE和SPE操作更簡單，而且能獲得穩定且較高的提取回收率。同時， 使用高效液相色譜串聯質譜技術同時測定了血漿中福沙匹坦和阿瑞匹坦的濃度，保證了檢 測方法的靈敏度。
[0080] 其次，由于福沙匹坦中特殊的磷酸基團結構，使得福沙匹坦在色譜分離時易與色 譜柱中的基團發生特異性結合而難以洗脫，無法檢測。本發明在流動相中加入EDTA成功解 決了這一問題。同時，采用梯度洗脫的方法，使得兩個極性相差較大的化合物能在較短的分 析時間內同時測定，且峰形良好。
[0081 ]總之，該方法快速、準確、靈敏度高、操作簡便。通過該方法同時測定血漿中福沙匹 坦和阿瑞匹坦的濃度，計算藥代動力學參數，能為福沙匹坦雙葡甲胺的藥物研制提供合理 的藥代動力學依據。
【主權項】
1. 一種同時檢測血漿中福沙匹坦和阿瑞匹坦的方法，其特征在于，采用高效液相色譜 串聯質譜技術檢測經預處理的校正標樣和經預處理的血漿樣品，利用內標法定量，W福沙 匹坦和阿瑞匹坦校正標樣的濃度為X軸，福沙匹坦和阿瑞匹坦與內標的峰面積比值為Y軸， 建立標準曲線方程，將血漿樣品中福沙匹坦和阿瑞匹坦與內標峰面積的比值代入標準曲線 方程中，計算福沙匹坦和阿瑞匹坦的濃度，具體色譜條件為： (1) 高效液相色譜條件： 流動相A: lOmM乙酸錠和0.02g/100血邸TA水溶液； 流動相B:乙臘； 色譜柱：Waters XTerra MS C18,2.1X50mm，3.5皿； 采用梯度洗脫方式，見表1; 柱溫:30 C ; 進樣量扣レ 表1流動相梯度洗脫參數(2) 質譜條件:采用ESI離子源、正離子MRM模式檢測，離子源參數如下：CAD: 4; CUR: 10; GS1:60; GS2:50; IS: 5000; TEM: 600;主要化合物其他相關參數見表2。2. 根據權利要求1所述的同時檢測血漿中福沙匹坦和阿瑞匹坦的方法，其特征在于，所 述的血漿為人或動物的血漿。3. 根據權利要求1所述的同時檢測血漿中福沙匹坦和阿瑞匹坦的方法，其特征在于，所 述的經預處理的血漿樣品按照如下方法制備得到:取血漿樣品l(K)yL，加入甲醇和稀釋液各 lOyL，加入內標0.99化g · mL-i格列苯脈30化，加入乙臘300yL，滿旋Imin混勻，12000rmp 1 Omin，4 °C離屯、，吸取上清液，即得。4. 根據權利要求1所述的同時檢測血漿中福沙匹坦和阿瑞匹坦的方法，其特征在于，經 預處理的校正標樣按如下方法制備得到： 精密稱取10.89mg福沙匹坦雙葡甲胺對照品至10血容量瓶中，加入稀釋液定容至刻度， 混勻得到〇.666mg · ml/i福沙匹坦標準曲線儲備液;精密量取適量儲備液W稀釋液稀釋至濃 度為10化g · ml/i福沙匹坦溶液；再W稀釋液依次稀釋，配成濃度分別為0.20化g · ml/i、 0.400yg · mL-i、1.00yg · mL-i、2.50yg · mL-i、5.00yg · mL-i、20.0yg · mL_i和50.0yg · mL_i的 福沙匹坦標準曲線工作液，于-20°C冰箱中保存備用； 精密稱取12.16mg阿瑞匹坦對照品至1 OmL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，混勻得到 1.216mg · ml/i阿瑞匹坦標準曲線儲備液，于-20°C冰箱中保存備用;精密量取適量儲備液W 甲醇稀釋至濃度為50.Oyg . ml/i阿瑞匹坦溶液；再W甲醇液依次稀釋，配成濃度分別為 O.lOOyg ·血-i、0.200yg · mL-i、0.400yg · mL-i、1.00yg ·血-i、2.50yg · mL-i、10.0yg ·血-1 和20.0yg · m[i的阿瑞匹坦標準曲線工作液，于-20°C冰箱中保存備用； 分別精密吸取10化各濃度的福沙匹坦和阿瑞匹坦標準曲線工作液置于1.5mL EP管中， 向其中分別加入1(Κ)化空白血漿，滿旋混勻，即得含福沙匹坦和阿瑞匹坦濃度分別為0.0200 μ邑· mL_i和O.OlOOyg · mL-i、0.0400yg · mL_i和0.0200yg · mL-i、0.100yg · mL_i和0.0400μ 邑?血-i、0.250yg · mL_i和O.lOOyg · mL-i、0.500yg · mL_i和0.250yg · mL-i、2.00yg · mL_i和 l.OOyg · mL-i、5.00yg · mL-i和2.00yg · mL-i、10.0yg · mL-i和5.00yg · mL-i的校正標樣。5.根據權利要求4所述的同時檢測血漿中福沙匹坦和阿瑞匹坦的方法，其特征在于，所 述的稀釋液按如下方法制備得到：取憐酸二氨錠5.76g，加 lOOOmL水使溶解，用氨水調節pH 值至9.0得憐酸鹽緩沖液，再按照8:2的體積比將憐酸鹽緩沖液與乙臘混合，即得稀釋液。
【文檔編號】G01N30/02GK105974016SQ201610296436
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年5月6日
【發明人】許美娟, 儲繼紅, 吳婷, 居文政, 李長印, 張軍, 劉史佳, 戴國梁
【申請人】江蘇省中醫院