一種蔬果中烯酰嗎啉與赤霉素殘留量測定的方法
【專利摘要】本發明涉及一種蔬果中烯酰嗎啉與赤霉素殘留量測定的方法。本發明蔬果中烯酰嗎啉與赤霉素殘留量的測定方法包括：樣品制備；樣品前處理；有機溶劑提取；固相萃取小柱去除色素雜質，氮氣吹至近干，以流動相溶解殘渣，溶液經濾膜過濾供HPLC分析；標準溶液的配制；高效液相色譜儀測定等過程。本發明的方法，操作簡單，快速，自動化程度高，萃取效率快，回收率和重復性好，可實現蔬果中烯酰嗎啉與赤霉素殘留量的同時測定。
【專利說明】
一種蔬果中烯酰嗎啉與赤霉素殘留量測定的方法
技術領域
[0001] 本發明涉及一種蔬菜、水果中烯酰嗎啉與赤霉素殘留量的測定方法，具體涉及一 種蔬果中2種農藥殘留測定的高效液相色譜方法，屬于農藥殘留的理化檢測技術領域。
【背景技術】
[0002] 近年來，溫室大棚等保護地蔬果種植面積迅速增加，重茬、連作導致農產品中病蟲 害加重，各地在防治蔬果病蟲害中，大量和連續地使用烯酰嗎啉、赤霉素等農藥，使得農產 品中病蟲對化學農藥產生了普遍的抗藥性，菜農只能加大農藥的使用量。由此，農藥使用和 依賴程度呈現出惡性循環狀態，使得農產品中農藥殘留量超標問題日益突出。
[0003] 食用農藥殘留超標的蔬菜與水果，會直接危及人體的神經系統和肝臟、腎臟等重 要器官，殘留農藥在人體內蓄積過一定限度后會導致一些慢性疾病，如癌癥、動脈硬化、心 血管病、胎兒畸形、死胎、早夭、早衰等疾病。農藥殘留不但對人體健康造成極大的危害，同 時也嚴重污染人類生存環境，造成空氣、土壤、河流等污染，并在環境中不斷積累起來，造成 動植物中毒，破壞了生態平衡。
[0004] 烯酰嗎啉是一種肉桂酸衍生物，對藻狀菌的霜霉和疫霉屬真菌有獨特的作用方 式；赤霉素是一種高效能的廣普性植物生長促進物質，有誘導無子果實的形成、提高座果 率、改善果實品質、防止落花落果、促進果實早熟、延遲果樹花期、增加果品貯藏能力和打破 休眠的調控作用。生產中，二者廣泛應用于葡萄、蘋果、西紅柿、馬鈴薯、黃瓜、白菜等作物。
[0005] 目前，國內尚無烯酰嗎啉與赤霉素同時測定的液相色譜分析方法，文獻報道主要 有氣相色譜法、氣-質聯用法、液-質聯用法測定其中一種農藥，還未報道通過高效液相色譜 法同時測定蔬果中的烯酰嗎啉與赤霉素。已報道的國外文獻中，利用氣相色譜-質譜聯用法 (GC/MS)檢測啤酒和干啤酒花中烯酰嗎啉殘留，但尚未用于蔬菜水果。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種操作簡單，快速，自動化程度高， 萃取效率高，回收率和重復性好的，同時測定蔬果中烯酰嗎啉與赤霉素農藥殘留量的方法。
[0007] 為實現上述發明的目的，本發明采取的技術方案如下：一種蔬果中烯酰嗎啉與赤 霉素殘留量測定的方法，包括如下步驟： (1) 樣品制備:將蔬果樣品絞碎、勻漿，冷凍保存，得冷凍樣品； (2) 樣品前處理:稱取10g冷凍樣品，精確到0.01 g，置于50mL離心管中，加入10 mL 80% 甲醇水混勾，禍旋，2 min;振蕩，10 min;4°C，8000 r/min離心，提取上清液;再加入10 mL 80%甲醇水，禍旋，2 min;振蕩，10 min;4°C，8000 r/min離心，提取上清液;合并兩次提取 液，濃縮至4 mL，得濃縮液；用2 m〇VL鹽酸調節上述4 mL濃縮液的pH至2.5,加入15mL乙酸 乙酯，禍旋，2min;振蕩，10min;4°C，8000 r/min離心，提取有機相;再加入15 mL乙酸乙酯， 渦旋，2min;振蕩，lOmin; 4°C，8000 r/min離心，提取有機相;合并兩次有機相提取液;將兩 次有機相提取液在45°C，旋轉、濃縮至近干，加入2. OmL正己烷溶解殘渣，凈化，得待凈化溶 液;將酸性氧化鋁柱依次用5mL的丙酮+正己烷混合液、5mL正己烷預淋洗、條件化，當溶劑液 面到達柱吸附層表面時，立即倒入上述待凈化溶液，用15mL刻度離心管接收洗脫液，用5mL 的丙酮+正己烷混合液沖洗燒杯后，洗脫酸性氧化鋁柱，并重復一次;將盛有10mL洗脫液的 刻度離心管置于氮吹儀上，在水浴溫度50°C條件下，氮氣吹干，用超純水定容至l.OmL，在旋 渦混合器上混勻，經0.45μπι濾膜過濾，供高效液相色譜測定； (3) 標準溶液的配制:混合標準工作液用乙腈稀釋，配制成具有系列梯度濃度的混合標 準工作液，以超純水定容； (4) 高效液相色譜儀測定:將工作液注入配有紫外檢測器的高效液相色譜儀器中，進行 高效液相色譜測定;高效液相色譜測定條件如下:C18柱，150 mmX4.6 mmX5 μπι;流動相： 甲醇+水+乙酸水溶液(ρΗ=4.0);流速：1.0 mL/min;柱溫:40°C ;進樣量:20 yL;紫外吸收波 長:252 nm； (5) 殘留量測定結果的計算：以保留時間對烯酰嗎啉、赤霉素兩種農藥進行定性分析， 以峰面積進行兩種農藥的定量分析，用外標法計算結果。
[0008] 優選的，所述蔬果樣品為西紅柿或西瓜。
[0009] 所述丙酮+正己烷混合液中丙酮和正己烷的體積比為1: 9。
[0010] 步驟(2)所述乙酸乙酯在使用前用超純水飽和。
[0011] 步驟(2)所述酸性氧化鋁柱是以酸性氧化鋁粉末為固相萃取填料的色譜柱，色譜 柱中酸性氧化鋁粉末的加入量為每克樣品加入1克酸性氧化鋁粉末;所述酸性氧化鋁粉末 在使用前，于馬弗爐內400°c下烘干。
[0012] 步驟(3)所述混合標準工作液的系列梯度濃度為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0和5.0 yg/ mL〇
[0013] 優選的，所述步驟(1)冷凍保存溫度為-18°C。
[0014]進一步的，步驟(2)所述加入80%甲醇水的體積為每克樣品加入2.0 mL。
[0015] 本發明的蔬果中烯酰嗎啉與赤霉素殘留量測定方法應用于檢測西瓜、西紅柿中的 農藥殘留量。尤其是用于同時檢測西瓜、西紅柿中烯酰嗎啉與赤霉素殘留量。
[0016] 步驟(3)所述混合標準工作液的系列梯度濃度為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0和5.0 yg/ mL； 所采用的HPLC條件為:色譜柱:C18柱，150 mmX4.6 mmX5 μπι;流動相：甲醇(A)+水(B) +乙酸水溶液(pH=4.0，C);流速：1.0 mL/min;柱溫:40°C ;進樣量：20 yL;紫外吸收波長： 252nm〇
[0017]優選的，所述流動相梯度及時間如表1所示。
[0018] 表1流動相梯度及時間
[0019] 本發明的有益效果是：用本方法檢測蔬果農藥殘留量，處理操作簡單，快速，自動 化程度高，萃取效率高，是一種回收率和重復性好的測定蔬果農藥殘留量的方法;本發明方 法可同時測定蔬果中烯酰嗎啉與赤霉素農藥殘留量。
【附圖說明】
[0020] 圖1:烯酰嗎啉與赤霉素2種農藥的標準液相色譜圖（濃度為0.1 yg/mL)，圖中1-3 依次為烯酰嗎啉I、烯酰嗎啉S、赤霉素。
[0021] 圖2:西瓜樣品空白譜圖。
[0022] 圖3:西瓜樣品加標譜圖（濃度為0.5 yg/mL)。
[0023] 圖4:西紅柿樣品空白譜圖。
[0024]圖5:西紅柿樣品加標譜圖（濃度為0.5 yg/mL)。
【具體實施方式】
[0025] 下面通過實例對本發明做進一步詳細說明，這些實例僅用來說明本發明，并不限 制本發明的范圍。
[0026] 實施例1采用本發明的方法，按如下步驟分別測定5個西瓜與西紅柿樣品中的烯 酰嗎啉與赤霉素殘留量： (1) 樣品制備:將5個西瓜與5個西紅柿分別絞碎勻漿，_18°C條件下冷凍保存，得冷凍樣 品； (2) 樣品前處理:稱取10g冷凍樣品，精確到0.01 g，置于50mL離心管中，加入10 mL 80% 甲醇水混勾，禍旋，2 min;振蕩，10 min;4°C，8000 r/min離心，提取上清液，得提取液80% 甲醇水10 mL;再加入10 mL 80%甲醇水，禍旋，2 min;振蕩，10 min;4°C，8000 r/min離心， 提取上清液，得提取液80%甲醇水10 mL;合并兩次提取液，濃縮至4 mL;用2 mol/L鹽酸調節 上述4 mL濃縮液pH至2.5，加入15mL乙酸乙酯，禍旋，2min;振蕩，lOmin;4°C，8000 r/min離 心，提取有機相;再加入15 mL乙酸乙酯，禍旋，2min;振蕩，10min;4°C，8000 r/min離心，提 取有機相;合并兩次有機相提取液;將兩次有機相提取液30 mL乙酸乙酯在45°C，旋轉、濃縮 至近干，加入2. OmL正己烷溶解殘渣，凈化，得待凈化溶液;將酸性氧化鋁柱依次用5mL的丙 酮+正己烷(體積比為10:90)混合液、5mL正己烷預淋洗、條件化，當溶劑液面到達柱吸附層 表面時，立即倒入上述待凈化溶液，用15mL刻度離心管接收洗脫液，用5mL的丙酮+正己烷 (體積比為10:90)混合液沖洗燒杯后，洗脫酸性氧化鋁柱，并重復一次;將盛有10mL洗脫液 的丙酮+正己烷(體積比為10:90)刻度離心管置于氮吹儀上，在水浴溫度50°C條件下，氮氣 吹干，用超純水定容至l.OmL，在旋渦混合器上混勻，經0.45μπι濾膜過濾，供高效液相色譜測 定； (3) 標準溶液的配制:混合標準工作液用乙腈稀釋，超純水定容； (4) 高效液相色譜測定:配制不同濃度的混合標準工作液，注入配有紫外檢測器的高效 液相色譜中，混合標準工作液的系列梯度濃度為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0和5.0 yg/mL;采用 的HPLC條件如下：色譜柱:C18柱，150 mmX4.6 mmX5 μπι;流動相：甲醇(A)+水(B)+乙酸水 溶液(pH=4.0，C);流速：1.0 mL/min;柱溫:40 °C ;進樣量:20 yL;紫外吸收波長:252nm;流動 相梯度及時間如表1所示； (5) 殘留量測定結果的計算:殘留量測定結果的計算：以保留時間對烯酰嗎啉與赤霉素 兩種農藥進行定性分析，以峰面積進行烯酰嗎啉與赤霉素兩種農藥的定量分析，用外標法 計算結果，結果在1個西瓜樣品、2個西紅柿樣品中檢測到農藥，結果見表2。
[0027]表2菠菜樣品中殘留農藥的含量
重復性和回收率的測定:分別采用陰性西瓜樣品與陰性西紅柿樣品（所述陰性指在樣 品中2種農藥均無檢出）進行測定，以3倍信噪比確定分析物的檢測限，以10倍信噪比確定分 析物的定量限，結合回收率和樣品量，方法的定量檢出限為10-30ug/kg，采用樣品中添加標 準溶液的方法，在同樣的樣品處理下對兩種農藥進行加標回收率實驗，結果見表3。
[0028]表3西瓜中2種農藥進行加標回收率及標準偏差(n=5)
[0029] 表4高效液相色譜儀測定蔬果樣品中2種目標化合物的線性及檢出限(n=5)
[0030] 以上所述的實施例僅僅是對本發明的優選實施方式進行描述，并非是對本發明的 范圍進行限定，在不脫離本發明設計精神的前提下，本領域普通技術人員對本發明的技術 方案做出的各種變形和改進，均應落入本發明權利要求書確定的保護范圍內。
【主權項】
1. 一種蔬果中烯酰嗎啉與赤霉素殘留量測定的方法，其特征在于:包括如下步驟： (1) 樣品制備:將蔬果樣品絞碎、勻漿，冷凍保存，得冷凍樣品； (2) 樣品前處理:稱取10g冷凍樣品，精確到O.Olg，置于50mL離心管中，加入10 mL 80% 甲醇水混勾，禍旋，2 min;振蕩，10 min;4°C，8000 r/min離心，提取上清液;再加入10 mL 80%甲醇水，禍旋，2 min;振蕩，10 min;4°C，8000 r/min離心，提取上清液;合并兩次提取 液，濃縮至4 mL，得濃縮液；用2 m〇VL鹽酸調節上述4 mL濃縮液的pH至2.5,加入15mL乙酸 乙酯，禍旋，2min;振蕩，10min;4°C，8000 r/min離心，提取有機相;再加入15 mL乙酸乙酯， 渦旋，2min;振蕩，lOmin; 4°C，8000 r/min離心，提取有機相;合并兩次有機相提取液;將兩 次有機相提取液在45°C，旋轉、濃縮至近干，加入2. OmL正己烷溶解殘渣，凈化，得待凈化溶 液;將酸性氧化鋁柱依次用5mL的丙酮+正己烷混合液、5mL正己烷預淋洗、條件化，當溶劑液 面到達柱吸附層表面時，立即倒入上述待凈化溶液，用15mL刻度離心管接收洗脫液，用5mL 的丙酮+正己烷混合液沖洗燒杯后，洗脫酸性氧化鋁柱，并重復一次;將盛有10mL洗脫液的 刻度離心管置于氮吹儀上，在水浴溫度50°C條件下，氮氣吹干，用超純水定容至l.OmL，在旋 渦混合器上混勻，經0.45μπι濾膜過濾，供高效液相色譜測定； (3) 標準溶液的配制:混合標準工作液用乙腈稀釋，配制成具有系列梯度濃度的混合標 準工作液，以超純水定容； (4) 高效液相色譜儀測定:將工作液注入配有紫外檢測器的高效液相色譜儀器中，進行 高效液相色譜測定;高效液相色譜測定條件如下:C18柱，150 mmX4.6 mmX5 μπι;流動相： 甲醇+水+乙酸水溶液(ρΗ=4.0);流速：1.0 mL/min;柱溫:40°C ;進樣量:20 yL;紫外吸收波 長:252 nm； (5) 殘留量測定結果的計算：以保留時間對烯酰嗎啉、赤霉素兩種農藥進行定性分析， 以峰面積進行兩種農藥的定量分析，用外標法計算結果。2. 根據權利要求1所述一種蔬果中烯酰嗎啉與赤霉素殘留量測定的方法，其特征在于： 所述蔬果樣品為西紅柿或西瓜。3. 根據權利要求1所述一種蔬果中烯酰嗎啉與赤霉素殘留量測定的方法，其特征在于： 所述丙酮+正己烷混合液中丙酮和正己烷的體積比為10:90。4. 根據權利要求1所述一種蔬果中烯酰嗎啉與赤霉素殘留量測定的方法，其特征在于： 步驟(2 )所述乙酸乙酯在使用前用超純水飽和。5. 根據權利要求1所述一種蔬果中烯酰嗎啉與赤霉素殘留量測定的方法，其特征在于： 步驟(2)所述酸性氧化鋁柱是以酸性氧化鋁粉末為固相萃取填料的色譜柱，色譜柱中酸性 氧化鋁粉末的加入量為每克樣品加入1克酸性氧化鋁粉末;所述酸性氧化鋁粉末在使用前， 于馬弗爐內400°C下烘干。6. 根據權利要求1所述一種蔬果中烯酰嗎啉與赤霉素殘留量測定的方法，其特征在 于:步驟(3)所述混合標準工作液的系列梯度濃度為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0和5.0 yg/mL。7. 根據權利要求1所述一種蔬果中烯酰嗎啉與赤霉素殘留量測定的方法，其特征在于： 所述步驟(1)冷凍保存溫度為_18°C。8. 根據權利要求1所述一種蔬果中烯酰嗎啉與赤霉素殘留量測定的方法，其特征在于： 步驟(2 )所述加入80%甲醇水的體積為每克樣品加入2. OmL。9. 一種蔬果中烯酰嗎啉與赤霉素殘留量測定方法的應用，其特征在于:檢測西瓜、西紅 柿中的農藥殘留量。10.-種蔬果中烯酰嗎啉與赤霉素殘留量測定方法的應用，其特征在于：同時檢測西 瓜、西紅柿中烯酰嗎啉與赤霉素殘留量。
【文檔編號】G01N30/02GK105974015SQ201610295867
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年5月7日
【發明人】郭宏斌, 楊春亮, 王明月, 曾日中, 林玲
【申請人】中國熱帶農業科學院農產品加工研究所