一種檢測多巴胺的電化學發光傳感器及其制備與應用
【專利摘要】本發明提供一種檢測多巴胺的電化學發光傳感器，所述電化學發光傳感器包括電極，所述電極包括基底、復合物層和修飾層，所述基底為導電材料，所述復合物層生長于所述導電基底表面上，由魯米諾和硫酸聯苯胺聚合而成，所述修飾層由修飾于復合物層表面的酪胺氧化酶構成。本發明還提出所述電化學發光傳感器的制備和應用。本發明將具有生物活性的酶用于電化學發光分析，可以有效解決電化學發光方法選擇性差的問題。本發明電化學傳感器的制備和檢測方法簡單，靈敏度高，多巴胺檢測過程中不受尿酸和抗壞血酸等的影響，抗干擾性好。
【專利說明】
一種檢測多巴胺的電化學發光傳感器及其制備與應用
技術領域
[0001]本發明屬于檢測領域，具體涉及一種電化學發光傳感器及其制備和應用。
【背景技術】
[0002]多巴胺是一種天然存在的兒茶酚胺，是哺乳動物體內一種重要的神經傳導遞質，對許多基本生理功能和腦高級功能至關重要。多巴胺對軀體具有非常重要的調節作用，它在體內的濃度水平與帕金森氏綜合癥等神經退行性疾病密切相關。鑒于多巴胺重要的生理功能，準確測定其在體內的含量對于疾病的預防治療變得尤為重要。
[0003]在線測定多巴胺濃度的方法有很多，包括化學發光、電化學法、液相色譜結合質譜、表面等離子體共振和表面增強拉曼等方法，例如專利CN201310479300.84用氧化鋅納米片球/泡沫石墨烯復合材料作為電極材料用于多巴胺檢測。這些手段在測試中存在的一個問題是它們造價較高，測量過程耗時較長，并且有些測試需要對樣品進行預處理以及需要特殊的測試環境。
[0004]電化學發光分析方法作為化學發光與電化學相結合的分析方法，由于其發光反應的空間區域集中在電極表面的附近區域，具有發光反應的控制性強和靈敏度高等優點，因此受到分析工作者的廣泛關注。電化學發光分析具有設備搭建簡單，檢測信號背景噪音低，高靈敏度以及較寬的檢測范圍等優勢，可用來檢測葡萄糖，內酰胺酶和DNA等高分子有機物，如專利CN201510482877.3—種納米復合材料的電化學發光傳感器的制備方法，介紹了一種納米復合材料的電化學發光傳感器的制備方法，將復合材料luminol-AuBSA-ant1-CEA沉積于金的電極表面，得到對抗原CEA具有靶向作用的電化學發光免疫傳感器。專利CN201010271247.9—種電化學發光適配體傳感器檢測赭曲霉毒素A的方法，將納米金粒子修飾到裸金電極表面，再在工作電極表面修飾上單鏈DNA，然后將標記有異魯米諾(ABEI)的適配體修飾到電極表面，加入過氧化氫，檢測電發光信號，以檢測赭曲霉毒素A。專利CN201510594214.03提供了基于甲硫氨酸金納米團簇的電致化學發光傳感器，以甲硫氨酸保護的金納米團簇材料為發光體，過硫酸根離子為共反應劑，將甲硫氨酸保護的金納米團簇修飾在玻碳電極上，進行電化學發光測試，并實現對多巴胺的檢測。該傳感器對對多巴胺檢測的線性范圍為0.1?4ymol/L和4?25ymol/L，檢測限為0.032ymol/L。
[0005]在電化學發光法探測多巴胺濃度的研究中，檢測傳感器的制備尤為重要。由于魯米諾和聚魯米諾具有電化學活性與高效的發光性能，其在電化學發光檢測多巴胺濃度的應用尤為廣泛。但是魯米諾和聚魯米諾的量子產率不高，檢測靈敏度較低。同時在活體環境中高濃度的抗壞血酸和尿酸與多巴胺共存，由于三者的氧化電位很相似，容易對多巴胺的檢測造成干擾。因此研究高靈敏度與高選擇性的電化學發光傳感器將大大推進多巴胺檢測領域的發展。
【發明內容】
[0006]本發明創新性地提出了一種用于多巴胺檢測的電化學發光傳感器，其目的在于克服現有多巴胺檢測方法造價昂貴、耗時長、靈敏度低，選擇性差等缺點。針對以上問題，本發明將魯米諾和硫酸聯苯胺聚合，用硫酸聯苯胺調制魯米諾的光物理性能，以提高其在多巴胺檢測中的量子產率，增強發光強度，從而提高其檢測靈敏度。
[0007]本發明的另一目的是提出所述檢測多巴胺的電化學發光傳感器的制備方法。
[0008]本發明的第三個目的是提出所述電化學發光傳感器的應用。
[0009]實現本發明上述目的的技術方案為:
[00?0] —種檢測多巴胺的電化學發光傳感器，所述電化學發光傳感器包括電極，所述電極包括基底、復合物層和修飾層，所述基底為導電材料，所述復合物層生長于所述導電基底表面上，由魯米諾和硫酸聯苯胺聚合而成，所述修飾層由修飾于復合物層表面的酪胺氧化酶構成。
[0011]由于酪胺氧化酶可以選擇性催化氧化多巴胺，原位生成的H2O2可以顯著增敏魯米諾-硫酸聯苯胺的電化學發光，本發明將酪胺氧化酶固定于復合膜電極表面作為多巴胺的識別元素，將酶催化反應的選擇性和聚(魯米諾-硫酸聯苯胺)電化學發光方法的靈敏性結合在一起，構成快速、靈敏、選擇性高的多巴胺濃度測定的傳感器。
[0012]本發明所述的電化學發光傳感器的制備方法，包括步驟:
[0013]I)在磷酸緩沖鹽溶液中，配置魯米諾和硫酸聯苯胺溶液，采用循環伏安法，在導電基底上制備聚(魯米諾-硫酸聯苯胺)復合物層，
[0014]2)將上述電極取出，干燥，以緩沖溶液配置酪胺氧化酶溶液，用循環伏安法在所述步驟I)得到的聚(魯米諾-硫酸聯苯胺)復合物層表面固定酪胺氧化酶修飾層。
[0015]優選地，所述步驟I)中，磷酸緩沖鹽溶液的pH值為5.5?8.5，循環伏安法制備中，以導電基底為工作電極，鉑片為對電極，飽和甘汞電極為參比電極，所述導電基底為FTO(摻雜氟的SnO2透明導電玻璃)或ITO(氧化銦錫)導電玻璃。
[0016]磷酸緩沖鹽溶液的pH值對聚(魯米諾-硫酸聯苯胺)膜性能影響較小，在本發明所闡述的pH=5.5?8.5范圍內制備均可得到聚(魯米諾-硫酸聯苯胺)膜。
[0017]所述步驟I)中，緩沖鹽溶液中魯米諾的摩爾濃度為I?lOmmol/L，硫酸聯苯胺的摩爾濃度為1.5?15mmol/L。
[0018]更優選地，魯米諾和硫酸聯苯胺的摩爾比例為3:2?2:3。
[0019]其中，所述步驟I)中，在導電基底上制備聚(魯米諾-硫酸聯苯胺)復合物層時，循環伏安掃描的電位范圍為-0.2V?1.0V，掃描圈數30?100圈，掃描速率80?200mV/s。
[0020]其中，所述步驟2)中，所述緩沖溶液為pH為6.5?7.5的磷酸鹽緩沖溶液，在所述緩沖溶液中含有濃度為0.05?2mg/mL的酪胺氧化酶。
[0021]進一步地，所述步驟2)中，循環伏安掃描的電位范圍為-0.2V?0.6V，掃描圈數10?30圈，掃描速率80?150mV/s。
[0022]本發明還提出所述電化學發光傳感器的應用。
[0023]應用本發明提出的電化學發光傳感器檢測多巴胺的方法，將待測溶液的pH值調節為6.8?7.2，在避光條件下，將所述電化學發光傳感器的電極置于待測溶液中，施加方波電位，電位范圍為-0.5?-0.9V(vs.Ag/AgCl)，測量電極的響應信號。
[0024]優選地，方波電位可以選用以0V，-0.5?-0.9V(vs.Ag/AgCl)兩個階梯的電壓為一個循環，循環2?5次。
[0025]其中，用磷酸緩沖鹽或硼砂緩沖溶液調節待測溶液的pH值。
[0026]其中，待測溶液中多巴胺的含量在0.5nmo I /L以上。
[0027]本發明的有益效果在于:
[0028]基于電化學發光測試多巴胺濃度的方法，不同于傳統的使用魯米諾或聚魯米諾作為電化學發光傳感器，本發明選擇將魯米諾和硫酸聯苯胺進行電化學聚合，利用硫酸聯苯胺調制增強魯米諾的光物理性能，并用酪胺氧化酶作為多巴胺的識別物質修飾于上述制備的聚(魯米諾-硫酸聯苯胺)復合膜上，制成用于檢測多巴胺濃度的電化學發光傳感器。
[0029]本發明將具有生物活性的酶用于電化學發光分析，可以有效解決電化學發光方法選擇性差的問題。本發明電化學傳感器的制備和檢測方法簡單，靈敏度高，多巴胺檢測過程中不受尿酸和抗壞血酸等的影響，抗干擾性好。
【附圖說明】
[0030]圖1a為本發明實施例1A)中制備的聚(魯米諾-硫酸聯苯胺)膜的AFM圖片；圖1b為本發明實施例1B)中制備的酪胺氧化酶-聚(魯米諾-硫酸聯苯胺)，即本發明中的電化學發光傳感器的AFM圖片；
[0031]圖2a為本發明實施例1A)中采用循環伏安法制備的聚(魯米諾-硫酸聯苯胺)膜的反應過程曲線；圖2b為本發明實施例1B)中采用循環伏安法在發明實施例1A)中聚(魯米諾-硫酸聯苯胺)膜表面固定酪胺氧化酶的反應過程曲線；
[0032]圖3a為本發明實施例2中電化學發光傳感器檢測不同多巴胺濃度時的電化學發光信號；圖3b為本發明實施例2中傳感器的電化學發光信號強度隨多巴胺濃度的變化及線性擬合情況；
[0033]圖4為本發明實施例3中的抗干擾測試結果，具體為傳感器在不同溶液中的電化學發光信號強度，其中DA為多巴胺，AA為抗壞血酸，UA為尿酸。
[0034]圖5為本發明提出電化學傳感器結構示意圖。圖中，I為導電基底，2為復合物層，3為修飾層。
【具體實施方式】
[0035]現以以下最佳實施例來說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。
[0036]如無特殊說明，實施例中采用的手段均為本領域常用的技術手段。
[0037]實施例1:
[0038]本實施例中，電化學發光傳感器的制備方法包括如下步驟[0039 ] A)聚(魯米諾-硫酸聯苯胺)膜的制備
[0040]配置磷酸緩沖鹽溶液，通過改變0.1mol/L NaH2PO4和0.lmol/L Na2HPO4水溶液的比例調節磷酸緩沖鹽溶液的pH值為5.7。試驗結果表明，溶液pH值對聚(魯米諾-硫酸聯苯胺)膜性能影響較小，在pH = 5.5?8.5范圍內制備均可得到聚(魯米諾-硫酸聯苯胺)膜;將魯米諾和硫酸聯苯胺加入上述磷酸鹽緩沖溶液中配置成反應溶液，具體濃度為8mmol/L魯米諾和12mmol/L硫酸聯苯胺，選擇FTO導電玻璃作基底，以FTO為工作電極，鈾片為對電極，飽和甘汞電極為參比電極，采用循環伏安電化學聚合法將上述魯米諾和硫酸聯苯胺聚合到FTO基底上，循環伏安參數設置為掃描步長100mV/S，掃描范圍-0.2V?1.0V，循環次數40，聚合過程的曲線如圖2a所示。將上述復合膜清洗，干燥，得到聚(魯米諾-硫酸聯苯胺)膜，其AFM圖像如圖1 a所示(圖1的坐標單位為μπι)。
[0041]B)酪胺氧化酶的固定
[0042]配置磷酸緩沖鹽溶液，通過改變0.1mol/L NaH2PO4和0.lmol/L Na2HPO4水溶液的比例調節磷酸緩沖鹽溶液的PH值為7，用所述磷酸緩沖鹽溶液將酪胺氧化酶以0.lmg/mL的比例配成反應液。以步驟A)中制得的生長在FTO表面的聚(魯米諾-硫酸聯苯胺)膜為基底即工作電極，鉑片為對電極，飽和甘汞電極為參比電極，采用循環伏安法將上述酪胺氧化酶固定在基底上，具體循環伏安參數設置為掃描步長100mV/S，掃描范圍-0.2V?0.6V，循環次數20，反應曲線如圖2b所示。將樣品清洗，干燥，得到復合物膜，即電化學發光傳感器，其AFM圖像如圖1b所示。
[0043]制得的電極結構如圖5，導電基底I為FTO導電玻璃，復合物層2是由魯米諾和硫酸聯苯胺聚合而成，修飾層3由修飾于復合物層表面的酪胺氧化酶構成。
[0044]實施例2
[0045]實施例1制得的電化學發光傳感器用于檢測多巴胺濃度的方法包括如下步驟:
[0046]測試在室溫條件下進行，測試前，配置磷酸緩沖鹽溶液，通過改變0.lmol/LNaH2PO4和0.lmol/L Na2HPO4水溶液的比例調節磷酸緩沖鹽溶液的pH值為7，在所述磷酸緩沖鹽溶液中加入多巴胺使其分別濃度為0.51111101/1，11111101/1，101111101/1和201111101/1，以實施例I中制備的電化學發光傳感器為工作電極，鉑絲為對電極，Ag/AgCl (飽和KCl)為參比電極，將上述體系置于微弱發光儀的暗箱中，對以上體系施加如下方波電位:(13s，0V)和(4s，-0.85V)(Vs.Ag/AgCl)，兩個方波為一個循環，工作四個循環。測試過程中首先對
0.1mol/L，pH = 7的磷酸緩沖鹽溶液進行測試，以得到空白信號，然后將上述磷酸緩沖鹽溶液換成上述四種濃度的多巴胺溶液，對以上體系進行光電化學發光測試，得到樣品信號，最終得到傳感器的電化學發光強度為樣品信號減去空白信號。圖3a所示為所述電化學發光傳感器對不同濃度的多巴胺響應信號，隨著多巴胺濃度的增加，發光信號也隨之增強，該傳感器對多巴胺的檢測限達到了0.5nmol/L。將多巴胺濃度與電化學發光信號作圖，并進行線性擬合(圖3b，相關系數R = 0.9991)，圖3的縱坐標為測試過程中電化學發光強度，在lnmol/L?20nmol/L范圍內傳感器的發光強度與多巴胺濃度呈現很好的線性關系。
[0047]實施例3
[0048]本發明提出的電化學發光傳感器用于檢測多巴胺在高濃度尿酸和抗壞血酸存在條件下的選擇性測試如下:
[0049]測試在室溫條件下進行，測試前，配置磷酸緩沖鹽溶液，通過改變0.lmol/LNaH2PO4和0.lmol/L Na2HPO4水溶液的比例調節磷酸緩沖鹽溶液的pH值為7，在溶液中加入lnmol/L多巴胺，100nmol/L尿酸和100nmol/L抗壞血酸配成干擾性測試溶液，以實施例1中制備的電化學發光傳感器為工作電極，鉑絲為對電極，Ag/AgCl (飽和KCl)為參比電極，將上述體系置于微弱發光儀的暗箱中，對其施加如下方波電位:(13s，0V)和(4s，-0.85V)(vs.Ag/AgCl)，測試四個循環。首先我們對0.1mol/L，pH=7的磷酸緩沖鹽溶液進行測試，以得到空白信號，然后將上述磷酸緩沖鹽溶液換成之前配置的干擾性測試溶液，對上述體系進行測試，得到樣品信號，最終得到的傳感器的電化學發光強度為樣品信號減去空白信號。
[0050]圖4反映了干擾性測試結果，發現，在100倍于多巴胺濃度的條件下，尿酸和抗壞血酸的電化學發光信號遠遠低于多巴胺，兩種干擾性物質可以忽略，由此得出所制備的電化學發光傳感器對多巴胺檢測具有很好的選擇性。
[0051]以上的實施例僅僅是對本發明的優選實施方式進行描述，并非對本發明的范圍進行限定，在不脫離本發明設計精神的前提下，本領域普通工程技術人員對本發明的技術方案作出的各種變型和改進，均應落入本發明的權利要求書確定的保護范圍內。
【主權項】
1.一種檢測多巴胺的電化學發光傳感器，所述電化學發光傳感器包括電極，所述電極包括基底、復合物層和修飾層，其特征在于，所述基底為導電材料，所述復合物層生長于所述導電基底表面上，由魯米諾和硫酸聯苯胺聚合而成，所述修飾層由修飾于復合物層表面的酪胺氧化酶構成。2.權利要求1所述的電化學發光傳感器的制備方法，其特征在于，包括步驟: 1)在磷酸緩沖鹽溶液中，配置魯米諾和硫酸聯苯胺溶液，采用循環伏安法，在導電基底上制備聚(魯米諾-硫酸聯苯胺)復合物層， 2)將上述電極取出，干燥，以緩沖溶液配置酪胺氧化酶溶液，用循環伏安法在所述步驟I)得到的聚(魯米諾-硫酸聯苯胺)復合物層表面固定酪胺氧化酶修飾層。3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述步驟I)中，磷酸緩沖鹽溶液的pH值為5.5?8.5，循環伏安法制備中，以導電基底為工作電極，鉑片為對電極，飽和甘汞電極為參比電極，所述導電基底為FTO或ITO導電玻璃。4.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述步驟I)中，緩沖鹽溶液中魯米諾的摩爾濃度為I?10mmol/L，硫酸聯苯胺的摩爾濃度為1.5?15mmol/L。5.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述步驟I)中，在導電基底上制備聚(魯米諾-硫酸聯苯胺)復合物層時，循環伏安掃描的電位范圍為-0.2V?1.0V，掃描圈數30?100圈，掃描速率80?200mV/s。6.根據權利要求2?5任一所述的制備方法，其特征在于，所述步驟2)中，所述緩沖溶液為pH為6.5?7.5的磷酸鹽緩沖溶液，在所述緩沖溶液中含有濃度為0.05?2mg/mL的酪胺氧化酶。7.根據權利要求2?5任一所述的制備方法，其特征在于，所述步驟2)中，循環伏安掃描的電位范圍為-0.2V?0.6V，掃描圈數10?30圈，掃描速率80?150mV/s。8.應用權利要求1所述電化學發光傳感器檢測多巴胺的方法，其特征在于，將待測溶液的PH值調節為6.8?7.2，在避光條件下，將所述電化學發光傳感器的電極置于待測溶液中，施加方波電位，電位范圍為-0.5?-0.9V(vs.Ag/AgCl)，測量電極的響應信號。9.根據權利要求8所述電化學發光傳感器檢測多巴胺的方法，其特征在于，用磷酸緩沖鹽或硼砂緩沖溶液調節待測溶液的PH值。10.根據權利要求8或9所述電化學發光傳感器檢測多巴胺的方法，其特征在于，待測溶液中多巴胺的含量在0.5nmol/L以上。
【文檔編號】G01N21/76GK105973876SQ201610286963
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年5月3日
【發明人】賀濤, 王艷杰, 張雪華, 張鑫
【申請人】國家納米科學中心