一種藥物微毒測試體系（Microtox assay）的質量控制方法
【專利摘要】本發明一種藥物微毒測試體系(Microtox assay)的質控方法，包括如下步驟：(1)參照品溶液的制備：取ZnSO4·7H2O，溶解，制備濃度分別為5.0mg·L?1、20.0mg·L?1、40.0mg·L?1、80.0mg·L?1及100.0mg·L?1等的ZnSO4·7H2O溶液，再分別與20％氯化鈉溶液以17:3的體積比混合，得系列溶液，作為標準曲線各點測定溶液；(2)測試用菌液的制備：取費氏弧菌，復蘇，得測試用菌液，測定發光強度；(3)檢測：取步驟(1)的參照品溶液，加入測試用菌液中，分別測定發光強度，繪制標準曲線，并在檢測過程中隨行質控樣品溶液，即可。本發明方法建立的藥物微毒測試體系的質控方法的靈敏度高、精密度及準確度高、穩定性好，可以用于藥物毒性的檢測，應用前景良好。
【專利說明】
一種藥物微毒測試體系(Microtox assay)的質量控制方法
技術領域
[0001 ]本發明涉及一種藥物微毒測試體系的質量控制方法。
【背景技術】
[0002] 藥物的毒性是影響藥物安全性最主要的因素，因此，檢測藥物的毒性非常重要。
[0003] 發光細菌藥物微毒急性毒性測試體系具有反應快、檢測靈敏、操作簡便、成本較低 等優點，已經被應用于藥物，尤其是中藥注射劑毒性的快速測試。但是，由于沒有質量控制 參照體系，其檢測準確度不高。
[0004] 目前，有文獻報道采用氯化汞、硫酸鋅作為毒性參照品進行檢測的，但是未建立一 套完整的體系，導致檢測的準確性還是難以保證。
【發明內容】
[0005] 為了解決上述問題，本發明提供了 一種藥物微毒測試體系的質量控制方法。
[0006] 本發明藥物微毒測試體系的質控方法的建立方法，包括如下步驟：
[0007] (1)參照品溶液的制備：取ZnS〇4 · 7H20,溶解，制備濃度分別為5.0mg · L一\ 20.0mg · L-\40.0mg · L-\80.0mg · L-1 及lOO.Omg · L-1 等的ZnS〇4 · 7H2〇溶液，再分別與 20%氯化鈉溶以17:3的體積比混合，得系列溶液，作為標準曲線各點測定溶液；
[0008] (2)測試用菌液的制備:取費氏弧菌，復蘇，得測試用菌液，測定發光強度；
[0009] (3)檢測：取步驟（1)的參照品溶液，加入測試用菌液中，分別測定發光強度，繪制 標準曲線，即可。
[0010] 優選地，步驟⑴中，另制備濃度分別為15.0mg · L-\50.0mg · L-1及90.0mg · L-1的 ZnS04 · 7H20溶液，再分別與20%氯化鈉溶液以17:3的體積比混合，得系列溶液，作為質控樣 品溶液;步驟(3)中，隨行質控樣品溶液。
[0011] 隨行質控樣品溶液:是指樣品檢測同時的質控樣品溶液。
[0012] 步驟(2)中，所述復蘇的方法是:取費氏弧菌凍干粉，加入濃度為3%氯化鈉溶液， 混勻，即可。
[0013] 優選地，復蘇的方法是：取費氏弧菌凍干粉，在15 °C放置15min，加入氯化鈉溶液 后，混勾l〇min。
[0014] 進一步優選地，每1支CS234的費氏弧菌凍干粉，加入1.0ml的氯離子濃度為3 %的 溶液，即得測試用菌液。
[0015] 步驟(3)中，100μ1測試用菌液中加入lml參照品溶液。
[0016] 步驟(3)中，在菌液中加入參照品溶液后，混勻，放置10min后測定發光強度。
[0017] 本發明還提供了一種檢測藥物毒性的檢測方法，步驟如下：
[0018] a、按照前述的方法制備測試用菌液、制作標準曲線及質控樣品；
[0019] b、在測試用菌液中加入待檢藥物前測試菌液的初始發光強度，在測試用菌液中加 入待檢藥物后1 〇min測定反應后發光強度，根據初始發光強度、反應后發光強度和標準曲線 確定待檢藥物的毒性即可。
[0020]步驟b中，隨行參照品的質控樣品。
[0021 ]本發明方法建立的藥物微毒測試的質控體系的靈敏度高、精密度及準確度高、穩 定性好，可以用于藥物毒性的檢測，應用前景良好。
[0022] 顯然，根據本發明的上述內容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離 本發明上述基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0023] 以下通過實施例形式的【具體實施方式】，對本發明的上述內容再作進一步的詳細說 明。但不應將此理解為本發明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發明上述內容 所實現的技術均屬于本發明的范圍。
【附圖說明】
[0024] 圖1 ZnS〇4 · 7H20標準毒物標準曲線
【具體實施方式】
[0025] 實驗材料：
[0026] 1、菌種費氏弧菌(Vibrio fischeri，V.f. )CS234凍干粉，編號D15G046、D15G037、 0156038、0156039、0156056、0156033，北京濱松光子技術股份有限公司，-20°(：避光凍存。
[0027] 2、試劑復蘇稀釋液(3%氯化鈉溶液），批號20150717,北京濱松光子技術股份有 限公司。滲透壓調節液（20%氯化鈉溶液），批號20150717,北京濱松光子技術股份有限公 司。七水硫酸鋅(ZnS〇4 · 7H20)，AR，批號2015030101，成都市科龍化工試劑廠。
[0028] 3、儀器LUMIStox 300型生物毒性測試儀、LUMIS-therm型預溫槽和測試管 (Dr. Bruno Lange GmbH公司）；ME203/02型電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公 司）；KCL-2000型恒溫恒濕箱（東京理化器械株式會社）；Z-2000型原子吸收分光光度計（日 立公司）；鋅空心陰極燈(北京有色金屬研究院）；Integral 5型純水儀(法國Milli-Q公司）。
[0029] 實施例1本發明藥物微毒測試的質控方法的建立
[0030] 1、質控體系建立方法
[0031] 精密稱取ZnS〇4 · 7H20 50.0mg置于500ml容量瓶中，超純水充分溶解、定容，即得 lOO.Omg · I/1儲備液。取儲備液用超純水稀釋，得濃度分別為5.0mg · I/^O.Omg · I/1、 40.Omg · L-1及80.Omg · L-1系列溶液，再將各濃度標準毒物與滲透壓調節液以17:3混合，作 為參照品溶液，用于繪制標準曲線；
[0032]另外，可以制備濃度分別為 15.0mg · L-\50.0mg · L-1 及90.0mg · L-1 的ZnS〇4 · 7H20 溶液，再分別與20%氯化鈉溶液以17:3的體積比混合，得系列溶液，作為質控樣品溶液； [0033] 費氏弧菌CS234凍干粉于恒溫箱15°C中平衡15min，加入復蘇液lml后混勻10min， 取?οομL菌液測試初始發光強度后立即加入lml參照品溶液，反應10min后再次測試對照管 及樣品管發光強度，根據發光強度繪制標準曲線。
[0034] 在前述質控體系建立的基礎上，可以進行藥物毒性檢測，具體是在測試用菌液中 加入待檢藥物，測定發光強度，根據發光強度和標準曲線確定待檢藥物的毒性，可隨行參照 品的質控樣品。
[0035] 實施例2本發明藥物微毒測試的質控方法的篩選
[0036] 1、實驗方法
[0037] 用Plackett-Burman法將反應條件中的6個因子進行全面考察。選擇11因子2水平 的實驗設計，共進行12次實驗，以B、D、F、H、K為空項估計試驗誤差，A、C、E、G、J、L分別代表平 衡時間、復蘇液體積、復蘇時間、菌液體積、樣品體積和反應時間，每個因素取高低兩水平， 以各測試組方差P值及發光系數的均值偏差D值為判斷標準選擇最佳組合。使用到發光菌的 所有操作均在15°C ± 1°C條件下完成。
[0038] 表lPlackett-Burman實驗設計因子與水平
[0039]
[0040] ISO 11348-3:2007的標準選擇D<3%者為合格組合。
[0041 ] 2、實驗結果
[0042] 結果如下表2所示：
[0043]表 2Plackett_Burman 實驗設計及結果(n = 2)
[0044]
[0045] 由實驗結果可以看出，費氏弧菌CS234凍干粉于恒溫箱中平衡15min，加入復蘇液 lml后混勻lOmin，取100μΙ菌液測試初始發光強度后立即加入lml復蘇液(對照）或待測樣 品，反應lOmin后再次測試對照管及樣品管發光強度。
[0046] 以下用實驗例的方式來說明本發明的有益效果：
[0047] 1、實驗方法
[0048] 1.1線性范圍、靈敏度、精密度及準確度檢測：
[0049] 精密稱取ZnS〇4 · 7H2〇 50.0mg置于500ml容量瓶中，超純水充分溶解、定容，即得 lOO.Omg · I/1儲備液。取儲備液用超純水稀釋，得濃度分別為5.0mg · I/^O.Omg · L一\ 40.Omg · Γ1及80.Omg · I/1系列溶液，再將各濃度標準毒物與滲透壓調節液以17:3混合，作 為標準曲線的各點，按照實施例2所優化的條件進行測試，ZnS0 4 · 7H20標準曲線各點的反應 終濃度為3.86mg · · L-1 和77.27mg · L-1。以式 1-4 計算抑制率Ht(%)和均值偏差D，并以抑制率均值Ht(%)-ZnS〇4 · 7H2〇(mg · Γ1)作圖，擬合 得到標準曲線方程及相關系數R2;靈敏度用定量下限即3.86mg · 1^(終濃度)標準毒物的精 密度和準確度表示。另取ZnS04 · 7H20儲備液用超純水配制15.0mg · L-\50.0mg · L-1及 90.Omg · Γ1溶液，再將各濃度標準毒物與滲透壓調節液以17:3混合，作為質控樣品，反應終 濃度分別為11.59mg · L'38.64mg · I/1和69.55mg · I/1，用以考察方法學的精密度(批間、 批內）和準確度，精密度以相對標準差RSD%表示，準確度以測得值與實際值的百分比表示。
[0050]
[0051]
[0052]
[0053]
[0054]注:式（1)中10為對照管發光菌初始發光強度，Ikt為對照管發光菌與復蘇稀釋液 接觸一定時間后的發光強度，fkt為發$系數。式(2)中D為發光系數的均值偏差，fkt為2個 平行管fkt的平均值。式(3)中let為樣品管發光菌初始發光強度的校正值，Ic為樣品管發光 菌初始發光強度。式(4)中It為樣品管發光菌與樣品接觸一定時間后的發光強度，Ht為樣品 對發光強度的抑制率（％)。
[0055] 1.2穩定性取ZnS〇4 · 7H20儲備液及 15.0mg · L-\50.0mg · L-\90.0mg · L-1 質控樣 品進行Zn2+穩定性考察。由于原子吸收分光光度計測量Zn2+的線性范圍在0.2ppm-0.9ppm， 故將儲備液稀釋到 〇.538ppm(以 Zn2+計）后考察 0h、2h、4h、6h、8h、24h、48h、72h&120l·^^!^ 性，質控樣品分別稀釋到〇· 137口口111、0.457。。111、0.822。。1]1考察011、211、411、611及811的穩定性，并 以相應濃度的滲透壓調節液作為對照，需過夜樣品密封后置在4°C冰箱內保存。
[0056] 1.3數據分析
[0057] Design Expert 8 · 0 · 5b軟件進行Plackett-Burman實驗設計及數據分析。PEMS3 · 1 軟件進行標準曲線的擬合及IC5Q的計算。
[0058] 2、實驗結果
[0059] 2.1線性范圍、靈敏度、精密度及準確度
[0060] 由表4及圖1可見，測試三次，定量下限樣品及質控樣品精密度均<10%，準確度在 87.81%-101.43%范圍內。21^〇4.7!12〇溶液在3.8611^.1/ 1-77.2711^.1/1范圍內標準曲線 方程為y = 21 · 78Ln(X)-15 · 14，R2 = 0 · 998，本方法下ZnS〇4 · 7H20對費氏弧菌CS234的IC5〇為 19.90mg · L-、
[00611表4ZnS04 · 7H20質控樣品精密度、準確度及定量下限靈敏度考察結果(n = 2)
[0062]
[0063] 3.4穩定性
[0064]由表5可見，ZnS〇4 · 7H2〇儲備液及其質控樣品分別連續考察120h和8h，其RSD%均 <2%，提示在室溫及4°C保存條件下穩定性良好。
[0065] 表5ZnS04 · 7H20儲備液及質控樣品穩定性考察結果(n = 3)
[0066]
[0067]綜上，本發明藥物微毒測試的質控方法的靈敏度高、精密度及準確度高、穩定性 好，可以用于藥物毒性的檢測，應用前景良好。
【主權項】
1. 一種藥物微毒測試體系(Microtox assay)的質控方法，其特征在于:包括如下步驟： (1) 參照品溶液的制備：取ZnS〇4 · 7H20,溶解，制備濃度分別為5.0mg · L-\20.0mg · L · L-\80.0mg · L-1及lOO.Omg · L-1 等的ZnS〇4 · 7H20溶液，再分別與20%氯化鈉溶 液以17:3的體積比混合，得系列溶液，作為標準曲線各點測定溶液； (2) 測試用菌液的制備:取費氏弧菌，復蘇，得測試用菌液，測定初始發光強度； (3) 檢測：取步驟（1)的參照品溶液，加入測試用菌液中，分別測定發光強度，繪制標準 曲線即可。2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟（1)中，另制備濃度分別為15.Omg· L -\50.0mg · L-1及90.0mg · L-1的ZnS〇4 · 7H20溶液，再分別與20%氯化鈉溶液以17:3的體積 比混合，得系列溶液，作為質控樣品溶液； 步驟(3)中，隨行質控樣品溶液。3. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟(2)中，所述復蘇的方法是：取費氏弧 菌凍干粉，加入濃度為3 %氯化鈉溶液，混勻，即可。4. 根據權利要求3所述的方法，其特征在于:復蘇的方法是:取費氏弧菌凍干粉，在15°C 放置15min，加入3 %氯化鈉溶液后，混勾1 Omin。5. 根據權利要求4所述的方法其特征在于:每1支CS234的費氏弧菌凍干粉，加入1.0ml 的氯離子濃度為3%的溶液，即得測試用菌液。6. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟⑶中，lOOyl測試用菌液中加入lml參 照品溶液。7. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟(3)中，在菌液中加入參照品溶液后， 混勾，放置lOmin后測定發光強度。8. -種檢測藥物毒性的檢測方法，其特征在于:步驟如下： a、 按照權利要求1~7任意一項所述的方法制備測試用菌液、制作標準曲線； b、 在測試用菌液中加入待檢藥物前測試菌液的初始發光強度，在測試用菌液中加入待 檢藥物后lOmin測定反應后發光強度，根據初始發光強度、反應后發光強度和標準曲線確定 待檢藥物的毒性，即可。9. 根據權利要求8所述的方法，其特征在于:步驟b中，隨行參照品的質控樣品。
【文檔編號】G01N21/76GK105973875SQ201610271016
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年4月27日
【發明人】趙軍寧, 熊靜悅, 鄢良春, 華樺
【申請人】四川省中醫藥科學院