體外診斷結腸直腸癌的白細胞彈性蛋白酶抑制劑測定方法

體外診斷結腸直腸癌的白細胞彈性蛋白酶抑制劑測定方法
【專利摘要】本發明涉及通過確定得自疑似患有結腸直腸癌的患者的生物學樣品中白細胞彈性蛋白酶抑制劑腫瘤標記物的存在而體外診斷結腸直腸癌的方法。所述方法可用于結腸直腸癌的早期診斷、篩選、治療隨診以及預后，以及用于結腸直腸癌的復發診斷。
【專利說明】體外診斷結腸直腸癌的白細胞彈性蛋白酶抑制劑測定方法
[0001 ] 本申請是申請日為2008年7月10日的第200880025227.4號發明名稱為"體外診斷 結腸直腸癌的白細胞彈性蛋白酶抑制劑測定方法"的中國專利申請的分案申請。
[0002] 本發明設及癌學領域。更特別地，本發明提供了通過確定取自患者的生物學樣品 中白細胞彈性蛋白酶抑制劑化EI)的存在而體外診斷人類患者中的結腸直腸癌的方法，所 述方法可用于早期診斷、篩選、治療隨診W及預后，還可用于結腸直腸癌的復發診斷。
[0003] 結腸直腸癌（CRC)是主要的公共健康問題。據估計1996年其在世界范圍的新發病 例為875 000例1。考慮到男女性別，其是最常在西方國家發生的癌癥，其通常被分類為癌癥 所致死亡的前3個主要因素之一。考慮到所有階段，5年存活率在60%范圍內。
[0004] 只有早期診斷才能賦予治愈性治療的希望。然而，目前還沒有血清學篩選檢驗，也 沒有早期特異性診斷檢驗方法。
[0005] 目前在歐洲使用兩種不同方法篩選結腸直腸癌：首先，使用臨床異常性 (paraclinical)檢驗，其包括檢查糞便中是否存在血（Faecal Occult Blood Test-FOBT, 例如WHemocciiitK名稱銷售）。已經證實運個技術的臨床實用性。當每2年對在50-74歲之 間的個體使用該技術時，可W使結腸直腸癌導致的死亡率降低15-20%2。為此，一半W上的 人群必須定期參與篩選，且必須對陽性檢驗事件進行結腸鏡檢查，任選隨后進行適當治療。
[0006] 然而，運種篩選技術具有如下一些不利之處：
[0007] ?運個檢驗的主要缺點是其特別是對于腺瘤(癌前異常增生(dysplastic)病變） 的靈敏性較差，如果腺瘤較大，將導致1/10的病例發展為癌癥。
[0008] .運個檢驗也不是非常特異性的。糞便中出現血可W與非腫瘤病變相關:潰瘍性 結腸炎、持瘡、肛擾等。在運種情況中，必須進行結腸鏡檢查，結腸鏡檢查的缺點在后文描 述。
[0009] ?最后，檢驗難W解釋；因此其必須在專業中必由有資格的能勝任 的人員i全釋。
[0010]也已經描述了特異于人血紅蛋白的免疫學檢驗巧日。日;614'*'，胎111巧616(；1*等）。與 Hemoccult'"'相比，它們大概有進步，但是基本上還存在相同問題。因此，由Enterix公司銷 售的Insure?使得可W檢測87 %患有CRC的患者，W及47 %具有癌前息肉的患者。運是一種 檢測糞便中人血紅蛋白、特別是檢測運個分子中的珠蛋白部分的檢驗方法。
[0011] 第二種篩選方法是在50歲W后對人系統進行結腸鏡檢查，運樣在理論上可W降低 由于結腸直腸癌所致死亡率。然而，對于使用內窺鏡進行篩選的政策，健康個體對運種檢查 的可接受性太低而不能降低死亡率（已經建立運個篩選計劃的歐洲國家結腸鏡檢查的順從 水平是大約2%)。結腸鏡檢查存在并非不顯著的結腸穿孔和出血（0.1%)及死亡（1/10 000)的風險，而且對于公共衛生事業也是非常昂貴的。此外，結腸鏡檢查需要非常嚴格的預 先結腸準備，運在很大程度上解釋了順從性不佳的原因。
[0012] 長久W來已經描述了可W通過免疫測定化驗結腸直腸癌的腫瘤標記物。所述腫瘤 標記物特別是癌胚抗原(CEA)和CA19-9。
[0013] CEA用于隨診。由于其靈敏性和特異性不足而不可用于篩選或者早期診斷結腸直 腸癌。運是因為該標記物由其它類型癌癥及在良性病變中表達。無論如何，通過組合CEA與 另一種腫瘤標記物如CA19-9或CA72-4可W增加靈敏性而不喪失其特異性。
[0014] CA19-9的生理學改變的原因很罕見，但是其它良性病變(肝膽病癥、膜腺病癥)或 者惡性病癥可W導致CA19-9增高。因此，單獨運個標記物對于診斷也無意義。然而，由于其 血清濃度與腫瘤的大小和存在轉移瘤相關，因此其也可W用于治療隨診或者早期證實復 發。
[0015] 另外，已經提議可商購的檢驗，如：
[0016] > Colo打ath'VColorec'tAlenM。，由Ambrilia銷售，其是一種快速且相對非侵入 性CRC的篩選檢驗。Colopath^"松測患有結腸直腸病變個體的直腸粘液中的縮醒憐脂(是憐 脂的一部分的復合脂質），而ColorectAlert?檢測直腸粘液中的一種復合糖，即T-抗原。 Coloparh"/Colorec1;Aierl;MD檢驗包括將直腸粘液涂于檢驗條帶上，陽性或陰性結果基于 ScMf f 反應。Ambri 1 ia 已經研究了 1787個個體，證實 Colopath VCoIorect A IerfMD 檢測出 54%的早期結腸直腸癌病例和49 %所有階段組合病例。
[0017] >COLARIS^Myriad Genetics銷售，是在血液中檢測MLHl和MSH2基因突變W篩 選遺傳性非息肉性結腸癌化NPCC綜合征）。該檢驗的結果在3周內獲得。Myriad使用目前可 利用的最靈敏和最特異性的測序技術。該檢驗成本昂貴。
[0018] >簽運迎壁，由AMDL銷售，是一種篩選各種類型癌癥(肺癌、結腸癌、乳腺癌、肝癌、 胃癌等）的檢驗。因此其對于CRC不具有特異性。該檢驗的原理是基于雙夾屯、化ISA技術(測 定DR-70抗原）。通過酶反應(抗體與生物素或者鏈霉抗生物素蛋白結合)進行掲示。生色反 應表示癌癥的存在。
[0019] 本
【申請人】令人驚奇地證實一種新的腫瘤標記物，其由結腸腫瘤釋放至癌組織之 夕h且是運些腫瘤的特征，由此可W在遠離腫瘤的生物學樣品及在腫瘤自身中檢測到。
[0020] 因此，本發明第一方面是體外診斷結腸直腸癌的方法，其通過確定取自疑似患有 結腸直腸癌的患者的生物學樣品、優選遠離腫瘤的生物學樣品中白細胞彈性蛋白酶抑制劑 的存在而進行診斷。
[0021] 本發明還設及運種方法在結腸直腸癌的早期診斷、篩選、治療隨診及預后中W及 在結腸直腸癌的復發診斷中的應用。
[0022] 本發明的方法因此可W通過簡便的檢驗方法特異性且早期診斷結腸直腸癌，所述 檢驗方法包括檢查取自患者的生物學樣品、優選遠離潛在腫瘤的生物學樣品中白細胞彈性 蛋白酶抑制劑的存在。運是因為本
【申請人】出乎意料地掲示了結腸腫瘤不僅分泌白細胞彈性 蛋白酶抑制劑，而且特異性釋放其至癌組織之外，運在后文詳細描述，且其在本發明方法的 生物學樣品中的濃度與在健康人體中確定的參考值相比增加。
[0023] 在遠離或非遠離腫瘤的生物學樣品中確定白細胞彈性蛋白酶抑制劑的存在使得 可W推斷查找的病變。本發明方法的一個優勢是可W使用遠離潛在腫瘤的樣品作為診斷樣 品，從而可W進行簡便且非侵入性診斷，而組織學診斷需要進行侵入性活組織檢查。事實 上，例如對組織切片進行的組織標記物的研究（免疫組織化學）也許具有預后意義，但是對 于篩選或者診斷結腸直腸癌無意義。
[0024] 白細胞彈性蛋白酶抑制劑腫瘤標記物（Swi SS Prot No. P30740,也稱作LEI、 Serpin Bl、單核細胞/中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑、M/肥I或EI)在1992年測序3DLEI特異 性抑制具有彈性蛋白酶型或者糜蛋白酶型性質的蛋白酶，其通過在SDS作用下形成不可解 離的復合物而起抑制作用4。因此LEI抑制由中性粒細胞產生的S種主要的蛋白酶：白細胞 彈性蛋白酶、蛋白酶-3和組織蛋白酶G。運些蛋白酶能通過蛋白酶解細胞外或吞隧的底物而 使得免疫系統防御生物體。然而，當運些蛋白酶過量時，其可造成炎癥反應。因此，LEI在調 節和限制細胞蛋白酶誘導的炎癥作用中起作用。不過，目前還沒有報道過LEI有可能用作癌 癥的標記物，特別是結腸直腸癌的標記物，W及可在遠離腫瘤的樣品中對其進行分析。
[0025] 短語"確定腫瘤標記物的存在"是指確定所述蛋白質或者其信使RNA的存在，或者 檢測其基因上編碼或非編碼序列中的修飾如甲基化。
[0026] 短語"由結腸腫瘤釋放"是指無論機制如何由腫瘤細胞自身或者由鄰近的非腫瘤 細胞在損傷后的主動或被動分泌或者釋放的腫瘤標記物，或者是由腫瘤進展引起的細胞表 型的修飾。
[0027] 短語"對其進行本發明方法的生物學樣品"是指可能含有感興趣的腫瘤標記物的 任何生物學樣品。可W提及的非遠離腫瘤的生物學樣品例如可W是固體樣品如源自患者的 腫瘤、該腫瘤的活檢組織、淋己結或者轉移瘤的組織，W及純化自運些固體樣品的細胞。可 W提及的遠離腫瘤的生物學樣品例如是生物學液體如全血或其衍生物例如血清或血漿、尿 液、唾液和滲出液、骨髓W及糞便，W及純化自運些液體樣品的細胞。優選血液及其衍生物 W及糞便、滲出液和純化自運些液體樣品的細胞。
[0028] 本發明的方法可W通過檢測除了 LEI之外還檢測至少一種其它腫瘤標記物而改 善，所述標記物也適當地由結腸腫瘤釋放至癌組織之外。因此，組合至少兩個標記物使得可 W改善診斷結腸直腸癌的檢驗的特異性和靈敏性。
[0029] 因此，本發明另一方面也包括確定選自如下兩組標記物(單獨或組合考慮）的至少 一種其它腫瘤標記物的存在：
[0030] -A組:埃茲蛋白化zrin)、酷化氨基酸水解酶1、肝脂肪酸結合蛋白、腸脂肪酸結合 蛋白、載脂蛋白AI、載脂蛋白AII和I-絲束蛋白（I-Plastin),其中一些標記物是本
【申請人】鑒 別的新標記物；
[0031] -B組:具有額外的診斷意義的標記物，即的-微球蛋白、蛋白酶體20S、半乳凝素-3 (Galectin-3)乳酸脫氨酶B鏈、巧網蛋白、再生膜島衍生蛋白3a(Regenerating Islet- Derived Protein 3a)、腫瘤相關巧離子信號傳導蛋白1、細胞骨架角蛋白II型8、細胞骨架 角蛋白I型18、細胞骨架角蛋白I型19、上皮巧粘蛋白化Pithelial-化化erin)、CEA、絨毛蛋 白（Villin)、CA19-9、CA 242、CA 50、CA 72-2、睪酬、1'1]\^-1、化1口1〇-1、1111616。^11-1、蛋白 質二硫鍵異構酶、細胞角蛋白20、翻譯控制的腫瘤蛋白、防衛素（原）-A5((PrcOdefensin- A5)，血液中甲基化模式特異性改變的DNA片段的檢測，例如AXL4基因的甲基化DNA(無芒樣 同源框-4基因（aristaless-like homeobox-4gene)甲基化）或者S邱tin-9基因的甲基化 DNA，糞便DNA片段中特異性改變的檢測，如糞便DNA的特異性突變或者糞便DNA的甲基化模 式的特異性改變，W及糞便人血紅蛋白的檢測。
[0032] 本發明的方法因此可W通過檢測至少兩個標記物而改善，一個是LEI，另一個是選 自A組的另一腫瘤標記物，所述A組即埃茲蛋白、酷化氨基酸水解酶1、肝脂肪酸結合蛋白、腸 脂肪酸結合蛋白、載脂蛋白AI、載脂蛋白An和I-絲束蛋白。
[0033] "新描述的腫瘤標記物"是指蛋白質或信使RNA或者相應基因的特異性修飾，如突 變或者甲基化。
[0034] 埃茲蛋白標記物（Swiss Prot NO.P15311，也稱作p81，切tovillin或絨毛蛋白-2) 是提供細胞膜與細胞骨架肌動蛋白絲之間結合的蛋白質，特別是在腸上皮細胞的微絨毛 中5〇W.GJiang和S.Hiscox6已經掲示了白細胞介素比-2、化-8、比-10等可W抑制埃茲蛋白 在HT29人結腸直腸癌細胞系中的表達。同一作者7也掲示了 HT115和皿T18結腸直腸癌細胞 系中埃茲蛋白表達的抑制降低細胞之間的粘附，且增加細胞的活動性和侵入行為。他們推 斷埃茲蛋白通過與細胞粘附分子E-巧粘蛋白和0-連環蛋白（0-化tenin)的相互作用調節細 胞/細胞和細胞/基質之間的粘附。他們提出埃茲蛋白在控制癌細胞的侵潤潛力中可W起重 要作用。此外，T.Xiao等8使用化ISA量化肺癌患者的血漿埃茲蛋白。然而，他們未觀測到與 對照個體的任何差異。本
【申請人】令人驚奇地掲示了運種蛋白質在取自結腸直腸癌患者的生 物學樣品中是良好的標記物，所述樣品遠離或者非遠離所述腫瘤。
[0035] 酷化氨基酸水解酶1標記物（Swiss Prot NO.Q03154,也稱作EC3.5.1.14，N-酷基- k氨基酸氨基水解酶或ACY-1)是酷化氨基酸水解酶家族的一部分。它們是催化酷化的氨基 酸水解的酶W提供脂肪酸和氨基酸9。對酷化氨基酸水解酶活性進行的免疫化學測定在早 如1975年由K丄orentz等W掲示，其用于檢驗各種組織和血清11。研究示出在肝病變的病例 中酷化氨基酸水解酶活性增加，但是在結腸癌病例中不增加。此外，酷化氨基酸水解酶1基 因已經在染色體化21.1上鑒別U。在小細胞肺癌中化21.1區域降低為純合性，在運種情況中 酷化氨基酸水解酶表達被抑制或不可檢測U。相似地，S.Balabanov等M已經掲示在腎癌病 例中酷化氨基酸水解酶表達被抑制。本
【申請人】令人驚奇地掲示運種蛋白質在取自結腸直腸 癌患者的生物學樣品中是良好的標記物，所述樣品可W是遠離該腫瘤的樣品或非腫瘤樣 品。
[0036] 肝脂肪酸結合蛋白標記物(Swiss Prot NO.P07148,也稱作L-FABP、FABP1、FAB化、 Z-蛋白或者固醇轉運蛋白）屬于FABP家族，其包含9個同種型。每個同種型根據首先檢測到 該同種型的組織命名。運些同種型具有共有的功能及相似的=維結構，但是其序列同源性 不高。kFABP在1985年被測序1S。其是ISkDa的小型蛋白質，高豐度存在于細胞溶膠中，且具 有結合游離脂肪酸和膽紅素的能力。近來的一些研究似乎表明L-FABP蛋白表達的削弱可誘 導腫瘤發生。對于前列腺癌，腫瘤活檢組織中kFABP mRNA表達水平比在正常組織中高10 倍1S。對于結腸癌，一些研究小組使用二維電泳技術已經鑒別了與在正常結腸粘膜組織中的 表達相蛋白在腫瘤組織中的表達降低"。運個結果也已經通過免疫組織化學技術 證實。此外，L-FABP蛋白在已經轉移至肝的結腸直腸癌患者中是預后肝臟切除的標記物"。 本
【申請人】令人驚奇地掲示了運種蛋白質在取自結腸直腸癌患者的生物學樣品中是良好的 標記物，所述樣品遠離所述腫瘤。
[0037] 腸脂肪酸結合蛋白標記物（Swiss Prot NO.P12104,也稱作I-FABP、FABP-2或 FABPI)在1987年被測序I9。其是ISkDa的小型蛋白質，高豐度存在于細胞溶膠中，且具有結合 游離脂肪酸和膽紅素的能力。I-FABP蛋白在小腸的腸上皮細胞中表達，且可W組成運種類 型細胞蛋白質含量的大約2%。在組織水平，十二指腸和空腸與結腸相比顯然含有較高數量 的I-FABP (空腸:4.祉g/g，結腸:0.2扣g/g) W。I-FABP在健康個體的血漿樣品中不可被檢測 到。另一方面，在某些病理學情況如腸缺血、克羅恩病或者原發性膽汁性肝硬化中，可W證 實在某些個體中血漿I-FABP濃度增加 W。對于前列腺癌，已經掲示了I-FABP mRNA在腫瘤活 檢組織比在正常組織中的表達水平高7倍IS。在大鼠中用氧化偶氮甲燒(azoxymethane)誘導 的結腸直腸癌模型中，當給予動物降低癌癥發生的食物(大豆蛋白或者乳清水解產物)時， I-FABP mRNA的表達水平降低2.92-3.97倍2I。本
【申請人】令人驚奇地掲示了運種蛋白質在取 自結腸直腸癌患者的生物學樣品中是良好的標記物，所述樣品遠離所述腫瘤。
[0038] 載脂蛋白是由極性氨基酸組成的蛋白質家族，其可W通過形成稱作脂蛋白的親水 性大分子復合物而轉運血液中的脂質。對于每種人血漿載脂蛋白，存在衍生自遺傳多態性 和/或翻譯后修飾的同種型，其在血液中的存在與某些病變相關22。載脂蛋白的血漿濃度并 非是不顯著的，在mg/ml級別23。
[0039] 載脂蛋白AI標記物(NCBI No. 490098,也稱作Apo A-I、Apo AI和Apo Al)是具有 243個氨基酸的28kDa蛋白質。其基本上由肝和腸合成。通過SELDI-TOF，掲示了運種蛋白質 在結腸直腸癌患者血清與在健康個體血清中相比豐度不高24。然而，運篇文章指出通過組合 Apo AI與其它蛋白質標記物區別CRC患者與健康個體。此外，運篇文章指出由另一研究小組 進行的通過濁度免疫測定分析Apo AI未證實運種蛋白質在CRC患者血清中的豐度不高25。 化Chem等26測定了在結腸直腸癌轉移之后患有肝癌的患者血清中的Apo AI。本
【申請人】令人 驚奇地掲示了通過免疫測定分析可W證實運種蛋白質在結腸直腸癌患者中的濃度降低，與 先前化gwegen等24提出的結果相反，其僅通過實施SELDI-TOF技術才能證實運種降低。通過 在生物學樣品中進行免疫測定分析Apo AI是診斷結腸直腸癌的良好方法，所述樣品遠離所 述腫瘤，進行的免疫測定分析不是Zhang等的小組所用的比濁法25。
[0040] 載脂蛋白An標記物（Swiss Prot NO.P02652,也稱作ApoA II、Ap〇-AII和Apo A2) 是由每個鏈具有77個氨基酸的兩個多膚鏈組成的17380-化蛋白質，所述兩個多膚鏈通過二 硫鍵連接。如載脂蛋白AI-樣，載脂蛋白An也基本上由肝和腸合成。除了Apo AI之外， 化Chem等26也測定了在結腸直腸癌轉移之后患有肝癌的患者血清中的Apo All。然而，結果 無意義，且不能得W推斷病癥。本
【申請人】令人驚奇地掲示了結腸直腸癌患者中運種蛋白質 濃度降低，使其在取自結腸直腸癌患者的生物學樣品中是良好的標記物，所述樣品遠離所 述腫瘤。
[0041 ] I-絲束蛋白標記物（Swiss Prot No.Q14651，也稱作腸特異性絲束蛋白或者絲束 蛋白1)屬于人絲束蛋白家族，該家族具有S個代表性成員：I -絲束蛋白、k絲束蛋白和T-絲 束蛋白。一些作者將絲束蛋白類稱為"微絲結合蛋白類(Fimbrins)",另一些作者將I-絲束 蛋白稱為微絲結合蛋白。絲束蛋白類是結合肌動蛋白形成細胞骨架的蛋白質。它們是70kDa 蛋白質，在真核生物進化中相對良好保守。它們呈現出良好組織特異性，在一個時期僅一種 同種型在正常組織中存在27。絲束蛋白類在癌癥中的應用已經在專利US-A-5 360 715中描 述，該專利提議了一種確定細胞是造血細胞還是血管發生性即癌性細胞的方法。運種方法 要求在細胞水平測定k絲束蛋白和T-絲束蛋白，更特別是測定其mRNA。然而，盡管呈現運些 性質，但是先前未進行研究W評估絲束蛋白在使用血清或糞便樣品診斷結腸直腸癌中的重 要性。此外，從未設想I-絲束蛋白作為潛在的癌標記物28。本
【申請人】令人驚奇地掲示了運種 蛋白質在取自結腸直腸癌患者的生物學樣品中是良好的標記物，所述樣品遠離所述腫瘤。
[0042] 在對其進行本發明方法的生物學樣品中，選自A組的腫瘤標記物的濃度根據考慮 的標記物與在健康個體中確定的參考值相比增加或降低。
[0043] 本發明的方法也可W通過組合檢測LEI與選自B組的一種其它腫瘤標記物而改善， 所述B組標記物即標記物的-微球蛋白、蛋白酶體20S、半乳凝素-3a-乳酸脫氨酶B鏈、巧網 蛋白、再生膜島衍生蛋白3曰、腫瘤相關巧離子信號傳導蛋白1、細胞骨架角蛋白II型8、細胞 骨架角蛋白I型18、細胞骨架角蛋白I型19、上皮巧粘蛋白化Pithelia^化化erin)、CEA、絨 毛蛋白、CA19-9、CA 242、CA 50、CA 72-2、睪酬、1'1]\^-1、吐1口1〇-1、1111616。1111-1、蛋白質二 硫鍵異構酶、細胞角蛋白20、翻譯控制的腫瘤蛋白、防衛素（原)-A5;血液中甲基化DNA的檢 ，優選AXL4基因的甲基化DNA(無芒樣同源框-4基因甲基化)或者septin-9基因的甲基化 DNA;糞便DNA片段中特異性改變的檢測，如糞便DNA的特異性突變或者糞便DNA的甲基化模 式的特異性改變，W及糞便人血紅蛋白的檢測。當然，本發明的方法也可W在同一測定中檢 測LEI、選自B組的至少一種腫瘤標記物W及選自A組的至少一種其它腫瘤標記物。
[0044] 02-微球蛋白標記物(Swiss Prot No.P61769,也稱作的-微球蛋白，02M)是在大多 數有核人細胞表面發現的一種低分子量(ll-12kDa)蛋白質。在某些癌癥患者中，血清的-微 球蛋白水平增加，運種增加不是特異性的，或者與腫瘤的性質、疾病的階段或嚴重性不相 關。在其它疾病如紅斑狼瘡、類風濕性關節炎、干燥綜合征、淋己系統惡性疾病(多發性骨髓 瘤、B細胞淋己瘤）、某些病毒性疾病(肝炎或AIDS) W及在血友病患者中也觀測到顯著增加。 由于的-微球蛋白被腎小球濾過，且由近端小管重吸收，因此在腎臟疾病中其在血液中的濃 度可W改變。因此測定的-微球蛋白主要用于診斷腎臟病癥，或者用于獲得性免疫缺陷病毒 感染的隨診中。然而，已知運種標記物是腫瘤標記物，特別是結腸癌的標記物。
[0045] 蛋白酶體20S標記物(也稱作Pro some)是蛋白酶體的中屯、結構，其自身是參與遍在 蛋白的細胞內降解的分子復合物29。蛋白酶體是由在7個亞基的4個環締合的28個亞基組成 的700W)a的分子復合物。在人體中，已知7個a單位(al ,〇2,〇3,〇4,〇5,〇6和〇7)及1〇個0單位 (m，的，盼，M，化，06，的，01 i，的i和化i)。通過其催化性質，蛋白酶體在細胞增殖、生長、調 節和調亡中且因此在癌化途徑中起關鍵作用。用Bodezomib (Velcade)抑制蛋白酶體是公 認的治療多發性骨髓瘤的方法。現在正對血液癌癥或腫瘤進行II期或HI期治療試驗。 T丄avabre-Bedrand等W掲示了在某些病理狀況特別是在癌癥(骨髓瘤、淋己瘤和實體瘤） 中，蛋白酶體的血清水平可增加。
[0046] 半乳凝素-3標記物(Swiss Prot No.P17931，也稱作Gal-3、半乳糖特異性凝集素 3、MAC-2抗原、IgE-結合蛋白、3化化凝集素、碳水化合物結合蛋白35、CBP 35、昆布氨酸-結 合蛋白、凝集素^29、1^-31、半乳糖巧結合蛋白或者GALBP)是能結合N-乙酷氨基乳糖 (acetyllactosamine)型的0-半乳糖巧結構的凝集素。其是參與多種生物學功能的多功能 蛋白質，所述功能包括腫瘤細胞的粘附、增殖、分化、血管發生、細胞調亡、轉移癌進展31。多 項研究表明Gal-3可W與許多分子形成復合物：CEA、I扣、昆布氨酸化aminin)、粘蛋白 (Mucin)、Mac-2BP、LAMPl、LAMP2、纖連蛋白（Fibronectin)等。Gal-3的血清測定已經由 I. Iurisci等32描述。Gal-3在用Mac-2-結合蛋白（Gal-3-結合蛋白）包被的微滴定平板上被 捕獲，然后用抗-Gal-3大鼠抗體掲示。運項研究掲示了 Ga^3在胃腸道癌癥、乳腺癌、肺癌、 卵巢癌、黑素瘤和非霍奇金淋己瘤中增加的血清水平。
[0047] k乳酸脫氨酶B鏈標記物（Swiss Prot NO.P07195,也稱作LDH-B，LDH屯、單位或 LDH-H)是可W W同源四聚體形式形成復合物的蛋白質。運種蛋白質也可^與心乳酸脫氨酶 A鏈蛋白（Swiss Prot NO.P00338,也稱作LDH-A、LDH肌單位或LDH-M)W異源四聚體形式形 成復合物。血流中稱作LDH的運種四聚體復合物的血清劑量和/或血清酶活性在許多實體瘤 中與腫瘤大小成比例地增加。推薦其與人絨毛膜促性腺激素(e-hCG)和胎盤堿性憐酸酶組 合用于精囊癌的隨診中。LDH被認為是預后淋己瘤、白血病或者結腸癌的重要標記物33。
[004引巧網蛋白標記物（Swiss Prot NO.P27797,也稱作CRP55、Calregulin、HACBP、 E化60或grp60)是多功能蛋白質。其是能與內質網的幾乎所有單糖基化蛋白質瞬時相互作 用的凝集素。D.J.McCool等34因此已經掲示了巧網蛋白參與結腸粘蛋白MUC2的成熟。在組 織、糞便或體液中使用巧網蛋白測定診斷CRC的方法在專利申請WO 03/065003中描述。 [0049] 再生膜島衍生蛋白3日標記物（Swiss Prot No.Q06141，也稱作Reg 111-日、膜腺炎 相關蛋白1或者膜腺炎相關蛋白KPAP 1))是在正常膜腺中微弱表達的蛋白質。其在急性膜 腺炎和在某些慢性膜腺炎患者中過表達。在運種情況中，其出現在膜液和血流中35。Y.Motoo 等36通過化ISA已經掲示了某些結腸癌、胃癌、肝癌或膜腺癌W及在腎功能衰竭患者血液中 PAP 1水平增加。為此，他們使用Dynabio(La Gaude ,France)公司銷售的化ISA測定法 (PANCEPAP)o
[(K)加]腫瘤相關巧離子信號傳導蛋白1標記物(Swiss Prot No.P16422,也稱作主要胃腸 道腫瘤相關蛋白GA733-2、上皮細胞表面抗原、EpCAM、上皮糖蛋白EGP、腺癌相關抗原、KSA、 KS 1/4抗原、細胞表面糖蛋白Trop-I或者CD326抗原)根據其由結腸直腸癌細胞的抗體識別 的能力在1979年被鑒定37。已知運種蛋白質有許多名稱，如上文描述，但是最常用的是稱其 為化CAM。其是在某些上皮細胞W及許多癌癥細胞的基底面中表達的跨膜蛋白38。在1982年， 化rlyn等39掲示了注射抗-EpCAM單克隆抗體可W抑制結腸直腸癌患者體內腫瘤生長。運些 結果使得可W基于稱作Edreco Iomab的抗-EpCAM抗體開發抗腫瘤治療方法。運種治療W 化norex?名稱銷售。此外，H. Abe等W通過ELISA掲示了稱作MK-I的可溶形式的化CAM在10% 研究的癌癥患者血流中增加。
[0051]細胞角蛋白是組成上皮細胞細胞骨架的中間絲的蛋白質部分。目前已經鑒別了超 過20種的人細胞角蛋白。細胞角蛋白8(Swiss Prot NO.P05787,也稱作細胞角蛋白、CK-8、 角蛋白-8或K8)、18(Swiss Prot NO.P05783,也稱作細胞角蛋白-18XK-18、角蛋白-18或 K18)和19(Swiss Prot NO.P08727,也稱作細胞角蛋白-19、CK-19、角蛋白-19或K19)在上皮 細胞中豐度最高，且是診斷癌病變的有效工具41。運種臨床重要性與細胞調亡或增殖期上皮 細胞釋放細胞角蛋白相關。在細胞調亡情況中，運個釋放W可溶片段形式出現，似乎在半脫 氨酸蛋白酶的蛋白酶解作用下出現。血流中未降解的細胞角蛋白形式從未有報道。=種臨 床最常用的細胞角蛋白測定是組織多膚抗原(TPA)測定，組織多膚特異性抗原(TPS)測定和 CYFRA 21-1測定。TPA是測量細胞角蛋白8、18和19的廣譜檢驗法。TPS和CYFRA 21-1測定分 別更特異性測量細胞角蛋白18和細胞角蛋白19的片段。運=種檢測法檢測可溶的細胞角蛋 白片段，所述片段可^^其自身或者^蛋白質復合物形式呈現。1口4^口5或者〔￥尸34-21-1已 經用于結腸直腸癌、乳腺癌、肺癌、膀脫癌、卵巢癌、膜腺癌、前列腺癌和某些ENT癌的治療隨 診中。事實上，血液中可溶的細胞角蛋白的測定在篩選腫瘤復發或者評估所用治療(放療、 化療、激素治療）的反應中具有臨床價值。定期檢測使得特別可W評估腫瘤的進展。可溶的 血液細胞角蛋白的量也具有預后腫瘤階段和轉移形成的意義。目前，最常用的細胞角蛋白 血液測定是CYFRA 21-1。高度推薦其用于非小細胞肺癌患者的隨診。有許多可商購的TPA (AB Sangtec Medical Co.,Byk-Roland等）、TPS(IDL Biotech AB,B邸I Diagnosiss等）和 CYFRA-21-1 (Roche Diagnosiss ,CIS Bio-International ,Fu jirebio Diagnosiss等）的試 劑盒。此外，H.Kim等42掲示了測定糞便細胞角蛋白19化iNonA Inc.)組合便潛血測定可用于 篩選胃腸道疾病。最后，細胞角蛋白20(Swiss Prot NO.P35900,也稱作細胞骨架I型角蛋白 20XK-20、角蛋白-20、K20或者IT蛋白）在結腸直腸癌中作為標記物的應用在專利申請US 2002/0160382 中描述。
[0052] 上皮巧粘蛋白標記物（Swiss Prot NO.P12830,也稱作E-巧粘蛋白、Uvomorulin、 巧粘蛋白-1、CAM 120/80或者CD324抗原）是介導巧離子依賴性細胞粘附的跨膜蛋白。其在 上皮細胞中特異性表達，在此參與維持其表型。E-巧粘蛋白的細胞質結構域結合0-連環蛋 白，其自身結合細胞骨架的肌動蛋白絲網。運種E-巧粘蛋白/0-連環蛋白結合在穩定上皮組 織的細胞/細胞粘附中起重要作用。因此，E-巧粘蛋白的喪失可降低細胞粘附且增加癌細胞 的侵潤能力。E-巧粘蛋白或者0-連環蛋白的表達降低通常與腫瘤特別是胃腸道癌癥的更大 的侵潤性和去分化性相關聯。因此，F.Roca等43掲示了患有結腸直腸癌且E-巧粘蛋白低表達 的患者與具有正常表達水平的患者相比具有更不利的預后。在1983年，Damsky等44掲示了可 溶形式的E-巧粘蛋白可W由MCF-7乳腺癌細胞系釋放。運種可溶形式相應于E-巧粘蛋白胞 外部分的裂解。隨后，M.Katayama等45掲示了可溶形式的E-巧粘蛋白在癌癥情況中可W釋放 進入血流中；C.Willmanns等46掲示了血液中E-巧粘蛋白量增加與結腸直腸癌的腫瘤階段相 關聯。此外，可商購的試劑盒由hkara BioChemicals(Tokyo,Japan)公司提供。
[0化3]自1965年W來，P.Gold和S.Freedman47已經提議測定CEA(癌胚抗原）用于診斷結腸 直腸癌，但是血液中運個標記物的測定對于診斷相對非晚期結腸直腸癌的靈敏性不佳。因 此，測定血清CEA尤為推薦用于評估肝轉移風險48W及用于治療隨診。此外，其對于結腸直腸 癌不是非常特異性的標記物;事實上其在許多其它癌癥(肺癌、乳腺癌等）中均增加。另一方 面，測定糞便CEA似乎比測定血清CEA或者測定便血更靈敏且更具特異性49。然而，運種測定 還未被常規提議。
[0054] 反應性抗原性決定簇1116-NS-19-9，更通常稱作CA19-9(碳水化合物抗原19.9)， 由高分子量蛋白質攜帶W。測定血液中CA 19-9與測定CEA相比更具特異性。血液中CA 19-9 水平在結腸直腸癌、膜腺癌和肝癌(肝膽管型肝癌）中增加，但是在非癌病癥(膽管炎等）中 也增加。在診斷癌癥及該病癥的隨診中推薦其與CEA組合。
[0055] J.化Imgren等Si掲示了在結腸直腸癌患者血清中CA 50抗原的量增加 。CA 50抗原 根據其由特異性單克隆抗體識別的能力定義。
[0化6] 關于CA 72標記物，T丄.Klug等52掲示了在結腸直腸癌患者血清中CA 72抗原的量 增加 。CA 72抗原根據其由特異性單克隆抗體識別的能力定義。
[0化7] 相似地，P.Kuusela等53掲示了在結腸直腸癌患者血清中CA 242抗原的量增加 。CA 242抗原根據其由特異性單克隆抗體識別的能力定義。
[005引 M.化Hand等54提議測定睪酬W診斷結腸直腸癌。運些作者掲示了結腸直腸癌患者 血液睪酬水平降低。
[0059]關于TIMP-I，或者1型基質金屬蛋白酶的組織抑制劑運個標記物，專利申請US 2007/0020707描述了通過測定體液中TIMP-I診斷結腸直腸癌。
[0060] F.Model等55在2006年7月在胃腸道癌癥國際會議期間掲示了可W檢測結腸直腸癌 患者血漿中S ept in-9基因的甲基化形式。
[0061] 1.?.666的等56掲示了41^(4基因或者無芒樣同源框-4基因在結腸直腸癌患者血清 中比在對照血清中更通常被甲基化(P<〇.0001)。使用41.4pg/血闊值，他們獲得了 83.3%的 靈敏性和70 %的特異性。
[0062] 絨毛蛋白在專利申請FR2581456中被描述為診斷結腸直腸癌的血液標記物。
[0063] C.Bianco等57掲示了在結腸直腸癌患者血清中化ipto-1的量增加。
[0064] 測定Intelectin-l(Swiss Prot No.QSWWAO,也稱作腸乳鐵蛋白受體、巧喃半乳糖 結合凝集素、內皮細胞凝集素化-1或者Omentin)用W診斷結腸直腸癌在專利申請US 2003/ 0082533中描述。
[00化]蛋白質二硫鍵異構酶（Swiss Prot NO.P07237,也稱作EC 5.3.4.1、PDI、脯氨酷4- ?化酶(6亞基、細胞甲狀腺激素結合蛋白或者p55)、翻譯控制的腫瘤蛋白（SwissProt NO.P13693,也稱作TCTP、p23、組胺釋放因子、皿F或化dilin)W及防衛素（原）-A5(Swiss Prot No.Q01523)用作結腸直腸癌標記物分別在專利申請EP1724586、US 2003/0172388和 US 2006/0179496中描述。術語"防衛素(原r是指前體（即裂解前的防衛素原）；前膚（即防 衛素原裂解后的N末端部分）；W及成熟蛋白質（即防衛素，相應于裂解后C末端部分）。
[0066] 最后，測定人糞便血紅蛋白是已知的檢驗法，且可W如前述實施。
[0067] 對其進行本發明方法的生物學樣品中選自B組的腫瘤標記物的濃度根據考慮的標 記物與在健康個體中確定的參考值相比是增加或降低的。
[0068] 優選地，B組腫瘤標記物選自的-微球蛋白、蛋白酶體20S、半乳凝素-3、心乳酸脫氨 酶B鏈、巧網蛋白、再生膜島衍生蛋白3曰、腫瘤相關巧離子信號傳導蛋白1、上皮巧粘蛋白、 CEA、CA19-9、睪酬、TIMP-I Jntelectin-U蛋白質二硫鍵異構酶、細胞角蛋白20、翻譯控制 的腫瘤蛋白、防衛素(原)-A5及檢測人糞便血紅蛋白。
[0069] 當然，本發明的方法也可包括檢測本領域技術人員已知的結腸直腸癌任何其它標 記物。
[0070] 如上所述，感興趣的腫瘤標記物W蛋白質形式或者W信使RNA形式或者通過相應 DNA改變(突變或甲基化修飾)而被檢測。
[0071] 可W通過本領域技術人員已知的確定樣品中蛋白質存在的任何方法確定生物學 樣品中感興趣的"蛋白質"腫瘤標記物的存在，例如生物化學檢驗，包括免疫測定，或者通過 質譜分析。
[0072] 所述生物化學檢驗可W是本領域技術人員熟知的任何檢驗，包括分子相互作用， 即所述腫瘤標記物與特異于或者非特異于所述腫瘤標記物的一或多種結合配偶體之間的 反應。
[0073] 優選地，所述生物化學檢驗是本領域技術人員已知的免疫測定，包括腫瘤標記物 (即抗原)與一或多種特異性結合配偶體(即該抗原的抗體)之間的免疫學反應。
[0074] 本發明方法中特異于或非特異于腫瘤標記物的結合配偶體是能結合所述標記物 的任何配偶體。當其能W高特異性、甚至W100%特異性結合運些標記物時，認為其是特異 性的。當其與運些標記物的結合特異性較低且同時能結合其它配體如蛋白質時，認為其是 非特異性的。例如，可W提及的是抗體、抗體一部分、受體及能結合運個標記物的任何其它 分子。
[0075] 所述結合配偶體抗體是例如多克隆抗體或者單克隆抗體。
[0076] 多克隆抗體可W通過用相關的腫瘤標記物免疫動物，隨后回收純化形式的希望的 抗體而獲得，通過從所述動物取血清，將所述抗體從其它血清組分中分離，特別是在附著有 該抗體特異性識別的抗原、特別是所述標記物的柱上通過親和層析分離。
[0077] 單克隆抗體可W通過雜交瘤技術獲得，其一般原理在后文描述。
[0078] 首先，用感興趣的腫瘤標記物免疫動物(通常是小鼠），隨后所述動物的B淋己細胞 可W產生該抗原的抗體。運些產生抗體的淋己細胞隨后與"永生化的"骨髓瘤細胞(例如鼠） 融合W產生雜交瘤。使用由此獲得的細胞異源混合物，選擇能產生特定抗體且無限增殖的 細胞。每個雜交瘤均W克隆形式增殖，導致單克隆抗體產生，其由所述腫瘤標記物識別的性 質可例如通過化ISA、通過一維或二維Western印跡、通過免疫巧光或者通過生物傳感器檢 。隨后純化由此選擇的單克隆抗體，特別是通過上述親和層析技術純化。
[0079] 所述單克隆抗體也可W是通過本領域技術人員熟知的遺傳工程化技術獲得的重 組抗體。
[0080] 已知抗-白細胞彈性蛋白酶抑制劑抗體的實例，且可得自Abcam目錄兔抗-LEI多克 隆抗體，Cat. No. Ab47731。抗-LEI單克隆抗體，克隆ELA-I，由R.化sumatsu等描述5S。
[0081] 已知抗-埃茲蛋白抗體的實例，且可得自Abcam目錄，抗-埃茲蛋白單克隆抗體，克 隆3C12，Cat. No. Ab4069和兔抗-埃茲蛋白多克隆抗體，Cat. No. Ab47418。
[0082] 已知抗-酷化氨基酸水解酶1抗體的實例，且可得自Abnova目錄，抗-酷化氨基酸水 解酶1單克隆抗體，克隆4F1-B7，化t.No.冊0000095-M01，W及Abcam目錄，雞抗-酷化氨基酸 水解酶1多克隆抗體，Cat. No. Ab26173。
[0083] 已知抗-肝脂肪酸結合蛋白抗體的實例，且可得自Abeam目錄，抗-kFABP單克隆抗 體，克隆她 6，Cat. No. Ab100 59，及兔抗-L-FABP 多克隆抗體，Cat. No. Ab7807。
[0084] 已知抗-腸脂肪酸結合蛋白抗體，且可得自R&D Systems目錄，抗-I-FABP單克隆抗 體，克隆 323701，Cat. No. MAB3078，及 Abcam 目錄，兔抗-I-FABP 多克隆抗體，Cat. No. Ab7805。 [00化]已知抗-載脂蛋白AI抗體的實例，且可得自Biodesign Meridian Life Sciences 目錄，抗-Apo Al單克隆抗體，克隆4A90，Cat.No.H45402M，和山羊抗-Apo Al多克隆抗體， Cat.No.K45252P。
[00化]已知抗-載脂蛋白AII抗體的實例，且可得自US Biological目錄，抗-Apo AII單克 隆抗體，克隆 1402,Cat.No.A2299-31C，及 Biodesign Meridian Life Sciences 目錄，山羊 抗-Apo AII多克隆抗體，Cat.No.K74001P。
[0087] 已知抗-I-絲束蛋白多克隆抗體的實例，且可得自Santa化UZ Biotechnology目 錄。兔多克隆抗體H-300(化t.No.sc-28531)與I-絲束蛋白、k絲束蛋白和T-絲束蛋白反應。 本
【申請人】掲示了 I-絲束蛋白的單克隆抗體。
[0088] 已知抗-的-微球蛋白、抗-CEA、抗-CA19-9和抗-睪酬抗體的實例，且可用于本申請 人的測定試劑盒中，分別是Vidas?的-微球蛋白、Vi如總)CEA、vidas?CAl9-9?和VM効S? 睪酬。
[0089] 已知抗-蛋白酶體20S抗體的實例，且可得自Affinitiy Research Products目錄。
[0090] 已知抗-半乳凝素-3、抗乳酸脫氨酶B鏈、抗-巧網蛋白、抗-腫瘤腫瘤相關巧離 子信號傳導蛋白1、抗-細胞骨架II型角蛋白8、抗-細胞骨架I型角蛋白18、抗-細胞骨架I型 角蛋白19、抗-上皮-巧粘蛋白、抗-絨毛蛋白和抗-TIMP-I抗體的實例，且可得自Abcam目錄。
[0091] 已知抗-再生膜島衍生蛋白3日抗體的實例，且用于Dynabio測定試劑盒化a Gaude, France)中。
[0092] 已知抗-CA 242、抗-CA 50和抗-CA 72-4抗體的實例，且可得自Fujirebio目錄。
[0093] 已知抗-InteIectin-1抗體的實例，且可得自Alexis Biochemicals目錄，抗- Intelectin-I 單克隆抗體，克隆 Saly-I ,Cat. No. ALX-804-850-C100, W 及ral^bidA- Intelectin-I多克隆抗體，Cat. No. ALX-210-941。
[0094] 已知抗-蛋白質二硫鍵異構酶抗體的實例，且可得自Abeam目錄，抗-PDI單克隆抗 體，克隆化77，Cat. No. Ab5484，W及兔抗-PDI多克隆抗體，Cat. No. Ab3672，
[00對已知抗-細胞角蛋白20抗體的實例，且可得自Abeam目錄，抗-細胞角蛋白20單克隆 抗體，克隆Ks20.8，Cat. No. Ab962，W及兔抗-細胞角蛋白20多克隆抗體，Cat. No. Ab36756。
[0096] 已知抗-TCTP抗體的實例，且可得自目錄，抗-TCTP單克隆抗體，克隆3C7， Cat. No. 157冊0007178-M01，W及抗-TCTP多克隆抗體，Cat. No. 157冊0007178-A01。
[0097] 已知抗-防衛素-A5抗體的實例，且可得自Santa化UZ Biotechnology目錄，抗-防 衛素-45單克隆抗體，克隆8〔8，化1:.齡.3。-53997，^及41地3〇1日即〇313 1]1161']1日1:;[0]1日1 Inc.目錄，兔抗-防衛素-A5多克隆抗體，Cat. No.皿EFA51-A。
[0098] 本發明方法中特異于或者非特異于腫瘤標記物的結合配偶體可用作捕獲劑，作為 檢測劑，或者作為捕獲劑和檢測劑。
[0099] 可W通過任何檢測方式如直接或間接檢測方式觀測免疫反應，即腫瘤標記物/結 合配偶體的結合。
[0100] 在直接檢測即不包含標記情況中，免疫反應通過例如表面等離子共振技術或者在 具有傳導性聚合物的電極上通過循環伏安法(cyC1 i C VO1 tametr)觀測。
[0101 ]間接檢測是利用標記"掲示試劑"結合配偶體，或者是感興趣的腫瘤標記物自身進 行。在后者情況中，其隨后被描述為競爭方法。
[0102] 術語"標記"是指使標記試劑的附著能直接或間接產生可檢測的信號。運些標記試 劑非限制性包括：
[0103] ?酶，其產生例如通過比色法、巧光或者發光而可被檢測的信號，所述酶例如是辣 根過氧化物酶、堿性憐酸酶、e-半乳糖巧酶或者葡萄糖-6-憐酸脫氨酶；
[0104] .生色團，如巧光或發光化合物或染料；
[0105] ?放射性分子，如32P、35s或1叫，W及
[0106] ?巧光分子如Alexa或藻藍蛋白。
[0107] 也可W使用間接檢測系統，例如能與抗配體反應的配體。配體/抗配體對為本領域 技術人員熟知，例如如下一對:生物素/鏈霉抗生物素，半抗原/抗體，膚/抗體，糖/凝集素， 多核巧酸/與該多核巧酸互補的序列。在運種情況中，其是具有結合配對物的配體。抗配體 可W通過前文所述標記試劑直接檢測，或者通過配體/抗配體自身檢測。
[0108] 運些間接檢測系統在一定條件下可W導致信號放大。運種信號放大技術為本領域 技術人員熟知，可參見本
【申請人】先前的專利申請FR98/10084或W0-A-95/08000,或者 Qievalier等的文章59。
[0109] 根據所用標記的類型，本領域技術人員加入使得可W觀測顯示標記的試劑。
[0110] 舉例的上述免疫測定可W提及的是"夾屯、"方法，如化ISAJRMA和RIA，"競爭"方法 和直接免疫檢測方法如免疫組織化學、免疫細胞化學、Western印跡和Dot印跡方法。
[0111] 質譜分析法也可用于在生物學樣品中檢測本發明方法探求的腫瘤標記物。光譜法 的原理為本領域技術人員熟知，例如在化tterson，S.w中描述。
[0112] 為此，將預處理或未預處理的生物學樣品經過質譜分析儀，將獲得的質譜與本發 明方法尋找的腫瘤標記物的質譜對比。舉例的樣品預處理方法包括將其經過免疫捕獲支持 物，所述免疫捕獲支持物包含本發明方法尋找的腫瘤標記物的結合配偶體之一，例如本發 明方法尋找的腫瘤標記物的抗體。另一種樣品預處理方法包括預先分級分離所述生物學樣 品，W將樣品的蛋白質彼此分離。在本領域技術人員熟知的技術中，樣品的主要蛋白質可例 如首先被耗竭。
[0113] 利用最近的技術進步，也可W量化復雜的生物學介質中的蛋白質，使用WMRM(多 反映監測)模式運轉的S聯四極分析儀(triple quadripole analyzer)進行串聯質譜分析 (MS/MS)。運種運轉模式具有雙重選擇性(兩個分析儀，親本離子選擇和產物離子選擇），而 且與其它掃描模式相比檢測靈敏性得W改良。運種方法的技術可行性最近已經由Anderson and化nterSi證實，其成功地在免疫耗竭豐度最高的蛋白質后檢測到血漿濃度在一百ng/ml 級別的蛋白質。
[0114] 確定生物學樣品中感興趣的"mRNA"腫瘤標記物的存在可W通過確定樣品中mRNA 存在的任何方法進行，即通過直接檢測mRNA或者間接檢測mRNA，或者通過確定樣品中RNA存 在的本領域技術人員已知的任何其它方法進行。
[011引術語"直接檢測mRNA"是指證實生物學樣品中所述mRNA自身。
[0116] 直接檢測生物學樣品中mRNA可W通過本領域技術人員已知的任何方式進行，例如 通過與特異于該mRNA的結合配偶體雜交，其中進行適當的PCR擴增，或者NASBA技術。
[0117] 術語"雜交"是指在合適條件下兩個核巧酸片段通過穩定且特異的氨鍵彼此結合， 形成雙鏈復合物。運些氨鍵在互補堿基之間形成，如腺嚷嶺(A)與胸腺喀晚(T)(或者尿喀晚 (U))(稱作A-T鍵），或者鳥嚷嶺(G)與胞喀晚(C)(稱作G-C鍵）。兩個核巧酸片段的雜交可W 是完全的（參見互補核巧酸片段或序列），即在此雜交期間獲得的雙鏈復合物僅包含A-T鍵 和C-G鍵。運種雜交也可W是部分雜交(參見足夠互補的核巧酸片段或序列），即獲得的雙鏈 復合物包含使得可W形成雙鏈復合物的A-T鍵和C-G鍵，但是也包含與互補堿基未鍵合的堿 基。兩個核巧酸片段之間的雜交依賴于使用的雜交條件，特別是嚴格性。嚴格性被特別定義 為兩個核巧酸片段的堿基成分的函數(function), W及兩個核巧酸片段之間錯配程度。嚴 格性也可W依賴于反應參數，如雜交溶液中存在的離子的濃度和類型、變性劑的性質和濃 度和/或雜交溫度。本領域技術人員熟知所有運些數據，且可W確定合適的條件。通常地，根 據希望雜交的核巧酸片段的長度，雜交溫度介于大約20-70°C之間，特別是介于35-65°C之 間，鹽溶液的濃度介于大約0.5-1M之間。特異于或非特異于所述mRNA的結合配偶體是能結 合該mRNA的任何配偶體。例如，可W提及的是核酸探針、擴增引物，W及能結合該mRNA的任 何其它分子。
[0118] 術語"雜交探針"是指包含5-100個核酸單位、特別是10-35個核酸單位的核巧酸片 段，其在指定條件下具有雜交特異性，與特異于感興趣的祀基因的材料形成雜交復合物。雜 交探針可包含使其可W被檢測的標記。
[0119] 對于本發明，術語"擴增引物"是指包含5-100個核酸單位、優選15-30個核酸單位 的核巧酸片段，其可W起始酶促聚合化如酶促擴增反應。術語"酶促擴增反應"是指通過至 少一種酶的作用產生核巧酸片段的多個拷貝的過程。運種擴增反應為本領域技術人員熟 知，可W特別提及的是如下技術：
[0120] -PCR(聚合酶鏈反應），如專利US 4 683 195、US 4 683 202和US 4 800 159所述；
[0121] -NASBA(基于核酸序列的擴增），見專利申請WO 91/02818所述;及
[0122] -TMA(轉錄介導的擴增），見US 5 399 491專利所述。
[012引術語"檢測"是指插入染料如SYBRK'Green I或者漠化乙錠的物理方法或者化學 方法，或者使用標記檢測的方法。有許多檢測核酸的方法62。合適的標記如上文所述。
[0124] 對于本發明，雜交探針可W是"檢測"探針。在運種情況中，"檢測"探針用如上述標 記進行標記。根據運種標記的存在，可W檢測指定檢測探針與被檢測的轉錄物之間的雜交 反應的存在。
[0125] 所述檢測探針可W特別是"分子信標"檢測探針63。運些"分子信標"在雜交期間成 為具有巧光性。它們具有一個莖-環結構，且含有巧光團和巧光基團。特異性環序列與其互 補祀核酸序列的結合使得莖伸展，W及在激發期間W合適波長發射巧光信號。
[0126] 雜交探針也可W是"捕獲"探針。在運種情況中，"捕獲"探針可W通過任何適當方 式被固定或者可W固定于固體支持物上，即例如通過共價鍵或者吸附而直接或間接固定。 合適的固體支持物為本領域技術人員熟知，例如可W提及的是合成材料或天然材料、乳膠、 磁性粒子、金屬衍生物、凝膠等。所述固體支持物可W是微滴定平板形式，專利申請WO-A- 94/12670中描述的膜或者粒子。在該支持物上也可W固定一些不同的捕獲探針，每個捕獲 探針均特異于祀轉錄物。特別地，可W使用其上固定了大量探針的生物忍片作為支持物。
[0127] 探針固定于支持物上也為本領域技術人員已知，可W提及的是通過直接轉移、顯 微沉積(microdeposition)、原位合成及光刻術固定探針。
[0128] 生物學樣品中編碼感興趣的腫瘤標記物的基因中的DNA修飾或異常的證實可W通 過確定樣品中DNA改變的任何方法進行，即直接檢測突變，或者證實感興趣的基因座的甲基 化模式改變，或者通過本領域技術人員已知的確定樣品中DNA改變的任何其它方法進行。
[0129] 突變可包括一個核巧酸由另一個核巧酸取代、缺失一或多個核巧酸W及插入一或 多個核巧酸。所述突變可位于感興趣的腫瘤標記物基因的編碼區，或者位于5'和3'非編碼 區，如轉錄啟動子區或者轉錄終止區。
[0130] 證實突變的策略基于分子生物學技術，包括如下步驟:DNA提取、PCR擴增或者另一 擴增技術、雜交和/或測序。在結腸直腸癌情況中，如下方法已經成功用于檢測糞便DNA中的 突變:通過沉淀濃縮DNA，使用磁珠上的捕獲寡核巧酸使祀富集，PCR擴增感興趣的基因，固 相測序W鑒別點突變64。根據預期參考片段與突變片段之間大小的差異鑒別缺失。 Imperiale等64描述了位于K-ras、APC和p53基因中的一組21個突變，使得可W檢測16/31侵 潤性癌。
[0131] 其它使用的DNA標記物是BAT-26缺失，其是微衛星不穩定性的標記物，W及稱作長 DNA化-DNA)的可高度擴增的DNA，其不是特異性標記物，但是似乎反映結腸腔中脫落的腫瘤 細胞的素亂的調亡65。運些標記物在靈敏性或特異性方面均不令人滿意。
[0132] 如前所述，DNA改變也可相應于感興趣的腫瘤標記物基因的甲基化模式的修飾。所 述甲基化模式的修飾可相應于低甲基化（甲基化數目減少）或者高甲基化（甲基化數目增 多）。改變的單位位于感興趣的腫瘤標記物基因的編碼區內，或者位于5'和3'非編碼區，如 轉錄啟動子區或者轉錄終止區。
[0133] DNA甲基化的分析可W使用基于定性和/或定量PCR的技術進行，如MSP(甲基化特 異性PCR)、亞硫酸氨鹽測序、結合PCR用甲基化敏感的限制酶消化、COBRA(組合亞硫酸氨鹽 限制分析)和Ms-SNuPE(甲基化敏感的單核巧酸引物延伸）。所有運些技術均已經充分綜述 W及在方法學文章中詳細描述66。
[0134] 在文獻中已經報道了在結腸直腸癌病例中的一些高甲基化基因。例如可W提及的 是ALX4(無芒樣同源框-4)基因56、TPEF/HHP1 (含有表皮生長因子和卵泡抑素結構域的跨膜 蛋白）基因的啟動子區67或者S邱tin-9基因68。
[0135] 在本發明方法中，當檢測至少兩個標記物時，可W例如使用不同的免疫測定或者 在同時多元測定中單獨證實。
[0136] 在本發明方法中，當檢測不同性質的兩個標記物時，例如蛋白質標記物和mRNA標 記物，可W使用選自上述那些的兩種不同檢測方法。它們也也可W在系統反應條件下在同 一檢測介質中同時檢測，如專利申請WO 03/104490所述。運個專利申請中描述的檢測方法 包括如下步驟，該檢測方法包括同時檢測樣品中的雜交和免疫反應，可含有由至少一種核 酸和不同性質的至少一種其它配體組成的祀分析物：
[0137] (i)將已知體積的在反應緩沖液中稀釋的樣品沉積在用所述祀分析物的捕獲配偶 體預先包被的捕獲表面上，所述捕獲配偶體包含至少一個核酸探針和至少一個抗配體，
[013引（ii)在介于15°C-60°C之間的溫度下反應，
[0139] (iii)觀測因此獲得的雜交和免疫反應。
[0140] 所述生物學樣品可能需要特殊處理，因為其可能含有本發明方法尋找的腫瘤標記 物，或者另外其可能含有具有本發明方法尋找的標記物的循環腫瘤細胞，和/或能分泌本發 明方法尋找的標記物的循環腫瘤細胞。
[0141] 因此，根據本發明的一個實施方案，對生物學樣品進行預處理W分離所述液體中 含有的循環腫瘤細胞。
[0142] 短語"分離循環腫瘤細胞"是指獲得富含循環腫瘤細胞的細胞級分。
[0143] 可W通過如下方式對生物學樣品進行處理W分離循環腫瘤細胞:在流式細胞儀中 進行細胞淘選，在Ficoll上富集，用特異性抗體包被的磁珠富集，或者使用本領域技術人員 已知的特異性富集的任何其它方法。
[0144] 在血液作為生物學樣品的情況中，循環腫瘤細胞可W通過如下技術分離，即在 Ficol 1上分離細胞，組合使用與磁珠結合的抗-CD45抗體耗竭血細胞(Dynal Biotech ASA, Norway)。
[0145] 可W通過如下方式使用分離自生物學樣品的循環腫瘤細胞直接進行本發明方法 中探求的腫瘤標記物檢測，即在通過細胞離屯、涂片器使循環腫瘤細胞沉積在載玻片上之 后，例如通過用本發明方法尋找的腫瘤標記物的抗體對運些細胞進行免疫細胞化學標記。 也可W在循環腫瘤細胞中直接進行本發明方法尋找的腫瘤標記物的檢測，使用如M自t自zeau 等69所述的流式細胞術進行。
[0146] 在運些條件下，所述循環細胞可W在一定條件下處理，W使其能在所述細胞內部 阻斷本發明方法尋找的腫瘤標記物。運種處理由1曰*山611等?描述。
[0147] 在使得細胞膜可滲透W使特異于本發明方法尋找的標記物的結合配偶體能進入 細胞之后，進行本發明方法尋找的腫瘤標記物的檢測。
[0148] 基于循環細胞直接檢測本發明方法中使用的腫瘤標記物也可W通過化ISPOT方法 進行，例如通過本
【申請人】申請的專利申請WO 03/076942中描述的方法進行。運種方法是檢 測和/或量化生物學樣品的循環腫瘤細胞，該細胞在體外能釋放或分泌一或多種腫瘤標記 物，所述方法包括如下步驟：
[0149] (i)使一定量的所述細胞沉積于培養表面的底部，該底部附著了特異于所述腫瘤 標記物的至少一種結合配偶體，
[0150] (i i)在一定條件下培養所述細胞，使其釋放或分泌所述腫瘤標記物，該標記物被 免疫捕獲于所述培養表面的底部，
[0151] (iii)通過洗涂除去細胞，
[0152] (iv)加入特異于所述腫瘤標記物的至少一種標記的綴合物，及
[0153] (V)觀測由此獲得的標記。
[0154] 直接檢測腫瘤細胞中本發明方法使用的腫瘤標記物也可W在所述細胞的培養基 中進行，在一定條件下培養細胞，由此其分泌本發明方法中使用的腫瘤標記物，之后進行檢 測。
[0155] 釋放腫瘤標記物或者腫瘤標記物表達的培養條件是常規條件，如37°C濕化環境及 5%C02的條件。
[0156] 當生物學樣品是固體樣品時，腫瘤標記物的存在也可W在體內、在腫瘤原位示出。
[0157] 為了在體內在腫瘤中示出腫瘤標記物的存在，可W使用本領域技術人員已知的任 何成像技術。為此，所述腫瘤標記物的結合配偶體可W與成像示蹤劑結合。
[0158] 術語"結合配偶體與成像示蹤劑的結合"是指能通過本領域技術人員已知的任何 成像方法檢測的示蹤劑或者直接或間接產生可檢測信號的示蹤劑的附著。因此，所述示蹤 劑可W是放射性示蹤劑，如得-99。在運種情況中，具有原發癌或者轉移癌的器官將結合所 述腫瘤標記物及其示蹤劑。可W用特殊相機如丫-相機使由該器官發射的放射線成像。該設 備收集由放射性物質產生的閃爍，并因此可W觀測所述器官。
[0159] 在本發明另一方法中，所述示蹤劑可包含發射正電子的放射性物質(氣18)。然后 通過正電子發射斷層成像系統成像。
[0160] 在本發明另一優選方法中，腫瘤標記物的配偶體可W與納米粒子結合。所述納米 粒子可W例如是超磁性（supramagnetic)納米粒子，如用于指導細胞標記和通過核磁共振 成像技術在體內檢測的陰離子磁性納米粒子。它們也可W是金納米粒子。
[0161] 利用可W在體內檢測腫瘤標記物的本發明方法，可W觀測身體中結合腫瘤標記物 的結合配偶體的區域、產生腫瘤標記物的癌瘤，特別是在結腸直腸癌中，W及其遠離轉移癌 的位置和包含的淋己結的位置。
[0162] 本發明的方法不僅可用于結腸直腸癌的早期診斷，也可W用于結腸直腸癌的篩 選、治療隨診、預后及復發診斷，因為只有癌細胞分泌LEI，且其產生依賴于癌的級別，運些 方面組成了本發明的另一方面。
[0163] 本發明通過如下實施例W及附圖1-21得W更清晰地理解，運些實施例只是例證本 發明而不限制本發明之意。
[0164] -圖1是通過化ISA分析結腸直腸癌患者(CRC+)和健康個體(CRC-)血清中LEKng/ ml)的圖示，
[0165] -圖2是通過化ISA分析結腸直腸癌患者(CRC+)和健康個體(CRC-)血清中埃茲蛋白 (ng/ml)的圖示，
[0166] -圖3是通過化ISA分析結腸直腸癌患者(CRC+)和健康個體(CRC-)血清中酷化氨基 酸水解酶1( ng/ml)的圖示，
[0167] -圖4是通過化ISA分析結腸直腸癌患者（CRC+)和健康個體(CRC-)血清中レFABP (ng/ml)的圖示，
[0168] -圖5是通過化ISA分析結腸直腸癌患者（CRC+)和健康個體(CRC-)血清中I-FABP (pg/ml)的圖示，
[0169] -圖6是通過化ISA分析結腸直腸癌患者(CRC+)和健康個體(CRC-)血清中載脂蛋白 AI(jig/ml)的圖示，通過微滴定平板HJSA(圖6A)或者使用Lincoplex試劑盒（圖6B)，
[0170] -圖7是使用Linco多元試劑盒分析結腸直腸癌患者(CRC+)和健康個體(CRC-)血清 中載脂蛋白AlKiig/ml)的圖示，
[0171] -圖8是通過化ISA分析結腸直腸癌患者(CRC+)和健康個體(CRC-)血清中I-絲束蛋 白的RFV(相對巧光值)的圖示，
[0172] -圖9是通過化ISA分析結腸直腸癌患者(CRC+)和健康個體(CRC-)血清中的-微球 蛋白（ng/ml)的圖示，
[0173] -圖10是通過化ISA分析結腸直腸癌患者(CRC+)和健康個體(CRC-)血清中CEA(ng/ ml)的圖示，
[0174] -圖11是通過化ISA分析結腸直腸癌患者(CRC+)和健康個體(CRC-)血清中CA19-9 化/ml)的圖示，
[0175] -圖12是通過化ISA分析結腸直腸癌患者（CRC+)和健康個體（CRC-)血清中睪酬 (ng/ml)的圖示，
[0176] -圖13是通過化ISA分析結腸直腸癌患者(CRC+)和健康個體(CRC-)血清中E-巧粘 蛋白（ng/ml)的圖示，
[0177] -圖14是通過化ISA分析結腸直腸癌患者（CRC+)和健康個體（CRC-)血清中PAPl (ng/ml)的圖示，
[017引-圖15是通過化ISA分析結腸直腸癌患者(CRC+)和健康個體(CRC-)血清中半乳凝 素-3的RFV的圖示，
[0179] -圖16是通過化ISA分析結腸直腸癌患者(CRC+)和健康個體(CRC-)血清中LDH(ng/ ml)的圖示，
[0180] -圖17是通過化ISA分析結腸直腸癌患者(CRC+)和健康個體(CRC-)血清中蛋白酶 體20S(ng/ml)的圖示，
[0181] -圖18是通過化ISA分析結腸直腸癌患者(CRC+)和健康個體(CRC-)糞便中酷化氨 基酸水解酶1 (ng/ml)的圖示，
[0182] -圖19是通過化ISA分析結腸直腸癌患者(CRC+)和健康個體(CRC-)糞便中半乳凝 素-3的RFV的圖示，
[0183] -圖20是通過化ISA分析結腸直腸癌患者(CRC+)和健康個體(CRC-)糞便中蛋白酶 體20S的RFV的圖示，
[0184] -圖21是對LEI、埃茲蛋白和半乳凝素-3進行化ISPOT測定的示意圖，示出Caco-2、 HT-29和HT29-B6的每IO6個癌細胞的斑點數目。
[01化]實施例1:編碼腫瘤標記物的基因的克隆與重組蛋白質的表達
[0186] l.cDNA擴增與克隆
[0187] 將化CO-2結腸直腸癌細胞系在DMEM培養基中培養，該培養基含有211^的心谷氨酷 胺，不含FCS(胎牛血清）（均來自Gibco)。
[018引為了克隆LEI、kFABP和Ga^3基因，從IO8個化CO-2細胞沉淀中提取信使RNA，使用 Invitrogen !^istTrack 2.0試劑盒Kat.No.45-0019)根據廠商提供的方案進行。在一個步 驟中進行逆轉錄和PCR，使用450ng的Caco-2 mRNA及Superscript III One Step RT-PCR System試劑盒（Invitrogen Cat.No. 12574-018)W及使用Platinum Taq DNA聚合酶，根據 廠商提供的方案進行。用于基因擴增的PCR引物在表1中提供。
[0189]表1 [01901
[0191] 將獲得DNA片段通過使用TA克隆試劑盒（Invitrogen Cat.No.K4520-01)克隆進載 體pCR2.1T0P0(LE巧日Gal-3)中，或者克隆進用Bsm B巧肋ba r消化后的來自Origene的載體 PCMV6-XL4化-FABP)中。對質粒進行測序，W核實CDNA確實符合預期序列。
[0192] 對于編碼酷化氨基酸水解酶1的基因的克隆，使用來自Qiagen的RNA Easy Mini試 劑盒根據廠商提供的方案從IO8個化CO-2細胞沉淀中提取總RNA。使用IOng的化CO-2RNA和 Superscript II酶（Invitrogen)根據廠商提供的方案進行逆轉錄。該逆轉錄引物是oligo (肌)。
[0193] 得自運個反應的cDNA用作PCR中模板，使用AccuPrime Pf X試劑盒（Invitrogen Cat.No. 12344-024)根據廠商提供的方案進行反應。所述PCR引物是:ACY-lFwd2(SEQ ID No.7:5 '-GCGAATTCTTTMGAAGGAGATATACATATGACGAGCAAAGGTCCG GAAGAGGAGCACCCATCG-3 '） 和ACY-IRev(沈Q ID No.8:5 '-GCAAGCTTCAGCTGTCACTGGGCAGGGC-3 '）。
[0194] 在運些條件下，可W擴增1.3kb片段，將其克隆進Zero Blunt TOPO PCR克隆試劑 盒型克隆載體（Invitrogen Cat.No.K2820-20)中。對運個質粒測序W核實CDNA確實符合預 期序列。
[0195] 通過化學合成方法獲得含有I-FABP開放讀框的如下DNA片段(SEQ ID No.9)，該合 成由Geneart公司進行。
[0196] SEQ ID No.9:
[0197] GGTACCGAATTCCGCGTTTGACAGCACTTGGAAGGTAGACCGGAGTGAAAACTATGACAAGTTCATGGAAAAAATGG GTGTTAATATAGTGAAAAGGAAGCTTGCAGCTCATGACAATTTGAAGCTGACAATTACACAAGAAGGAAATAAATTC ACAGTCAAAGAATCAAGCGCTTTTCGAAACATTGAAGTTGTTTTTGAACTTGGTGTCACCTTTAATTACAACCTAGC AGACGGAACTGAACTCAGGGGGACCTGGAGCCTTGAGGGAAATAAACTTATTGGAAAATTCAAACGGACAGACAATG GAAACGAACTGAATACTGTCCGAGAAATTATAGGTGATGAACTAGTCCAGACTTATGTGTATGAAGGAGTAGAAGCC AAAAGGATCTTTAAAAAGGATTCTAGAGTCGACGAGCTCo
[0刪 2.表達載體構建
[0199] 將編碼LE巧日半乳凝素-3的基因亞克隆進原核表達載體PMR78"中，W及將kFABP 基因克隆進載體祀T3d(化W ^igland Biolabs)中。使用質粒PCR2.1T0P0-LEI、pCR2. ITOPO- Gal-3和PCMV6-LFABP作為模板通過PCR導入克隆所需的限制位點。所述PCR酶是Promega 押U DNA聚合酶，PCR反應根據廠商指導進行，引物示于表2中。
[0200] 表 2
[0201]
[0202]將含有編碼LEI或半乳凝素-3的開放讀框的PCR產物用Eco RI和化nd III限制酶 消化。將片段導入用相同的酶限制的載體PMR78中（質粒pMR-LEI和pMR-Gal-3)。載體PMR78 含有與表達的蛋白質符合讀框的6-組氨酸序列，使得可W通過金屬馨合親和層析純化。將 kFABP PCR產物克隆進載體祀T3d中化O I和Bam HI限制位點。
[0203]對于酷化氨基酸水解酶I，將TOPO克隆載體直接用Eco RI和化nd III限制酶消化， W產生含有acy 1開放讀框的1.3kb片段，其被導入pStabyUEurogentec)中。該重組質粒被 稱作 pS 化 by I-ACY。
[0204] 對于I-FABP,將由Geneart提供的克隆載體用Eco R巧日Sal I限制酶消化，W產生 含有編碼序列的大約400bp片段，將其導入載體pMRCH79(衍生自載體PMR78，bioM自rieux) 中。該重組質粒被稱作pMRCH-IFABP。
[0205]可W分別表達與GST(谷脫甘膚S-轉移酶）融合的埃茲蛋白和I-絲束蛋白的質粒 pGEX-埃茲蛋白和pGEX-I-絲束蛋白由Institut Curie提供。
[020y 3.重組蛋白質表達與純化
[0207] 將產生重組腫瘤標記物的表達質粒導入大腸桿菌化21及其衍生物（Shatagene) 中。在室溫搖動培養。每種蛋白質的精確培養條件示于表3中。IPTG是異丙基-0-D-1-硫代半 乳糖酶。
[0208] 將細菌沉淀置于2XPBS(憐酸鹽緩沖鹽水)緩沖液中，并Wl.化bar通過細胞粉碎 機(Constant System)。將裂解產物在3000g在4°C離屯、30分鐘。上清含有可溶蛋白質。所述 沉淀含有包涵體。增溶包涵體的緩沖液根據所述蛋白質而定。
[0209] 對于LEI，在含有5mL的Ni-NTA-Sepharose樹脂(Qiagen)的柱上使用可溶分級分離 法進行純化，蛋白質用含有450mM咪挫的2XPBSpH7.5洗脫。
[0210] 對于半乳凝素-3,將包涵體在含有IM尿素的2 X PBS中溶解，經過5mL的Ni-NTA- S巧harose樹脂柱(Qiagen)，用含有450mM咪挫和IM尿素的2XPBS pH 7.5洗脫6日^3蛋白。
[0211] 對于kFABP，使用可溶分級分離法進行純化，使用來自Macherey-Nagel的Ni-IDA 試劑盒。
[0^2]表 3 「nodol
[0214] 對于GST-埃茲蛋白，通過GST親和層析，使用在含有8M尿素和IOmM DTT的IOOmM Tris緩沖液中溶解的包涵體進行純化。使用含有5mL谷脫甘膚瓊脂糖4快速流動凝膠 (Amersham)的層析柱。平衡和洗涂緩沖液是含有0.05%Tween 20的2XPBS。洗脫緩沖液是 含有20mM還原的谷脫甘膚的50mM Tris-HCKpH 8)。
[0215] 對于酷化氨基酸水解酶1，將培養物的可溶級分經過Amersham化化ap Q FF柱，并 且使用0.3M化CKpH 7.5)洗脫ACY-I蛋白。由于一些其它蛋白質在運些條件下被共洗脫， 因此繼續在疏水性相互作用柱化IC化enyl HP，Amersham)上進行純化。使用0.5M化CKpH 7)洗脫ACY-I蛋白。
[0216] 重組GST-I-絲束蛋白蛋白由Institut化rieW純化形式提供。
[0217] 重組巧網蛋白蛋白由Proteus Services for Indust;ry(Dijon,France)公司生 產。編碼巧網蛋白的序列通過化學合成方法獲得。
[0218] 實施例2:腫瘤標記物的單克隆抗體的產生
[0219] 1.動物模型
[0220] 對6-8周齡的雌性BALB/c化-2d)小鼠在第一次免疫時進行免疫試驗。
[0。1] 2.免疫原和免疫
[0222]為了增加在小鼠中獲得的免疫應答W及為了能產生單克隆抗體，根據實施例1所 述的程序產生重組蛋白質形式的腫瘤標記物。LDH蛋白得自SciPac公司（化t.No. 103-133)。 運些蛋白質與Freund's佐劑(Sigma)混合，所述佐劑W油包水乳狀液形式制備，且已知其具 有良好的免疫原性。每種腫瘤標記物免疫3只小鼠。小鼠在第0、2和4周連續接受3次IOiig劑 量。所有注射均是皮下注射。第一次注射給予與完全Freund's佐劑的混合物，隨后兩次注射 給予與不完全Freund'S佐劑的混合物。在第一次注射后D50-D70之間，通過靜脈內注射10化 g該重組蛋白質再次刺激體液應答。 帷引 3.監測體液應答的出現
[0224] 為了監測抗體的出現，定期從小鼠取血樣。使用化ISA檢測抗-腫瘤標記物抗體的 存在。感興趣的蛋白質用于捕獲（化g/孔）；飽和后，使抗原與不同稀釋度的檢測血清反應 (在37°C保溫1小時）。血清中特異性抗體的存在通過使用與堿性憐酸酶綴合的結合尋找的 抗體的Aff iniPure山羊抗-小鼠 I邑G抗體化+L, Jackson Immunoresearch, Cat no. 115-055- 146)(0.化g/well)表明。
[0225] 4.單克隆抗體的產生
[0226] 在最后一次注射每種腫瘤標記物3天后，處死一只免疫的小鼠。取血液和脾。將得 自脾的脾細胞與Sp2/0-Agl4骨髓瘤細胞一起培養，W使其融合并變成永生化，根據K6hl巧 and MiIstein所述方案73進行。在保溫12-14天之后，篩選獲得的雜交瘤上清W確定抗腫 瘤標記物抗體的存在，使用在運個實施例第3點描述的ELISA測定。當GST融合蛋白用作免疫 原時，針對GST的克隆通過使用未結合的GST捕獲進行化ISA篩選得W消除。根據限制稀釋技 術將陽性雜交瘤集落亞克隆兩次，運種技術為本領域技術人員熟知。 帷7] 5.通過免疫印跡鑒定單克隆抗體
[0。引針對各種腫瘤標記物獲得的單克隆抗體列于表4中。通過Western印跡技術分析運 些單克隆抗體。
[0229]表 4
[0230]
[0231] 3丄乃枝子
[0232] 制備Caco-2和HT-29細胞培養提取物，通過用含有8.3M尿素、2M硫脈、4%3-[(3-膽 胺丙基）二甲氨基]-1-丙橫酸（CHAPS)、IOOmM DTT、2%Serval^e 4-9(Serva,Heide化erg, Germany)和O.lg/1化ange G的60化1水溶液溶解細胞沉淀，然后根據NuPAGE Novex凝膠樣 品制備方案（Invitrogen)進行處理。為了獲得組織提取物，使用手術刀切下GHBD001、 0冊0004和化5?109患者的腫瘤和粘膜活檢組織，然后使用50-郵1日(11(3〇113^及11111含有 2.5mM抓TA和蛋白酶抑制劑（片劑，Roche)的PBS緩沖液在Medimachine系統（BeCton Dickinson)中提取10次。集合運些IOml的細胞懸浮液，制成25ml，然后在600g離屯、15分鐘。 上清相應于根據NuPAGE Novex凝膠樣品制備方案處理的組織提取物。使用還原的樣品，最 終總蛋白質濃度為〇.4mg/ml。在NuPAGE Novex Bis-Tris 4-12%凝膠上沉積體積為20iil/ 孔，使用MOPS運轉緩沖液。在遷移(200V，1小時)及轉移至PVDF膜(400mA，45分鐘）之后，通過 用氨基黑染色評定轉移物的性質。
[0233] 將該膜用在TNT(15mM Tris、0.14M 化Cl、0.5%Tween 20，pH 8)溶液中的5%脫脂 乳(R自gilait)在室溫飽和1小時。在飽和后，將該膜與在飽和溶液中稀釋為lOiig/ml的各種 檢測抗體一起保溫1小時。在用TNT漂洗后，將該膜在室溫與在飽和溶液中稀釋為1:5000的 抗小鼠-辣根過氧化物酶綴合物(&t No. 115-035-062,Jackson Immunoresearch)保溫1小 時。在漂洗后，使用Subshate Supersignal West Dura Extended試劑盒（Cat No.；34076, Pierce)根據推薦的使用指導進行顯影。
[0234] 使用來自Biorad的VersaDoc成像系統測量該膜上的化學發光信號。基于Western 印跡成像，使用Quantity化e軟件(Bio-Rad)評估相應于各種腫瘤標記物的條帶的體積。所 述體積相應于條帶的表面積乘W化學發光信號的強度。
[0235] 5.2.結果
[0236] Western印跡結果示于表5,表中示出了Western印跡分析的相應于感興趣的腫瘤 標記物的條帶的體積，其是檢測的各個樣品的函數。運些結果示出檢測的腫瘤標記物確實 由化CO-2和HT-29結腸癌細胞系表達，而且也在組織中表達，運些根據使用得自該患者的腫 瘤和粘膜的提取物示出。可W對比使用抗體在樣品上獲得的信號強度與使用其它樣品和相 同抗體獲得信號強度。所用技術使得可W證實組織（非遠離樣品）中所述標記物的存在與 否，W及抗體對于標記物的特異性。運個技術不用于運個實施例的遠離樣品中，因為其不可 W推斷遠離樣品中腫瘤標記物的存在與否，也不可W確定所述樣品中所述腫瘤標記物的濃 度是否增加或降低。此外，使用的實驗方案不能對比一種抗體的反應性與另一種抗體的反 應性。
[0237]表 5 row 只 1
[0239] NT:未檢測。
[0240] 5.3.抗I-絲束蛋白的單克隆抗體
[0241] 在細抓004患者中，8C8巧抗體未使得對應I-絲束蛋白的條帶顯色或者僅微弱顯 色。運些樣品中I-絲束蛋白的存在可W通過使用例如8G2D2抗體證實，該抗體在印跡中對于 I-絲束蛋白具有較好親和性。
[0242] 由于I-絲束蛋白是包含具有70% W上同源性的兩個其它同種型化-絲束蛋白和T- 絲束蛋白）的蛋白質家族成員，我們檢測了獲得的單克隆抗體的所有克隆與GST-絲束蛋白- L和GST-絲束蛋白-T蛋白質（Insti化t化rie提供)的反應性。在運個篩選結束時，我們選擇 與其它家族成員不具有任何交叉反應性的克隆3D11D10、8C8C5、3A3肥和8G2D2。運些抗體確 實特異于I-絲束蛋白同種型。
[02創實施例3:腫瘤標記物的血清測定
[0244] 1.患者和樣品
[0245] 根據2個化riet-law協議，血樣收集自分布于法國的8個臨床中屯、網。
[0246] 為了獲得血清，將該血樣置于干燥試管中。為了獲得血漿，將該血樣置于邸TA試管 中。在凝固后，將試管W1 OOOg離屯、10分鐘，取出血清，等份并在-80°c膽存。將血漿試管W 1000 g直接離屯、10分鐘，取出血漿，等份并在-80°c膽存。樣品完全記錄了病人的病史。
[0247] 2丄EI腫瘤標記物的血清測定
[024引使用實施例2中描述的抗體W及使用VldciS'9自動化設備(bioM紅ieux)進行化ISA W測定LEI蛋白。為此，使用Vidas'"''皿S Ag叫tra試劑盒(bioM紅ieux，Cat.No.30315)的試 劑進行化ISA。該試劑如相應的信息頁(ref.ll728D-FR-2005/05)所述使用，具有如下修改： [0249] 1.離屯、管用lOiig/ml濃度的捕獲抗體IOEmi敏化。
[02加]2.HBs Ag叫化a cartridge第二個孔的內容物用30化1在Vi舶s'A'皿S Ag叫化a 試劑盒的第二個孔的緩沖液(具有山羊血清和lg/1疊氮化鋼的緩沖液）中稀釋為化g/ml的 與生物素結合的掲示抗體21B10A5替換。
[0巧1] 3.將血清、血漿或者糞便樣品巧化1)在皿S Ag叫tra cartridge的第二個孔中直 接稀釋，所述樣品是純的或者在Vidas'Wi皿S Ag Ultra試劑盒的第二個孔的緩沖液(具有山 羊血清和lg/1疊氮化鋼的緩沖液)中1/20稀釋。
[0巧2] 4.使用Vidas、:自動化設備和皿S Ag叫tra試劑盒的方案進行化ISA。
[0253] 5.在減去背景噪音之后獲得粗略值(crude value)形式的結果(在反應之前讀取 底物）。
[0254] 通過測定重組蛋白質形式的腫瘤標記物的濃度范圍制定標準曲線。繪制的該標準 曲線的X軸是報道的腫瘤標記物濃度，y軸是由Vidas'i^'讀取的信號（RFV或者相對巧光數 值）。檢測的體液(血液、血清、血漿、糞便）中存在的腫瘤標記物的濃度通過報道的相應于 Vidas?讀取的RFV信號的濃度計算。表6給出了在Vidas自動裝置上通過ELISA測定患者的 血清LEI的結果。
[0巧引 表6
[0 巧 6;
[0 巧 7]
[0258] a: CRC+:結腸直腸癌患者;CRC-:健康個體
[0259] b:?i:組織侵潤階段(T)、淋己結侵潤(N)及遠處侵潤(轉移，M)
[0260] 分析患者獲得的量示于圖1。在該圖中，注意到IV期結腸直腸癌患者的3份血清及 III期結腸直腸癌患者的1份血清示出其血清LEI的量明顯增加。
[0261] 3.埃茲蛋白腫瘤標記物的血清測定
[0262] 使用實施例2中描述的抗體W及使用Vidas?自動化設備(bioM紅ieux)進行化ISA W測定埃茲蛋白蛋白。為此，使用Vidas?HBs Ag Ultra試劑盒（bioM自rieux, 0曰1.齡.30315)的試劑進行化154。該試劑如相應的信息頁^6'.117280-。3-2005/05)所述 使用，具有如下修改：
[0263] 1.離屯、管用30iig/ml濃度的捕獲抗體4A9冊敏化。
[0264] 2.皿S Ag叫化a cartridge第二個孔的內容物用30化1在Vidas嗎ffls Ag叫化a 試劑盒的第二個孔的緩沖液(具有山羊血清和lg/1疊氮化鋼的緩沖液）中稀釋為化g/ml的 與生物素結合的掲示抗體4A7A6C1替換。
[0265] 3.將血清、血漿或者糞便樣品巧化1)在皿S Ag叫tra cartridge的第二個孔中直 接稀釋。
[0266] 4.使用Vidas?自動化設備和皿S Ag叫tra方案進行化ISA，其中樣品與捕獲抗體 和掲示抗體的保溫步驟進行100次循環。
[0267] 5.在減去背景噪音之后獲得粗略值(crude value)形式的結果(在反應之前讀取 底物）。
[0268] 檢測的體液(血液、血清、血漿、糞便）中存在的腫瘤標記物的濃度通過第2段關于 測定LEI所述方法計算。
[0269] 分析患者獲得的量示于圖2。在該圖中，注意到IV期結腸直腸癌患者的3份血清示 出其血清埃茲蛋白的量明顯增加。 腳0] 4.酷化氨基酸水解酶1腫瘤標記物的血清測定
[0271] 使用實施例2中描述的抗體W及使用Vidas?自動化設備(bioM紅ieux)進行化ISA W測定酷化氨基酸水解酶1蛋白。為此，使用Vi.das?HBs Ag Ultra試劑盒（bioM自rieux, 0曰1.齡.30315)的試劑進行化154。該試劑如相應的信息頁^6'.117280-。3-2005/05)所述 使用，具有如下修改：
[0272] 1.離屯、管用20iig/ml濃度的捕獲抗體2A7F6敏化。
[027；3] 2.皿S Ag 叫tra cartridge第二個孔的內容物用30化1 在Vickis@?s Ag 叫tra 試劑盒的第二個孔的緩沖液(具有山羊血清和lg/1疊氮化鋼的緩沖液）中稀釋為化g/ml的 與生物素結合的掲示抗體11H7D9替換。
[0274] 3.將血清、血漿或者糞便樣品（IOOiil)在皿S Ag叫化a cartridge的第二個孔中 直接稀釋。
[0275] 4.使用Vidas、''|自動化設備和皿S Ag叫tra方案進行化ISA，其中樣品與捕獲抗體 和掲示抗體的保溫步驟進行100次循環。
[0276] 5.在減去背景噪音之后獲得粗略值(crude value)形式的結果(在反應之前讀取 底物）。
[0277] 檢測的體液(血液、血清、血漿、糞便）中存在的腫瘤標記物的濃度通過第2段關于 測定LEI所述方法計算。
[0278]分析患者獲得的量示于圖3。在該圖中，注意到II期結腸直腸癌患者的1份血清、 III期結腸直腸癌患者的1份血清W及IV期結腸直腸癌患者的2份血清示出血清酷化氨基酸 水解酶1的量明顯增加。 腳9] 5丄-FABP腫瘤標記物的血清測定
[0280] 使用Hycult Biotechnology公司銷售的ELISA試劑盒測定人I^-FABP蛋白 (化t.No.HK404)。運個試劑盒可W量化細胞培養上清或者血清、血漿或尿液中的L-FABP蛋 白，W確定肝臟損害的存在。我們遵循廠商推薦的程序，有兩處修改:保溫在37°C而不是在 室溫進行，在測定之前血清稀釋為1/1〇dL-FABP蛋白的測定可W通過本領域技術人員熟知 的備選技術進行。
[0281] 圖4示出運項分析的結果。在檢測的血清中，141個結腸直腸癌患者中的41個患者 的血清kFABP濃度高于17ng/ml，而在對照組中，無個體的血濃度超過運個數值。 在運41個患者中，I期結腸直腸癌患者8個、II期結腸直腸癌患者8個、III期結腸直腸癌患者 13個，IV期結腸直腸癌患者12個。觀測的141個結腸直腸癌患者的平均血濃度是 16.6 ± 1.3ng/ml。112個健康個體的平均值為6.6 ± 0.化g/ml (陰性對照）。運個差異具有顯 著統計學意義(P<〇.0001，單側t-檢驗，使用Welch's校正不等方差）。
[0巧。6.1-FABP腫瘤標記物的血清測定 惦削使用Hycult Biotechnology公司銷售的ELISA試劑盒，測定人I-FABP蛋白 (化t. No . HK406)。運個試劑盒可W量化細胞培養上清或者血清、血漿或尿液中的I-FABP蛋 白，W確定小腸中缺血性損害的存在。我們遵循廠商推薦的程序。可W通過本領域技術人員 熟知的備選技術測定I-FABP蛋白。
[0284]圖5示出運項測定的結果。在檢測的血清中，40個結腸直腸癌患者中有15個患者的 血清I-FABP濃度高于40pg/ml，而在對照組中，24個個體中僅2個個體超過運個數值。更明顯 地，I期結腸直腸癌患者的3份血清、III結腸直腸癌患者的2份血清W及IV期結腸直腸癌患 者的1份血清的血清I-FABP濃度高于10化g/ml。在CRC-對照組中未發現高于此數值的濃度。 [0巧引 7.載脂蛋白AI腫瘤標記物的血清測定
[0286] 通過兩種不同的免疫測定技術測定血清載脂蛋白AI。首先，使用微滴定平板夾屯、 ELISA。將96孔平板用Iiig/孔的抗-Apo AI單克隆抗體-克隆1404 (Biodesign 化1.齡.^5404)包被。在用?85-0.05%1'*661120。85-1')洗涂3次后，將該平板用在?85-1'中 10 %奶粉在37 °C飽和1小時。將該平板再于PBS-T中洗涂3次，將檢測血清樣品的10化1標準 范圍稀釋液或者I(K)山的1/100 000稀釋液沉積于平板上，將該平板在37°C保溫2小時。所述 標準范圍是通過將ApoAI蛋白（Biodesi即Cat.No.A50620H)在PBS-T，BSAl%(1.6- lOOng/ml)中稀釋而制備。在用PBS-T洗涂3次后，加入0.化g/孔與辣根過氧化物酶結合的多 克隆檢測抗體(Biodesi即Cat.No.K45452P)，將該平板在37°C保溫2小時。再次用PBS-T洗 涂3次后，加入10化1/孔的化巧IA底物(BD)。20分鐘后，當發生生色時，用2N硫酸結束反應， 在450nm測量吸光度。
[0287] 圖6A示出運項測定的結果。我們證實結腸直腸癌患者中Apo AI的血清濃度降低。 38個I期-IV期CRC患者中的平均濃度為675±36iig/ml，而在27個健康個體(對照組）中其平 均值更高：1040±39iig/ml。運個差異具有顯著統計學意義(P<0.0001，單側t-檢驗）。作為對 比，使用夾屯屯LISA技術，在13個肝癌患者中Apo Al的平均血清濃度為1175±87iig/ml。血清 濃度降低證實Apo AI因此是結腸直腸癌的特異性標記物，可W通過免疫測定證實運種降 低。
[0288] 使用的第二種測定技術是Linco公司銷售的多元測定法，其可W在同一樣品中同 時測定一些載脂蛋白，包括AI和AII(化t.No.AP0-62K).。使用廠商推薦的程序進行。
[0289] 圖6B示出運項測定的結果。使用該第二種技術證實CRC患者中Apo AI血清濃度降 低。34個I期-IV期CRC患者中Apo AI平均濃度為768±30μg/ml，而在17個健康個體(對照組） 中其平均值更高：1194±5Uig/ml。運個差異具有顯著統計學意義(P<0.0001，單側t-檢驗）。 [0巧0] 8.載脂蛋白AII腫瘤標記物的血清測定
[0291]使用Linco多元試劑盒測定血清載脂蛋白All。圖7示出運項測定的結果。我們證實 結腸直腸癌患者中Apo AII的血清濃度降低。34個I期-IV期CRC患者中Apo AII平均濃度為 170 ± 1 liig/ml，而在17個健康個體(對照組）中其平均值更高:277 ± 16iig/ml。運個差異具有 顯著統計學意義(P<〇. OOOl，單側t-檢驗）。
[0巧。9.1-絲束蛋白腫瘤標記物的血清測定
[0293] 使用實施例2中描述的抗體W及使巧Vidas?自動化設備(bioM紅ieux)進行化ISA W測定I-絲束蛋白蛋白。為此，使用Vi.da.S?HBs Ag Ultra試劑盒（bioM自rieux, 0曰1.齡.30315)的試劑進行化154。該試劑如相應的信息頁^6'.117280-。3-2005/05)所述 使用，具有如下修改：
[0294] 1.離屯、管用15iig/ml濃度的捕獲抗體3D11D10敏化。
[02巧]2.HBs Ag叫化a cartridge第二個孔的內容物用30化1在Vidas*皿S Ag叫化a 試劑盒的第二個孔的緩沖液(具有山羊血清和lg/1疊氮化鋼的緩沖液）中稀釋為化g/ml的 與生物素結合的掲示抗體8C8C5替換。
[0296] 3.將血清、血漿或者糞便樣品（IOOlil)在皿S Ag叫化a cartridge的第二個孔中 直接稀釋。
[0巧7] 4.使用Vidas'";自動化設備和皿S Ag叫tra方案進行化ISA。
[0298] 5.在減去背景噪音之后獲得粗略值(crude value)形式的結果(在反應之前讀取 底物）。
[0299] 檢測的體液(血液、血清、血漿、糞便）中存在的腫瘤標記物的濃度通過第2段關于 測定LEI所述方法計算。
[0300] 分析患者獲得的量示于圖8。在該圖中，注意到檢測的結腸直腸癌患者的2份血清 示出血清I-絲束蛋白的量明顯增加。
[030。10. B組腫瘤標記物的血清測定
[0302] 使用本
【申請人】的Viclas?e2-微球蛋白、巧das磨CEA、Vidas愈CA19-9?和VMas愈 睪酬測定試劑盒根據每個試劑盒的程序分別測定62-微球蛋白、CEAXA19-9和睪酬腫瘤標 記物。
[0303] 使用E-巧粘蛋白EIA試劑盒（Takara Biochemicals,Tokyo,Japan)根據該試劑盒 程序測定E-巧粘蛋白。
[0304] 使用PANCREPAP化ISA試劑盒(DynaBio,MarseUle,France)根據該試劑盒程序測 定再生膜島衍生蛋白3a蛋白，其也被稱作膜腺炎相關蛋白（PAPl)。
[0305] 使用實施例2中描述的抗體測定半乳凝素-3和LDH蛋白。使用專利EP0434670中描 述的抗體測定蛋白酶體20S。為此，使用Vidas?自動化設備(bioM紅ieux)和Vidas?皿S Ag 叫化曰試劑盒化;[01紅1611義,化1:.齡.30315)的試劑進行化154測定。該試劑如相應的信息頁 (ref.ll728D-FR-2005/05)所述使用，具有如下修改：
[0306] 1.離屯、管用5-30iig/ml濃度的捕獲抗體敏化。
[0307] 2.皿S Ag叫tra cartridge第二個孔的內容物用30化1在具有山羊血清和1邑八疊 氮化鋼的緩沖液中稀釋為化g/ml的與生物素結合的掲示抗體替換。
[0308] 3.如果需要，在第二個孔的緩沖液中稀釋之后，將血清、血漿或者糞便樣品（IOOii 1)在皿S Ag叫tra cartridge的第二個孔中直接稀釋。
[0309] 4.使用Vidas^i自動化設備和皿S Ag Ultra方案進行化ISA。樣品與捕獲抗體和掲 示抗體保溫的步驟進行14-100次循環。
[0310] 5.在減去背景噪音之后獲得粗略值(crude value)形式的結果(在反應之前讀取 底物）。
[0311] 檢測的體液(血液、血清、血漿、糞便）中存在的腫瘤標記物的濃度通過第2段關于 測定LEI所述方法計算。各個腫瘤標記物的測定條件示于表7。
[0：312]表 7
[0314] 分析患者獲得的的-微球蛋白、CEAXA19-9、睪酬、E-巧粘蛋白、再生膜島衍生蛋白 3曰、半乳凝素-3、LDH和蛋白酶體20S腫瘤標記物的量分別示于圖9-17。
[0315] 結腸直腸癌患者的3份血清示出血清02-微球蛋白的量增加。
[0316] 結腸直腸癌患者的10份血清示出血清CEA的量增加。更明顯地，III期結腸直腸癌 患者的1份血清W及IV期結腸直腸癌患者的7份血清示出血清CEA的量明顯增加。
[0317] 結腸直腸癌患者的9份血清示出其血清CA 19-9的量增加。更明顯地，III期結腸直 腸癌患者的1份血清W及IV期結腸直腸癌患者的7份血清示出血清CA 19-9的量明顯增加。
[0318] 結腸直腸癌患者的10份血清示出血清睪酬的量降低。更明顯地，II期結腸直腸癌 患者的1份血清和III期結腸直腸癌患者的1份血清W及IV期結腸直腸癌患者的2份血清示 出血清睪酬的量降低。
[0319] 結腸直腸癌患者的2份血清示出血清再生膜島衍生蛋白3a的量增加。
[0320] IV期結腸直腸癌患者的4份血清、III期結腸直腸癌患者的2份血清W及II期結腸 直腸癌患者的1份血清示出血清半乳凝素-3的量明顯增加。 陶]實施例4:組合腫瘤標記物的血清測定的應用
[0322] 本
【申請人】在實施例3中掲示了在某些結腸直腸癌患者血流中可W觀測到腫瘤標記 物的量異常升高或者異常降低。令人驚奇地，在同一患者中未系統地觀測兩個指定標記物 在血液中的量的增加或降低。結果，組合一些腫瘤標記物可W增加經鑒別患有結腸直腸癌 的患者數目。因此，A患者也許存在一或多種腫瘤標記物(X組)升高或降低，X組的所述標記 物在B患者中也許正常;在運個B患者中，一或多種其它腫瘤標記物(Y組)也許升高或降低，Y 組的所述標記物在A患者中也許正常。
[0323] 本
【申請人】測定的各個腫瘤標記物因此可W通過本領域技術人員熟知的各種數學 算法組合。例如非限制性地進行如下方法：
[0324] 1.設定每個腫瘤標記物的闊值。
[0325] 2.當結腸直腸癌患者血液中腫瘤標記物的量增加時，將針對指定患者獲得的血液 中的量除W其闊值。當結腸直腸癌患者血液中腫瘤標記物的量降低時，將針對指定患者獲 得的血液中的量變成倒數并乘W其闊值。
[0326] 3.當"血液中的量除W闊值"高于1時，將該比率乘W系數，例如10。由此獲得的數 值稱作所研究的患者、考慮的腫瘤標記物的"得分"。
[0327] 4.累加各個腫瘤標記物的得分，將其用特異于每個標記物的因子進行加權。在下 文實施例中，所有加權因子均設定為1。
[0328] 5.將得分總和除W累加得分總數，由此獲得的數值稱作"總得分"。
[0329] 6.當其總得分高于闊值時，診斷該患者患有結腸直腸癌。
[0330] 包含LEI的選擇的2、4和8個標記物的總得分在表8中示出。
[0331] LEI與CEA腫瘤標記物的組合因此對于同一組的24個患者可W獲得12個結腸直腸 癌患者增加的總得分"2"，而單獨測定LEI或CEA分別僅示出4個或10個患者的量增加。
[0332] LEI、的-微球蛋白、氨基酸水解酶1與CEA腫瘤標記物的組合因此對于同一組24個 患者可W獲得16個結腸直腸癌患者增加的總得分"4"，而單獨測定LEI、的-微球蛋白、酷化 氨基酸水解酶1或CEA分別僅示出4、4、4和8個患者的量增加。
[0333] LEI、的-微球蛋白、酷化氨基酸水解酶1、蛋白酶體20S、L-FABP、PAP、E-巧粘蛋白和 CEA腫瘤標記物的組合因此對于同一組24個患者可W獲得19個患者增加的總得分％'，而單 獨測定LEI、的-微球蛋白、酷化氨基酸水解酶-1、蛋白酶體20S、kFABP、PAP、E-巧粘蛋白或 CEA分別僅示出4、4、4、8、6、2、2和10個患者的量增加。
[0334] 表 8
[0337]
[0338] a: LEI 與 CEA 的組合
[0339] b:LEI、的-微球蛋白、酷化氨基酸水解酶I和CEA的組合
[0340] C: LEI、的-微球蛋白、酷化氨基酸水解酶1、蛋白酶體20S、kFABP、PAP、E-巧粘蛋白 和CEA的組合 幽]實施例5:糞便腫瘤標記物測定
[CX342] 提取重約Ig的糞便，加入含有Ig/L疊氮化物的IOml的IOOmM憐酸鋼緩沖液（pH 7.2)。將該混合物旋動均質1分鐘。然后將樣品在冰上進行4次7秒超聲處理。通過W2000g在 4°C離屯、10分鐘除去不溶的級分。將上清在-30°C膽存直至進行測定。
[0343] 如果需要，在皿S Ag叫tra cartridge的第一個孔的緩沖液中適當稀釋糞便之 后，使用實施例3所述的化ISA在糞便中查找腫瘤標記物。
[0344] 使用該檢驗測定酷化氨基酸水解酶1、半乳凝素-3和蛋白酶體20S的結果分別示于 圖18-20。在結腸直腸癌患者的10、14和8份糞便中分別觀測到酷化氨基酸水解酶1、半乳凝 素-3和蛋白酶體20S的量增加。
[0345] 實施例6:通過化ISPOT技術檢測腫瘤標記物 [034引 1.細胞培養
[0347]將LnCAP前列腺癌細胞系在RPMI 1640培養基中培養，該培養基中補加了2mM心谷 氨酷胺、IOmM肥陽S、ImM丙酬酸鋼和10%FCS(均來自Gibco)。該細胞用作陰性對照。
[cm引將Caco-2結腸直腸癌細胞系在含有2mMレ谷氨酷胺而無 FCS(均來自Gibco)的 DMEM培養基中培養。
[0349] 將HT-29結腸直腸癌細胞系在含有2mM k谷氨酷胺和10%FCS(均來自Gibco)的 MEM培養基中培養。
[0350] 將HT-29/B6結腸直腸癌細胞系在含有4mM k谷氨酷胺而無 FCS(均來自Gibco)的 培養基中培養。
[0巧1 ]將細胞維持在37。(：的具有5%C02保溫儀中。
[0巧。2.化ISPOT技術
[0353]運種方法可W確定分泌蛋白質的細胞數目。將帶有PVDF膜(Multiscreen IP, Mi 11 ipore)的96-孔化ISPOT平板用在無菌PBS中的lOiig/ml小鼠抗腫瘤標記物單克隆抗體 (捕獲抗體，見下表9,該表示出了用于ELISPOT中的抗體)在+4°C包被過夜，10化1/孔。然后 將該平板用PBS洗涂，并用含有10 %FCS的培養基飽和。平行地，對細胞進行膜蛋白酶消化、 計數，然后稀釋為IO5個細胞/ml。每個孔分配20化1運種細胞懸浮液，運一原液的連續稀釋 液也是如此。然后將該平板在37°C在5%C02濕潤環境中保溫20小時，隨后用含有0.05% Tween-20的PBS洗涂。剩余的細胞通過用冰水處理10分鐘裂解，再次洗涂平板。然后加入0.1 yg/孔掲示抗體-即待測腫瘤標記物的生物素酷化的單克隆抗體(表9)(在室溫保溫2小時）。 通過加入Ex化avidin-堿性憐酸酶(Sigma)和底物5-漠-4-氯-3-嗎I噪基憐酸鹽/硝基藍四挫 (BCIP/NBT，Biorad)掲示斑點。背景噪音相應于在Ln化P孔中測量的斑點數目，在所用讀取 條件下在0-8之間變化。從特異性信號中減去非特異性斑點的平均數。
[0；354]表 9
[0355]
[0巧6] 3.結果
[0357] 每一百萬個保溫的細胞中分泌腫瘤標記物的Cac〇-2、HT-29和HT-29/B6細胞的數 目示于圖21 dELISPOT技術可W證實所述腫瘤標記物由結腸癌細胞系釋放或分泌。可W使用 運個技術查找患者體內循環腫瘤細胞，根據本
【申請人】申請的專利申請WO 03/076942所述方 法進行。
[0娜]實施例7:使用結腸組織經免疫組織化學方法檢測腫瘤標記物 [0巧9] 1.方法學
[0360] 首先，對組織微陣列載玻片脫石蠟。為此，將其在如下浴中相繼保溫10分鐘：甲基 環己燒(兩次）、100%乙醇、95%乙醇、70%乙醇和水。然后將該玻片用含有0.1 %Tween 20 的TBS(TBS-T)攬拌漂洗10分鐘。抗原在1 OmM巧樣酸鹽緩沖液pH 6中通過加熱至90°C 40分 鐘、然后冷卻至室溫30分鐘再活化。內源性過氧化物酶通過在含有3%此化的TBS-T中保溫5 分鐘而被抑制。然后將該玻片用在TBS-T中3 % BSA在37 °C在濕化箱中飽和1小時。
[0361] 隨后將該玻片與在含有3%BSA的TBS-T中稀釋為lOiig/ml的如下一級抗體一起保 溫2小時(在37°C在濕化箱中保溫）：抗-白細胞彈性蛋白酶抑制劑(克隆3D9C2)、抗-埃茲蛋 白（克隆5G2D12)、抗-酷化氨基酸水解酶1(克隆8A8A10)或者抗-I-絲束蛋白（克隆8D6A3)。 在進行3次在TBS-T中洗涂10分鐘后，將該玻片與在飽和溶液中稀釋為1/400的辣根過氧化 物酶結合的抗小鼠二級抗體(Cat.No. 115-035-003Jackson Immunoresearch) -起在37°C 在濕化箱中保溫2小時。對該玻片進行3次在TBS-T中洗涂10分鐘，然后進行3次在PBS中洗涂 10分鐘。使用Sigma化St底物(Cat.No.D-4168,Sigma-Al化ich)使玻片顯色5分鐘。通過在 PBS中洗涂終止染色。使用化rris蘇木精(Cat. No.MHS16, Sigma-Al化ich)復染30秒。在用水 和用PBS洗涂后，將玻片置于顯微鏡下觀察。
[0362] 根據運項應用特異性選擇用于免疫組織化學標記的抗體，不依賴于其在化ISA或 者在Western印跡中的反應性。
[0363] 2.白細胞彈性蛋白酶抑制劑的免疫組織化學檢測
[0364] 組織微陣列載玻片用于篩選大量樣品。運些樣品是點于玻片上的結腸組織。患者 的特性(結腸直腸癌組織微陣列上存在的結腸組織斑點的特性）W及用抗-白細胞彈性蛋白 酶抑制劑抗體免疫標記的結果示于表10。
[03化]表10
[O^AAl
[0367]該表中結果證實在健康結腸粘膜活檢組織中，無標記（10個陰性結果）。該標記在 腺瘤中也是陰性的（1/1)。該標記在結腸腺癌的上皮細胞中是陽性的(8/11患者陽性）。在基 質中無標記。
[03側 3.埃茲蛋白的免疫組織化學檢測
[0369]組織微陣列載玻片用于篩選大量樣品。運些樣品是點滴于玻片上的結腸組織。對 于每個結腸腺癌患者，在腫瘤中屯、取3份樣品，在侵潤前沿取3份樣品W及在健康組織取3份 樣品。表11示出了用抗-埃茲蛋白抗體免疫標記的結果;示出的標記水平是在分析的3份樣 品的最大強度。
[0370] 夫1 1
[0371]
[0372] 在30個患者中，25個患者呈現出與相鄰健康組織相比在腫瘤（腫瘤中屯、或侵潤前 沿）中埃茲蛋白過表達。
[0趴]4.酷化氨基酸水解酶1的免疫組織化學檢測
[0374]組織微陣列載玻片用于篩選大量樣品。運些樣品是點滴于玻片上的結腸組織。對 于每個結腸腺癌患者，在腫瘤中屯、取3份樣品，在侵潤前沿取3份樣品W及在健康組織取3份 樣品。表12示出了用抗-酷化氨基酸水解酶抗體免疫標記的結果;示出的標記水平是在分析 的3份樣品的最大強度。
[0375] 表12
[0376]
[0377] 在30個患者的樣品中，21個患者呈現出與相鄰健康組織相比在腫瘤（腫瘤中屯、或 者侵潤前沿)中酷化氨基酸水解酶過表達。
[0巧引 5.1-絲束蛋白的免疫組織化學檢測
[0379] 組織微陣列載玻片用于篩選大量樣品。運些樣品是點于玻片上的結腸和直腸組 織。患者的特性(結腸直腸癌組織微陣列上存在的結腸組織斑點的特性）W及用抗-I-絲束 蛋白抗體免疫標記的結果示于表13。
[0380] 表13
[03811
[i
[0383] 表中結果證實：
[0384] -在健康結腸粘膜活檢組織中，該標記在8個樣品中較弱( + )，在2個樣品中是++。該 標記在結腸腺瘤樣品（1/1)中也較弱(+ )。該標記在結腸腺癌上皮細胞中是強陽性++(6/9患 者++，3個患者較弱+，包括結腸粘液性腺癌）。在基質中無標記；
[0385]-在健康直腸粘膜活檢組織中，該標記W非特異性方式存在于表面上皮(3/4)，在1 個樣品中是++水平。該標記在直腸腺瘤中是強陽性++(5/9)或者謹慎+(4/9)。該標記在直腸 腺癌的上皮細胞中也是強陽性++(3/4患者是++，1個患者較弱+)。在基質中無標記。
[03化]實施例8:通過LC-MRM-MS技術檢測腫瘤標記物 [0387] 1.方法學
[03則為了使檢測限度降低至幾個ng/ml，使用一種改良的MRM-MS方法。運個方法的連續 步驟是：1)高豐度蛋白質的免疫耗竭，2)膜蛋白酶消化，3)對所述膚進行SPE(固相提取)分 級分離，4)與MRM-MS結合的液相層析(LC)。
[0389] 通過向對照血清集合中加入10-250ng/ml濃度的ACY、埃茲蛋白、kFABP、PDI或者 I-絲束蛋白重組蛋白對添加樣品（spike sample)進行設置。載脂蛋白Al和A2天然存在于血 清中。
[0390] 免疫耗竭.血清中高豐度蛋白質的耗竭通過使用來自Vivascience的商業 Vi vapure抗-HSA試劑盒進行。或者，也可W使用來自Calbiochem的PrOteoextraCt A化umin/lgG試劑盒W及來自Bio-Rad的Aurum? Serum Protein Minikit。也可W在實驗室 中產生特異性樹脂，通過將待耗竭的蛋白質的單克隆抗體與CN化-活化的S邱harose 4B樹 月旨(Amersham Bioscience)根據廠商指導結合。
[0391] 酶消化.將耗竭的血清樣品在用IOmM化is(pH 8)緩沖的、且含有30mM二硫蘇糖醇 的6M尿素溶液中在40°C去飽和40分鐘，然后用50mM艦代乙酷胺在室溫避光燒化40分鐘。將 其在水中稀釋6倍，然后在37°C用膜蛋白酶消化過夜，所用酶/底物比率為l:30(Promega)。 通過加入終濃度為0.5%甲酸終止消化。使用Oasis HLB 3cc逆向cartridges(60mg) (Waters)通過固相提取（SPE)對消化的樣品去鹽化（desalified)。在應用樣品后，將該 ca;rt;ridges用Iml的0.1%甲酸洗涂，然后用含有0.1%甲酸的甲醇/水混合物(80/20v/v)進 行洗脫。洗脫物在真空下干燥。
[0392] SPE分級分離.將干燥的樣品置于Iml乙酸鹽緩沖液中，并且加樣于在乙酸鹽緩沖 液和甲醇中預先平衡的Oasi S MCX(混合的陽離子交換)60mg混合柱(疏水性和陽離子交換） (Waters)中。將該柱用Iml乙酸鹽緩沖液和Iml甲醇洗涂。用Iml甲醇/乙酸鹽緩沖液混合物 (50/50V/V)洗脫感興趣的膚(表14)。根據感興趣的膚的等電點選擇乙酸鹽緩沖液的抑。洗 脫物在真空下干燥，并且溶解于含有0.1%甲酸的20化1乙臘/水(3/97乂八)溶液中。將5041 等份注射進與MS-MS系統結合的LC中。
[0393] 液相層析和質譜分析.在HP 1100系列高壓層析系統化PLC)上進行LC-MS分析，該 系統具有一個雙向累和注射器(Agilent Technologies)，并且結合了質譜分析儀W增加靈 敏性，即Sciex API 200(H;riple qua化ipole或者Sciex API 4000(Hrap化ybrid hiple qua化ipole-ion trap MS)(MDS Sciex)。在CisSymmetiT柱（Waters)上進行LC分離，洗脫流 速為30化I/分鐘(洗脫液A =在水中0.1 %甲酸，洗脫液B =在乙臘中0.1%甲酸，5%B至50% B線性梯度25分鐘，然后50%B至100%B線性梯度3分鐘）。^陽性離子化模式在5500V電壓進 行MS分析，W針式電壓(needle voltage)施加，使得來源離子化。使用Analyst 1.4.1軟件 進行設備核查和數據獲得。霧化氣體(空氣)和氣簾氣體(curtain gas)(氮氣)流速分別為 30和20psi。化rbo V?離子源調節為400°C，輔助氮氣流為40psi。對每種膚記錄的MRM躍遷 (付曰113；[1：；[0]13)示于表14。對于每個選擇的11?/[躍遷優化碰撞能量(〔￡)、去簇電壓(0?)和碰 撞室出口電壓(CXP)。
[0巧4] 2.結果
[0395] 對于每種腫瘤標記物(表14列出的蛋白質），使用MIDAS(MRM-起始的檢測和測序） 軟件產生理論MRM躍遷列表。運個表包含質量范圍在80化o3000Da的理論上膜蛋白酶消化的 膚的所有雙極或=極親代離子W及y或b型的所有可能的片段離子。對于每種蛋白質，檢測 每個可能的躍遷W確定最靈敏和最特異性的躍遷。運種選擇的結果示于表14。使用AQUA型 (Sigma)的重鏈膚或者作為測定標準的重鏈重組蛋白質，可W絕對方式量化復合的生物學 介質中感興趣的腫瘤標記物。
[0396] 表14
[0397]
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【主權項】
1. 通過確定得自疑似患有結腸直腸癌的患者的生物學樣品中白細胞彈性蛋白酶抑制 劑標記物的存在而體外診斷結腸直腸癌的方法。2. 權利要求1的方法，特征在于所述生物學樣品是遠離腫瘤的樣品。3. 權利要求1或2的方法，特征在于其還包括確定選自如下標記物的至少一種其它腫瘤 標記物的存在:埃茲蛋白、酰化氨基酸水解酶1、肝脂肪酸結合蛋白、腸脂肪酸結合蛋白、載 脂蛋白AI、載脂蛋白AII和I-絲束蛋白。4. 權利要求1-3任一項的方法，特征在于其還包括確定選自如下標記物的至少一種其 它腫瘤標記物的存在:β2-微球蛋白、蛋白酶體20S、半乳凝素-3、L-乳酸脫氫酶B鏈、鈣網蛋 白、再生胰島衍生蛋白3α、腫瘤相關鈣離子信號傳導蛋白1、細胞骨架角蛋白II型8、細胞骨 架角蛋白I型18、細胞骨架角蛋白I型19、上皮鈣粘蛋白、CEA、絨毛蛋白、CA19-9、CA 242、CA 50、CA 72-2、睪酮、HMP-l、Cript〇-l、Intelectin-I、蛋白質二硫鍵異構酶、細胞角蛋白20、 翻譯控制的腫瘤蛋白、防衛素（原）-A5;血液中甲基化DNA的檢測，優選AXL4基因的甲基化 DNA或者septin-9基因的甲基化DNA;奠便DNA片段中特異性改變的檢測，如糞便DNA的特異 性突變或者糞便DNA的甲基化模式的特異性改變，以及糞便人血紅蛋白的檢測。5. 權利要求1-4任一項的方法在結腸直腸癌的早期診斷、篩選、治療隨診、預后以及復 發診斷中的應用。
【文檔編號】G01N33/574GK105954515SQ201610357367
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2008年7月10日
【發明人】C·博利厄, J-P·沙里耶, G·肖凱-凱斯狄拉維斯基, O·梅讓-勒圖爾納, D·羅蘭
【申請人】生物梅里埃公司