三維紙基電化學比率計的制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種三維紙基電化學比率計的制備方法及所述的三維紙基比率計在鋅離子檢測中的應用。通過蠟打印技術在紙芯片上制備工作區，并借助絲網印刷技術，印制三電極，進而對工作區功能化，實現了亞甲基藍和鄰苯二胺兩種電活性物質的雙重信號放大，利用金屬離子識別模擬酶鏈，斷裂底物鏈，借助電化學工作站，實現Zn2+的高靈敏、便攜式檢測。
【專利說明】
三維紙基電化學比率計的制備方法
技術領域
[0001]本發明涉及一種三維紙基電化學比率計的制備方法，更具體地說是一種三維紙基電化學比率計實驗室技術平臺的構建。
【背景技術】
[0002]防治水體污染，對環境保護以及人類的健康至關重要。一些無機污染物，特別是金屬離子，如Pb2+，Mg2+，Zn2+，Hg2+等是水體污染中常見的物質，但目前廣泛使用的色譜法、熒光檢測方法所需儀器昂貴，且儀器相對笨重，不利于即時現場檢測。因此，尋找和建立一種低成本、高效快速金屬離子的檢測方法成為科研工作者的任務之一。
[0003]紙，作為中國的四大發明產物之一，廣泛應用在書寫、印刷、繪畫、包裝等領域。眾橫交錯的紙纖維使得紙內部呈現三維多孔結構，且紙纖維表面富含豐富的含氧基團，因此，易于實現紙纖維的表面功能化。近年來，功能化紙基實驗檢測平臺規模日益擴增，由簡單的醫療工具驗孕棒發展到各式各樣的生物傳感器件，包括紙基電化學生物傳感器，紙基光電化學生物傳感器，紙基比色生物傳感器，紙基電化學發光生物傳感器等。
[0004]電化學生物傳感器，因其具有低成本、靈敏度高，易于實現小型化及集成化，且所需儀器簡單等優點而廣泛應用于生物傳感領域。但傳統的電化學生物傳感器攜帶不便，且容易受到外部環境的影響，如電解液PH的變化、H2O2濃度的改變等，而使得測定結果準確度降低。為了解決這一問題，我們首次將比率型熒光檢測方法的思想引入到電化學生物傳感器中，結合功能化紙芯片，我們構建了一種新型的紙基電化學比率計檢測平臺，所構建的生物傳感平臺不僅具有低成本、可折疊、易于攜帶等優點，同時檢測結果靈敏度以及準確度獲得大幅度的提高，因此，所構建的實驗室技術平臺有望在資源有限、經濟發展相對落后的邊遠地區得到應用及推廣。
【發明內容】
[0005]針對目前存在的問題，本發明制作了一種成本低、準確度高且攜帶方便的三維紙基電化學比率計并將其應用到Zn2+的檢測中。
[0006]為了解決上述技術問題，本發明是通過以下措施來實現的:一種三維紙基電化學比率計的制備，其特征是包括以下步驟:
(1)在計算機上利用Al軟件設計如附圖1所示的比率型電化學紙芯片的疏水蠟批量打印圖案；
(2)將比率型電化學紙芯片剪裁成A4大小的紙，利用蠟打印機將步驟(I)中設計的疏水蠟批量打印圖案打印到A4紙上，隨后將其放置到烘箱中加熱直至蠟融化并浸透整個紙的厚度，形成疏水區域；
(3)采用絲網印刷的方法，將工作電極、參比電極、對電極印刷圖案依次印刷到步驟
(2)中所得紙上，樣式如附圖2所示，其中右側為工作區，上面印有工作電極，左側為參比區，上面印有參比電極和對電極； (4)對(3)中親水區域功能化，將修飾有Au納米粒子-鐵卟啉金屬有機框架材料的Zn2+的特異性DNA模擬酶鏈，定義為鏈I，其堿基序列如核苷酸序列表所示，固定在親水區域，實現信號的第一次放大，隨后用巰基己醇封鎖活性位點；
(5)將一定濃度的亞甲基藍修飾的Zn2+的底物鏈，定義為鏈2，其堿基序列如核苷酸序列表所示，其中至左向右，第十個堿基，也就是堿基A代表腺嘌呤核糖核苷酸，和進行滾環擴增的引物鏈，定義為鏈3，其堿基序列如核苷酸序列表所示，按一定比例混合在一起，然后加入到(4)所得電極表面43 °C下反應3 h;
(6)將一定濃度的環形模板探針，定義為鏈4，其堿基序列如核苷酸序列表所示，以及T4連接酶加入到步驟(5)所得電極表面，室溫下反應2 h，隨后加入phi29 DNA連接酶、dNTP以及滾環擴增緩沖溶液的混合液，37 °C下反應I h，隨后用磷酸鹽緩沖溶液沖洗電極表面，完成滾環擴增反應，以實現二次信號放大；
(7)將一定濃度的Zn2+加入到步驟(6)所得電極表面，混勻，室溫下反應40min；
(8)向步驟(7)所得電極表面滴加含有鄰苯二胺和H2O2的磷酸鹽緩沖溶液的電解液，連接電化學工作站，在-0.8?O V電位范圍內，測定亞甲基藍和鄰苯二胺的電流強度；
(9)繪制鄰苯二胺和亞甲基藍電流強度比率的變化與Zn2+濃度關系曲線，完成Zn2+的測定；
步驟(2)中所述的紙材料，其特征在于其為一級色譜紙；
步驟(4)中所述親水區域功能化，其特征在于:在紙芯片上生長石墨烯導電層，而后滴加殼聚糖溶液:向紙芯片表面三次重復滴加氧化石墨烯的溶液，室溫下干燥后，將滴加有氧化石墨烯的紙芯片轉移到含有0.1 M Na2SO4溶液中，0.9 V電位下，電還原氧化石墨烯，反應完成后將紙芯片取出，二次水清洗表面，再次室溫下干燥即可獲得生長有石墨烯的紙芯片，而后在紙芯片表面滴加2.0 yL的0.5 mg mL—1的殼聚糖，室溫下干燥40 min。
[0007]步驟(4)中所述修飾有Au納米粒子-鐵卩卜啉金屬有機框架材料的Zn2+特異性DNA模擬酶鏈，其特征在于:首先制備鐵卟啉金屬有機框架材料，即39.54 mg的5，10，15，20-四(四羧基)-21!1，23!1-卟啉和40.55 mg氯化鐵，0.1 M的鹽酸加入到12 mL的體積比1:2混合的二甲基甲酰胺和乙醇的混合液中，超聲40 min，隨后將混合液150 °C反應50 h，反應停止后將產物用二甲基甲酰胺和乙醇清洗三次，而后將產物60 °(:真空干燥，即可獲得鐵卟啉金屬有機框架材料;其次制備Au納米粒子-鐵卟啉金屬有機框架材料:稱取6 mg的上述制備的鐵卟啉金屬有機框架材料，將其溶解到I mL的乙醇中，然后將其分散到0.2 mL的氨水、13.8 mL乙醇、1.8 mL四甲氧基娃燒混合液中，室溫下攪拌2 h，將產物于12000 r/min離心10 min,用乙醇清洗產物，將所獲得的產物與4 mL 20 mM的三甲氧基巰丙基硅烷的乙醇溶液中，65°C回流4 h，將產物離心，二次水沖洗，然后向溶液中加入4 mL Au納米粒子的溶液，室溫下反應3 h，將產物離心，用二次水沖洗，即可獲得Au納米粒子-鐵卟啉金屬有機框架材料;最后將Zn2+特異性DNA模擬酶鏈連接在Au納米粒子-鐵卟啉金屬有機框架材料表面:移取90 yL10 μΜ的Zn2+特異性DNA模擬酶鏈，加入到Au納米粒子-鐵卟啉金屬有機框架材料溶液中，室溫下震蕩24 h，所獲得的產物用巰基己醇封鎖活性位點，最后將產物分散到0.5 mL 50 mM的三(羥甲基)氨基甲烷醋酸鹽緩沖溶液中。
[0008]步驟(4)中所述鏈I，其特征在于:其特定的堿基序列以及其5’端修飾上氨基，其3’端修飾上巰基。
[0009]步驟(6)中所述DNA鏈4，其特征在于:其特定的堿基序列以及其5，端修飾上磷酸基團。
[0010]本發明的有益效果
(I)采用比率型電化學方法對Zn2+進行檢測，使得測定結果準確度提高。
[0011](2)功能化紙芯片作為電化學檢測基底，具有活性位點多、易于批量生產的特點。
[0012](3)整個比率型紙基電化學器件制備過程簡單，所需費用低，有望實現Zn2+的低成本、便攜式檢測。
【附圖說明】
[0013]圖1:三維紙芯片的疏水蠟批量打印圖案；
圖2:疏水蠟打印圖案上絲網印刷上工作電極、參比電極和對電極，其中，右側為工作電極，左側為參比和對電極。
【具體實施方式】
[0014]為了更好地理解本發明，下面通過實施例進一步闡明本發明的內容，但本發明不僅僅局限于下面的實施例。
[0015]實施例1
一種三維紙基電化學比率計的的制備及其在Zn2+檢測中的應用:
(1)在計算機上利用Al軟件設計比率型電化學紙芯片的疏水蠟批量打印圖案；
(2)將比率型電化學紙芯片剪裁成A4大小的紙，利用蠟打印機將步驟(I)中設計的疏水蠟批量打印圖案打印到A4紙上，隨后將其放置到烘箱中加熱直至蠟融化并浸透整個紙的厚度，形成疏水區域；
(3)采用絲網印刷的方法，將工作電極、參比電極、對電極印刷圖案依次印刷到步驟
(2)中所得紙上，其中右側為工作區，上面印有工作電極，左側為參比區，上面印有參比電極和對電極；
(4)對(3)中親水區域功能化，將修飾有Au納米粒子-鐵卟啉金屬有機框架材料的Zn2+的特異性DNA模擬酶鏈，定義為鏈I，固定在親水區域，隨后用巰基己醇封鎖活性位點；
(5)將一定濃度的亞甲基藍修飾的Zn2+的底物鏈，定義為鏈2，其中至左向右，第十個堿基，也就是堿基A代表腺嘌呤核糖核苷酸，和引物鏈，定義為鏈3，按一定比例混合在一起，43 °C下反應3 h，然后加入到(4)所得電極表面；
(6)將一定濃度的環形模板探針，定義為鏈4，以及T4連接酶加入到步驟(5)所得電極表面，室溫下反應2 h，隨后加入phi29 DNA連接酶、dNTP以及滾環擴增緩沖溶液的混合液，37 °C下反應I h，隨后用磷酸鹽緩沖溶液沖洗電極表面；
(7)將一定濃度的Zn2+加入到步驟(6)所得混合液中，混勻，室溫下反應40min；
(8)向步驟(7)所得電極表面滴加含有鄰苯二胺和H2O2的磷酸鹽緩沖溶液的電解液，連接電化學工作站，在-0.8?O V電位范圍內，測定亞甲基藍和鄰苯二胺的電流強度；
(9)繪制鄰苯二胺和亞甲基藍電流強度比率的變化與Zn2+濃度關系曲線，完成Zn2+的測定。
【主權項】
1.三維紙基電化學比率計的制備方法，其特征是包括以下步驟: (1)在計算機上利用Al軟件設計比率型電化學紙芯片的疏水蠟批量打印圖案； (2)將比率型電化學紙芯片剪裁成A4大小的紙，利用蠟打印機將步驟(I)中設計的疏水蠟批量打印圖案打印到A4紙上，隨后將其放置到烘箱中加熱直至蠟融化并浸透整個紙的厚度，形成疏水區域； (3)采用絲網印刷的方法，將工作電極、參比電極、對電極印刷圖案依次印刷到步驟(2)中所得紙上，其中右側為工作區，上面印有工作電極，左側為參比區，上面印有參比電極和對電極； (4)對(3)中親水區域功能化，將修飾有Au納米粒子-鐵卟啉金屬有機框架材料的Zn2+的特異性DNA模擬酶鏈，定義為鏈I，固定在親水區域，實現信號的第一次放大，隨后用巰基己醇封鎖活性位點； (5)將一定濃度的亞甲基藍修飾的Zn2+的底物鏈，定義為鏈2，其中至左向右，第十個堿基，也就是堿基A代表腺嘌呤核糖核苷酸，和進行滾環擴增的引物鏈，定義為鏈3，按一定比例混合在一起，然后加入到(4)所得電極表面43 °C下反應3 h; (6)將一定濃度的環形模板探針，定義為鏈4，以及T4連接酶加入到步驟(5)所得電極表面，室溫下反應2 h，隨后加入phi29 DNA連接酶、dNTP以及滾環擴增緩沖溶液的混合液，37 °C下反應I h，隨后用磷酸鹽緩沖溶液沖洗電極表面，完成滾環擴增反應，以實現二次信號放大； (7)將一定濃度的Zn2+加入到步驟(6)所得電極表面，混勻，室溫下反應40min； (8)向步驟(7)所得電極表面滴加含有鄰苯二胺和H2O2的磷酸鹽緩沖溶液的電解液，連接電化學工作站，在-0.8?O V電位范圍內，測定亞甲基藍和鄰苯二胺的電流強度； (9)繪制鄰苯二胺和亞甲基藍電流強度比率的變化與Zn2+濃度關系曲線，完成Zn2+的測定； 步驟(2)中所述的紙材料，其特征在于其為一級色譜紙； 步驟(4)中所述親水區域功能化，其特征在于:在紙芯片上生長石墨烯導電層，而后滴加殼聚糖溶液:向紙芯片表面三次重復滴加氧化石墨烯的溶液，室溫下干燥后，將滴加有氧化石墨烯的紙芯片轉移到含有0.1 M Na2SO4溶液中，0.9 V電位下，電還原氧化石墨烯，反應完成后將紙芯片取出，二次水清洗表面，再次室溫下干燥即可獲得生長有石墨烯的紙芯片，而后在紙芯片表面滴加2.0 yL的0.5 mg mL—1的殼聚糖，室溫下干燥40 min。2.根據權利要求1所述的三維紙基電化學比率計的制備，其特征在于:權利要求1步驟(4)中所述修飾有Au納米粒子-鐵卟啉金屬有機框架材料的Zn2+特異性DNA模擬酶鏈:首先制備鐵卟啉金屬有機框架材料，即39.54 mg的5 ,10,15,20-0 (四羧基)_21H，23H-卟啉和40.55 mg氯化鐵，0.1 M的鹽酸加入到12 mL的體積比1:2混合的二甲基甲酰胺和乙醇的混合液中，超聲40 min，隨后將混合液150 °C反應50 h，反應停止后將產物用二甲基甲酰胺和乙醇清洗三次，而后將產物60 °(:真空干燥，即可獲得鐵卟啉金屬有機框架材料;其次制備Au納米粒子-鐵卟啉金屬有機框架材料:稱取6 mg的上述制備的鐵卟啉金屬有機框架材料，將其溶解到I mL的乙醇中，然后將其分散到0.2 mL的氨水、13.8 !^乙醇、1.8 mL四甲氧基硅烷混合液中，室溫下攪拌2 h，將產物于12000 r/min離心10 min，用乙醇清洗產物，將所獲得的產物與4 mL 20 mM的三甲氧基巰丙基硅烷的乙醇溶液中，65 °C回流4 h，將產物離心，二次水沖洗，然后向溶液中加入4 mL Au納米粒子的溶液，室溫下反應3 h，將產物離心，用二次水沖洗，即可獲得Au納米粒子-鐵卟啉金屬有機框架材料;最后將Zn2+特異性DNA模擬酶鏈連接在Au納米粒子-鐵卟啉金屬有機框架材料表面:移取90 yL 10 μΜ的Zn2+特異性DNA模擬酶鏈，加入到Au納米粒子-鐵卟啉金屬有機框架材料溶液中，室溫下震蕩24 h，所獲得的產物用巰基己醇封鎖活性位點，最后將產物分散到0.5 mL 50 mM的三(羥甲基)氨基甲烷醋酸鹽緩沖溶液中。3.根據權利要求1所述的三維紙基電化學比率計的制備，其特征在于:權利要求1步驟(4)中所述鏈I其特定的堿基序列以及其5’端修飾上氨基，其3’端修飾上巰基。4.根據權利要求1所述的三維紙基電化學比率計的制備，其特征在于:權利要求1步驟(6)中所述DNA鏈4其特定的堿基序列以及其5 ’端修飾上磷酸基團。
【文檔編號】G01N27/48GK105954346SQ201610595195
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年7月27日
【發明人】李麗, 張彥, 黃煜真, 葛慎光, 顏梅, 劉海云, 于京華
【申請人】濟南大學