一種氨基酸（酪氨酸）同分異構體的鑒別方法
【專利摘要】一種芳香族氨基酸同分異構體DL?m?酪氨酸（間羥基苯丙氨酸）和L?酪氨酸（對羥基苯丙氨酸）的鑒別方法，其特征在于：應用“H2SO4?NaBrO3?[CuL](ClO4)2?蘋果酸”非線性化學振蕩體系作為鑒別溶液，根據酪氨酸同分異構體對該體系產生的抑制時間不同，進而實現對酪氨酸同分異構體的鑒別；[CuL](ClO4)2中L為5,7,7,12,14,14?六甲基?1,4,8,11?四氮雜十四?4,11?二烯。本發明所涉及的鑒定方法所提供的振蕩圖譜具有直觀性，可以方便快捷地鑒別出氨基酸同分異構體DL?m?酪氨酸和L?酪氨酸，而且設備簡單、準確度高、易于操作和觀察。
【專利說明】
-種氨基酸(酪氨酸)同分異構體的鑒別方法
技術領域
[0001] 本發明設及一種區分鑒別酪氨酸同分異構體的方法。具體地說，是應用巧2S^- 化化化-[CuLKCl化)2 -蘋果酸"非線性化學振蕩體系作為鑒別溶液，其中[CuLKCl化)2 作為催化劑，L為5, 7, 7，12，14，14-六甲基-1，4, 8，11-四氮雜十四-4，11-二締，蘋 果酸為有機底物。將酪氨酸同分異構體分別加入非線性化學振蕩體系，根據酪氨酸同分異 構體對該振蕩體系產生的抑制時間不同，進而實現對酪氨酸同分異構體的區分鑒別。
【背景技術】
[0002] 酪氨酸(tyrosine;Tyr)是人類成長過程中必不可少的氨基酸，如果體內缺乏酪氨 酸則可能會導致出現智能下降，白化病等癥狀。當前國內外已普遍開始重視食品中酪氨酸 含量的添加。因此，準確、靈敏的測定酪氨酸在營養學和臨床醫學上具有重要意義。由于化- m-酪氨酸（間徑基苯丙氨酸)和心酪氨酸(對徑基苯丙氨酸)分子式相同、結構相近，因此使 得他們的一些物理和化學性質也相似，且兩者的外觀也極為相似，導致兩者難W區分，其結 構如下式。目前雖然已有很多報道關于定量分析酪氨酸濃度的方法，例如HPLCtU、電化學分 析法、化學發光法W、毛細管電泳法W。但是，關于對化-m-酪氨酸（間徑基苯丙氨酸)和 k酪氨酸(對徑基苯丙氨酸)兩種同分異構體的區分鑒別尚無報道。因此，迫切需要一種鑒 定效果好且操作簡便快速、結果容易判斷的方法來鑒別運兩種物質。
[0003]
【發明內容】
[0004] 本發明旨在為芳香族氨基酸同分異構體化-m-酪氨酸和心酪氨酸提供一種新穎且 方便快捷的區分鑒別方法，即應用KuLKCl化)2催化的非線性化學體系對化-m-酪氨酸和心 酪氨酸的鑒別方法，本鑒別方法是基于該配合物催化的非線性化學體系對芳香族氨基酸同 分異構體的敏銳響應而開發的一種電化學振蕩體系法。具體地說，是將相同濃度待鑒別樣 品（DL-m-酪氨酸或心酪氨酸)分別加入到兩組振蕩體系中，根據待鑒別樣品對振蕩體系所 產生的抑制時間（tin)長短，實現對待鑒別樣品的定性分析:若振蕩體系產生的抑制時間 (tin)較長，則所加待鑒別樣品為化-m-酪氨酸;若振蕩體系產生的抑制時間（tin)較短，則所 加待鑒別樣品為心酪氨酸。且本發明快速處理樣品，測定條件簡單易控制便于推廣和應用。
[0005] 本發明解決技術問題，采用如下技術方案： 本發明為芳香族氨基酸的同分異構體(DL-m-酪氨酸和心酪氨酸)提供了鑒別方法，其 特點在于： W硫酸為溶劑，配制待鑒別樣品的溶訂復； 應用巧2S化-化化化-[化L](C104)2-蘋果酸"非線性化學振蕩體系作為鑒別溶液， 記錄振蕩體系的振蕩圖譜。任意一個穩定的電位最低點處，向振蕩體系中加入待鑒別樣品 的溶液，根據待鑒別樣品對振蕩體系所產生的抑制時間（tin)不同，實現對待鑒別樣品的定 性分析； 所述待鑒別樣品為化-m-酪氨酸或心酪氨酸； 向兩組鑒別溶液(非線性體系）中，分別加入待鑒別樣品（酪氨酸的同分異構體化-m-酪 氨酸或レ酪氨酸）的溶液，可W發現振蕩反應會受到抑制，然后經過一段抑制期后振蕩恢 復。但化-m-酪氨酸和心酪氨酸對振蕩體系產生的抑制時間不同：Dkm-酪氨酸對體系產生 的抑制時間（tin)較長，而心酪氨酸對體系產生的抑制時間（tin)較短。因此，通過比較抑制 時間的長短即可定性鑒別出其種類:抑制時間長的待鑒別樣品為化-m-酪氨酸，抑制時間短 的待鑒別樣品為心酪氨酸。另外，實驗結果表明，W加入體系中的待測液化-m-酪氨酸的濃 度C(Tyr)為橫坐標，振蕩體系產生的抑制時間（tin)為縱坐標作圖，可得到一條線性直線；W 加入體系中的待測液k酪氨酸的濃度C(Tyr)為橫坐標，振蕩體系產生的抑制時間（tin)為縱 坐標作圖，可得到另一條線性直線;運兩條直線的斜率不同，其中，W化-m-酪氨酸濃度為橫 坐標得到的直線，其斜率更大。
[0006] 本發明所用的催化劑是四氮雜大環銅[加 LKCl化)2,其中配體L為5,7,7,12,14， 14-六甲基-1，4,8，11-四氮雜十四-4,11-二締;結構式如式(1)所示，
[0007] 本發明中四氮雜大環催化劑起著至關重要的作用，其配置主要分為兩個步驟n-w: 1) Cl 姐 32N4.2HC104 (L.2肥 1〇4)的合成；2) [CU(C1抽 32N4)].(C104)2 ( [CuL](C1〇4)2) 的合成。
[000引 1)。姐32抓? 2肥104化? 2肥104)的合成： 按文獻的方法，該反應一直在冰浴條件下進行。在500 mL的=頸瓶中加入98.5mL乙二 胺，用滴液漏斗緩慢滴加126 mL70%高氯酸，調節磁力攬拌器的攬拌速度為50化/min。最初 的反應劇烈并伴有白煙產生，所W滴加速度控制在每5秒鐘1滴，如果滴加太快溶液在漏斗 底部形成冰柱而造成漏斗堵塞。隨著反應進行白煙逐漸減少，反應的劇烈程度也逐漸緩和 可W適當加快滴加速度，直到滴加完為止，得到透明的溶液。向該透明溶液加入224 mL無水 丙酬并劇烈攬拌，溶液很快變渾濁同時形成非常粘稠混合物。此時應當適當提高攬拌速度， 調節攬拌速度為lOOOr/min，仍然在冰水浴的條件下保持2-3小時W便充分反應。最后得到 乳黃色粘稠液，將所得粘稠液轉移到布氏漏斗進行抽濾分離，并用丙酬充分洗涂，可得純白 色固體。將此純白色固體在熱的甲醇-水溶液中重結晶，用硅膠干燥劑真空干燥，得80 g白 色晶體，此白色晶體為L ? 2肥104。
[0009] 2) [Cu(打6出2抓）]? (Cl〇4)2( [CuU(Cl04)2)的合成： 按文獻的方法，在1000 mLS頸瓶中，分別加入25.55 g Cu(AC)2*4此0 (0.1 mol)與 等摩爾的L ? 2肥104,再加入800 mL甲醇中。熱水浴加熱回流3-4小時后，出現紅色沉淀。將 紅色沉淀過濾，濾液在熱水浴上濃縮至原體積1/2，放置過夜。充分結晶后，可W得到紅色晶 體。將紅色晶體轉移至布氏漏斗用乙醇洗涂，在熱的乙醇-水溶液中重結晶，真空干燥，可得 約8 g紅色[CuL](C1〇4)2晶體。
[0010]本發明設及的檢測方法與現有技術的區別是，本發明應用"H2S04 -化化〇3 - [化L](C104)2 -蘋果酸"的振蕩體系作為鑒別溶液，W酪氨酸同分異構體對該鑒別溶液的 產生的抑制時間長短不同，實現對酪氨酸同分異構體的鑒別。芳香族氨基酸同分異構體化- m-酪氨酸和心酪氨酸，在鑒別溶液(非線性振蕩體系）中的可檢測的濃度范圍為7.5X1(^6- 6.75 X l(T4mol/L。該待鑒別溶液可鑒別濃度范圍是經實驗確定的最優濃度范圍，在該濃度 范圍內，DL-m-酪氨酸和レ酪氨酸對振蕩體系產生的抑制長短差異十分明顯，易于觀察分 析，容易實現鑒別。鑒別溶液中各組分的濃度范圍如表1所示，經過多次實驗得到的最佳溶 液如表2所示： 表1:振蕩體系中各組分的濃度范圍
擊9 . ±臣勝知玄由欠外I A於T縣/f豐、沁巧 參考文獻：
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[0011] 首先，取一個50 mL小燒杯中并放入大小合適的磁子，放在恒溫磁力加熱攬拌器 上，保持攬拌速度在500 r/min。向燒杯中加入振蕩體系各組分溶液。把準備好的工作電極 (銷電極）和參比電極（雙鹽橋甘隸電極）插入燒杯中，工作電極和參比電極通過放大器 (Instrument Amplifier)連接到數據采集器化0! LINK)然后再通過USB連接到電腦上。打開 裝有logger Iite軟件的電腦，利用logger Iite軟件對溶液電位（Potential)隨時間 (Time)的變化情況進行實時采集(此時尚未加入待測試樣），W作空白對照。在振蕩產生的 任意一個穩定的電位最低點處，向兩組與空白對照實驗中的各組分濃度相同的振蕩體系 中，分別迅速加入待鑒別樣品的溶液，根據待鑒別樣品對振蕩體系所產生的振蕩響應不同 (抑制時間不同），實現對待鑒別樣品的定性分析。
[0012] 化學電位振蕩圖譜的基本參數包括： 振蕩振幅:在振蕩過程中從一個最低電位到下一個最高電位之間的電位差值。
[0013] 振蕩周期:在振蕩過程中從一個最低(高）電位到下一個最低(高）電位所需時間。
[0014] 最高電位:穩定振蕩時體系出現的電位最高點。
[0015 ]最低電位:穩定振蕩時體系出現的電位最低點。
[0016] 抑制時間（tin):從加入待測液到重新恢復振蕩所需時間。
【附圖說明】
[0017] 圖1是實施例1中，未加入待鑒別樣品時，鑒別溶液(振蕩體系）的振蕩圖譜。
[001引圖2是實施例1中，加入6.00XlO-VoVL化-m-酪氨酸后，振蕩體系所獲得的振蕩 響應圖譜。
[0019]圖3是實施例1中，加入6.OOXl(TV)VL心酪氨酸后，振蕩體系所獲得的振蕩響 應圖譜。
[0020] 圖4是實施例2中，未加入待鑒別樣品時，鑒別溶液(振蕩體系）的振蕩圖譜。
[0021] 圖5是實施例帥，加入3.75Xl〇-4mol/L Dkm-酪氨酸后，振蕩體系所獲得的振蕩 響應圖譜。
[0022] 圖6是實施例帥，加入3.75X I(TV)VL心酪氨酸后，振蕩體系所獲得的振蕩響應 圖譜。
[0023] 圖7是W實例1實例2為基礎的化-m-酪氨酸(化-m-TyrWPk酪氨酸a-Tyr)濃度(C (Tyr))與抑制時間（tin)的線性關系圖。
[0024] 圖8是實施例3中，未加入待鑒別樣品時，鑒別溶液(振蕩體系）的振蕩圖譜。
[0025] 圖9是實施例3中，加入1.44Xl〇-4mol/L化-m-酪氨酸后，振蕩體系所獲得的振蕩 響應圖譜。
[0026] 圖10是實施例3中，加入1.44Xl(T4mol/L心酪氨酸后，振蕩體系所獲得的振蕩響 應圖譜。
[0027] 圖11是實施例4中，未加入待鑒別樣品時，鑒別溶液(振蕩體系）的振蕩圖譜。
[002引圖12是實施例4中，加入2.88 X l0-4mol/LDL-m-酪氨酸后，振蕩體系所獲得的振蕩 響應圖譜。
[0029] 圖13是實施例4中，加入2.88 X l(T4mol/L心酪氨酸后，振蕩體系所獲得的振蕩響 應圖譜。
[0030] 圖14是W實例3實例4為基礎的化-m-酪氨酸（化-m-TyrWPk酪氨酸a-Tyr)濃度 (C(Tyr))與抑制時間（tin)的線性關系圖。
[0031] 圖15是實施例5中，未加入待鑒別樣品時，鑒別溶液(振蕩體系）的振蕩圖譜。
[0032] 圖16是實施例5中，分別加入1.5 X l〇-4mol/L化-m-酪氨酸后，振蕩體系所獲得的 振蕩響應圖譜。
[0033] 圖17是實施例5中，分別加入1.5Xl(T4mol/L心酪氨酸后，振蕩體系所獲得的振 蕩響應圖譜。
[0034] 圖18是實施例6中，未加入待鑒別樣品時，鑒別溶液(振蕩體系）的振蕩圖譜。
[0035] 圖19是實施例6中，分別加入3.75 X l〇-4mol/L化-m-酪氨酸后，振蕩體系所獲得的 振蕩響應圖譜。
[0036] 圖20是實施例6中，分別加入3.75X I(TV)VL心酪氨酸后，振蕩體系所獲得的振 蕩響應圖譜。
[0037] 圖21是W實例5實例6為基礎的化-m-酪氨酸（化-m-TyrWPk酪氨酸a-Tyr)濃度 (C(Tyr))與抑制時間（tin)的線性關系圖。
【具體實施方式】 [003引實施例1: 本實施例按如下步驟驗證本發明芳香族氨基酸化-m-酪氨酸和心酪氨酸的鑒別方法的 可行性。
[0039] (1)配制溶液 首先用98.3%的濃硫酸溶液配置1 mol/L的硫酸溶液，再用該硫酸溶液作為溶劑來配置 0.6mol/L的漠酸鋼溶液、2mol/L的蘋果酸溶液、2.21 X l〇-2mol/L的[CuU (Cl04)2溶液。
[0040] 同時Wl mol/L硫酸為溶劑，分別配置0.6mol/L的化-m-酪氨酸和心酪氨酸的溶 液。
[0041] (2)振蕩圖譜 首先將磁力攬拌子置于50 ml燒杯中，用移液管按如下順序加入不同體積的W下各溶 液：Imol/L出S〇4溶液，29ml; 0.6mol/L的漠酸鋼溶液，2ml; 2 mol/L的蘋果酸，4ml;然后插入 銷電極(工作電極)和甘隸電極(參比電極）。參比電極和銷電極與通過放大器（Inshument Amplifier)連接到數據采集器(GO! LINK)然后再通過USB連接到電腦。調節攬拌器的轉速 為500 r/min。在室溫下進行測量。打開logger Iite程序，進行如下操作：點擊實驗^數據 采集一采集長度（時間）設為3000 s。最后加入2.21X10-2mol/L的催化劑[CuL](C104)2， 5ml，使體系的總體積保持在40 ml。迅速點下開始鍵，電腦開始自動記錄體系電位隨時間變 化的實驗數據，圖1是電腦所記錄W蘋果酸為底物，四氮雜大環二締銅為催化劑的化學振蕩 的圖形。觀察振蕩溶液的顏色可W發現溶液的顏色不斷的發生周期性變化:紫色-棟黃色- 紫色，且電位也呈現周期性的變化。
[0042] 取一組鑒別溶液，當振蕩反應經過4個穩定的周期后，進入第5個振蕩周期電位最 低點時用移液槍加入40 Ul 0.6mol/L的化-m-酪氨酸，使得其在鑒別溶液中的濃度為6.00 X l(T4mol/L，可W看到體系出現一段抑制時間，振蕩響應圖譜如圖2所示。
[0043] 取另一組鑒別溶液，當振蕩反應經過4個穩定的周期后，進入第5個振蕩周期電位 最低點時用移液槍加入40 Ul 0.6mol/L的心酪氨酸，使得其在鑒別溶液中的濃度為6.00 X l(T4mol/L，可W看到體系出現一段抑制時間，振蕩響應圖譜如圖3所示。
[0044] (3)區分鑒別 作為芳香族氨基酸的同分異構體化-m-酪氨酸和心酪氨酸，因分子空間結構不同，其對 振蕩體系產生的影響也不相同。比較圖2圖3可知，在第五個振蕩電位最低點向兩組鑒別溶 液中分別加入40 Ul 0.6mol/L化-m-酪氨酸或レ酪氨酸，使得其在鑒別溶液中的濃度為 6.00X10-4mol/L，Dレm-酪氨酸對振蕩體系產生的抑制時間（tin)較長(239.5s)，レ酪氨酸 對振蕩體系產生的抑制時間（tin)較短（116s)。
[0045] 取事先配置好的兩個0.6mol/L的待測液(其中一個為化-m-酪氨酸，另一個為心酪 氨酸，但兩者尚未區分），將其中一個標記為樣品1，另一個標為樣品2。配置兩組上述濃度的 振蕩溶液，分別采集其振蕩電位隨時間的變化圖譜，在振蕩電位第五個最低點分別加入40 Ul 0.6mol/L的樣品1溶液或樣品2溶液，使得其在鑒別溶液中的濃度為6.00X l(T4mol/L。 根據logger Iite程序記錄的振蕩電位譜圖分別記算其抑制時間。當加入待測液樣品1時， 其對體系產生的抑制時間較長(239s);當加入待測液樣品2時，其對體系產生的抑制時間較 短（116.5 S)。所W得出抑制時間較長(239s)的待測液樣品1為化-m-酪氨酸，而相對抑制時 間較短（116.5s)的待測液樣品2則為L -酪氨酸。
[0046] 實施例2: 本實施例按如下步驟驗證本發明芳香族氨基酸化-m-酪氨酸和心酪氨酸的鑒別方法的 可行性。
[0047] (1)配制溶液 首先用98.3%的濃硫酸溶液配置1 mol/L的硫酸溶液，再用該硫酸溶液作為溶劑來配置 0.6mol/L的漠酸鋼溶液、2mol/L的蘋果酸溶液、2.21 X l〇-2mol/L的[CuU (Cl04)2溶液。
[0048] 同時Wl mol/L硫酸為溶劑，分別配置0.375mol/L的化-m-酪氨酸和心酪氨酸的 溶液。
[0049] (2)振蕩圖譜 首先將磁力攬拌子置于50 ml燒杯中，用移液管按如下順序加入不同體積的W下各溶 液：Imol/L出S〇4溶液，29ml; 0.6mol/L的漠酸鋼溶液，2ml; 2 mol/L的蘋果酸，4ml;然后插入 銷電極(工作電極)和甘隸電極(參比電極）。參比電極和銷電極與通過放大器（Inshument Amplifier)連接到數據采集器(GO! LINK)然后再通過USB連接到電腦。調節攬拌器的轉速 為500 r/min。在室溫下進行測量。打開logger Iite程序，進行如下操作：點擊實驗^數據 采集一采集長度（時間）設為3000 s。最后加入2.21X10-2mol/L的催化劑[CuL](C104)2， 5ml，使體系的總體積保持在40 ml。迅速點下開始鍵，電腦開始自動記錄體系電位隨時間變 化的實驗數據。圖4是電腦所記錄W蘋果酸為底物，四氮雜大環二締銅為催化劑的化學振蕩 的圖形。觀察振蕩溶液的顏色可W發現溶液的顏色不斷的發生周期性變化:紫色-棟黃色- 紫色，且電位也呈現周期性的變化。
[0050] 取一組鑒別溶液，當振蕩反應經過4個穩定的周期后，進入第5個振蕩周期電位最 低點時用移液槍加入40 Ul 0.375mol/L的化-m-酪氨酸，使得其在鑒別溶液中的濃度為 3.75Xl(T4mol/L，可W看到體系出現一段抑制時間，振蕩響應圖譜如圖5所示。
[0051] 取另一組鑒別溶液，當振蕩反應經過4個穩定的周期后，進入第5個振蕩周期電位 最低點時用移液槍加入40 Ul 0.375mol/L的レ酪氨酸，使得其在鑒別溶液中的濃度為 3.75Xl(T4mol/L，可W看到體系出現一段抑制時間，振蕩響應圖譜如圖6所示。
[0052] (3)區分鑒別 作為芳香族氨基酸同分異構體化-m-酪氨酸和心酪氨酸因分子空間結構不同，其對振 蕩體系產生的影響也不相同。比較圖5圖6可知，在第五個振蕩電位最低點分別加入40 Ul 0.375mol/L化-m-酪氨酸或心酪氨酸，使得其在鑒別溶液中的濃度為3.75 X l〇-4mol/L，化- m-酪氨酸對振蕩體系產生的抑制時間（tin)較長(166s)酪氨酸對振蕩體系產生的抑制時 間（tin)較短(89.5s)。
[0053] 取事先配置好的兩個0.375mol/L的待測液(其中一個為化-m-酪氨酸，另一個為k 酪氨酸，但兩者尚未區分），將其中一個標記為樣品1，另一個標為樣品2。配置兩組上述濃度 的振蕩溶液，分別采集其振蕩電位隨時間的變化圖譜，在振蕩電位第五個最低點分別加入 40 Ul 0.375mol/L的樣品1溶液或樣品2溶液，使得其在鑒別溶液中的濃度為3.75 X 10- Vol/L。根據logger Iite程序記錄的振蕩電位圖譜分別記算其抑制時間。當加入待測液 樣品1時，其對體系產生的抑制時間較長(164s);當加入待測液樣品2時，其對體系產生的抑 制時間較短(88 S)。所W得出抑制時間較長（164s)的待測液樣品1的為化-m-酪氨酸，而相 對抑制時間較短(88s)的待測液樣品2則為L -酪氨酸。
[0054] 圖7是W實例1實例2為基礎的化-m-酪氨酸（化-m-Tyr)和心酪氨酸化-Tyr)濃度 (C(Tyr))與抑制時間（tin)的線性關系圖。
[0化5] 實施例3: 本實施例按如下步驟驗證本發明芳香族氨基酸化-m-酪氨酸和心酪氨酸的鑒別方法的 可行性。
[0056] (1)配制溶液 首先用98.3%的濃硫酸溶液配置1 mol/L的硫酸溶液，再用該硫酸溶液作為溶劑來配置 0.6mol/L的漠酸鋼溶液、2mol/L的蘋果酸溶液、2.21 X l〇-2mol/L的[CuU (Cl04)2溶液。
[0057] 同時Wl mol/L硫酸為溶劑，分別配置0.144mol/L的化-m-酪氨酸和心酪氨酸的 溶液。
[005引（2)振蕩圖譜 首先將磁力攬拌子置于50 ml燒杯中，用移液管按如下順序加入不同體積的W下各溶 液：111101/1出504溶液，29.51111;0.611101/1的漠酸鋼溶液，1.51111;2 11101/1的蘋果酸，4.51111; 然后插入銷電極（工作電極）和甘隸電極（參比電極）。參比電極和銷電極與通過放大器 (Instrument Amplifier)連接到數據采集器(GO! LINK)然后再通過USB連接到電腦。調節 攬拌器的轉速為500 r/min。在室溫下進行測量。打開logger Iite程序，進行如下操作：點 擊實驗^數據采集^采集長度（時間）設為3000 S。最后加入2.21 X l(T2mol/L的催化劑 [化L] (Cl化)2,4.5ml，使體系的總體積保持在40 ml。迅速點下開始鍵，電腦開始自動記錄體 系電位隨時間變化的實驗數據。觀察振蕩溶液的顏色可W發現溶液的顏色不斷的發生周期 性變化:紫色-棟黃色-紫色，且電位也呈現周期性的變化。
[0059] 圖8是在實例3中，未加入待測樣品時，鑒別溶液的振蕩譜圖。
[0060] 取一組鑒別溶液，當振蕩反應經過4個穩定的周期后，進入第5個振蕩周期電位最 低點時用移液槍加入40 Ul 0.144mol/L的化-m-酪氨酸，使得其在鑒別溶液中的濃度為 1.44Xl(T4mol/L，可W看到體系出現一段抑制時間，振蕩響應圖譜如圖9所示。
[0061] 取另一組鑒別溶液，當振蕩反應經過4個穩定的周期后，進入第5個振蕩周期電位 最低點時用移液槍加入40 Ul 0.144mol/L的レ酪氨酸，使得其在鑒別溶液中的濃度為 1.44X l(T4mol/L，可W看到體系出現一段抑制時間，振蕩響應圖譜如圖10所示。
[0062] (3)區分鑒別 作為芳香族氨基酸同分異構體化-m-酪氨酸和心酪氨酸因分子空間結構不同，其對振 蕩體系產生的影響也不相同。比較圖9圖10可知，在第五個振蕩電位最低點分別加入40 Ul 0.144mol/L化-m-酪氨酸或心酪氨酸，使得其在鑒別溶液中的濃度為1.44X l〇-4mol/L，化- m-酪氨酸對振蕩體系產生的抑制時間（tin)較長巧4s)酪氨酸對振蕩體系產生的抑制時 間（tin)較短(35s)。
[0063] 取事先配置好的兩個0.144mol/L的待測液(其中一個為化-m-酪氨酸，另一個為k 酪氨酸，但兩者尚未區分），將其中一個標記為樣品1，另一個標為樣品2。配置兩組上述濃度 的振蕩溶液，分別采集其振蕩電位隨時間的變化圖譜，在振蕩電位第五個最低點分別加入 40 Ul 0.144mol/L的樣品1溶液或樣品2溶液，使得其在鑒別溶液中的濃度為1.44X10- Vol/L。根據logger Iite程序記錄的振蕩電位圖譜分別記算其抑制時間。當加入待測液 樣品1時，其對體系產生的抑制時間較長(53s);當加入待測液樣品2時，其對體系產生的抑 制時間較短（34s)。所W得出抑制時間較長巧3s)的待測液樣品1的為DL-m-酪氨酸，而相對 抑制時間較短(34s)的待測液樣品2則為L -酪氨酸。
[0064] 實施例4: 本實施例按如下步驟驗證本發明芳香族氨基酸化-m-酪氨酸和心酪氨酸的鑒別方法的 可行性。
[0065] (1)配制溶液 首先用98.3%的濃硫酸溶液配置1 mol/L的硫酸溶液，再用該硫酸溶液作為溶劑來配置 0.6mol/L的漠酸鋼溶液、2mol/L的蘋果酸溶液、2.21 X l〇-2mol/L的[CuU (Cl04)2溶液。
[0066] 同時Wl mol/L硫酸為溶劑，分別配置0.288mol/L的化-m-酪氨酸和心酪氨酸的 溶液。
[0067] (2)振蕩圖譜 首先將磁力攬拌子置于50 ml燒杯中，用移液管按如下順序加入不同體積的W下各溶 液：1111〇1/1出5〇4溶液，29.51111;0.6111〇1/1的漠酸鋼溶液，1.51111;2 111〇1/1的蘋果酸，4.51111; 然后插入銷電極（工作電極）和甘隸電極（參比電極）。參比電極和銷電極與通過放大器 (Instrument Amplifier)連接到數據采集器(GO! LINK)然后再通過USB連接到電腦。調節 攬拌器的轉速為500 r/min。在室溫下進行測量。打開logger Iite程序，進行如下操作：點 擊實驗^數據采集^采集長度（時間）設為3000 S。最后加入2.21 X l(T2mol/L的催化劑 [化L] (Cl化)2,4.5ml，使體系的總體積保持在40 ml。迅速點下開始鍵，電腦開始自動記錄體 系電位隨時間變化的實驗數據。觀察振蕩溶液的顏色可W發現溶液的顏色不斷的發生周期 性變化:紫色-棟黃色-紫色，且電位也呈現周期性的變化。
[0068] 圖11是在實例4中，未加入待測樣品時，鑒別溶液的振蕩譜圖。
[0069] 取一組鑒別溶液，當振蕩反應經過4個穩定的周期后，進入第5個振蕩周期電位最 低點時用移液槍加入40 Ul 0.288mol/L的化-m-酪氨酸，使得其在鑒別溶液中的濃度為 2.88 X 1 (r4mo 1 /L，可W看到體系出現一段抑制時間，振蕩響應圖譜如圖12所示。
[0070] 取另一組鑒別溶液，當振蕩反應經過4個穩定的周期后，進入第5個振蕩周期電位 最低點時用移液槍加入40 Ul 0.288mol/L的レ酪氨酸，使得其在鑒別溶液中的濃度為 2.88 X 1 (r4mo 1 /L，可W看到體系出現一段抑制時間，振蕩響應圖譜如圖13所示。
[0071] (3)區分鑒別 作為芳香族氨基酸同分異構體化-m-酪氨酸和心酪氨酸因分子空間結構不同，其對振 蕩體系產生的影響也不相同。比較圖12圖13可知，在第五個振蕩電位最低點分別加入40 Ul 0.288mol/L化-m-酪氨酸或心酪氨酸，使得其在鑒別溶液中的濃度為2.88 X l〇-4mol/L，化- m-酪氨酸對振蕩體系產生的抑制時間（tin)較長口5.5s)，心酪氨酸對振蕩體系產生的抑制 時間（tin)較短巧3s)。
[0072] 取事先配置好的兩個0.288mol/L的待測液(其中一個為化-m-酪氨酸，另一個為k 酪氨酸，但兩者尚未區分），將其中一個標記為樣品1，另一個標為樣品2。配置兩組上述濃度 的振蕩溶液，分別采集其振蕩電位隨時間的變化圖譜，在振蕩電位第五個最低點分別加入 40 Ul 0.288mol/L的樣品1溶液或樣品2溶液，使得其在鑒別溶液中的濃度為2.88X10- Vol/L。根據logger Iite程序記錄的振蕩電位圖譜分別記算其抑制時間。當加入待測液 樣品1時，其對體系產生的抑制時間較長(77s);當加入待測液樣品2時，其對體系產生的抑 制時間較短巧4 S)。所W得出抑制時間較長口7s)的待測液樣品1的為DL-m-酪氨酸，而相對 抑制時間較短巧4s)的待測液樣品2則為L -酪氨酸。
[0073] 圖14是W實例3實例4為基礎的化-m-酪氨酸（化-m-Tyr)和心酪氨酸a-Tyr)濃 度(C(Tyr))與抑制時間（tin)的線性關系圖。
[0074] 實施例5: 本實施例按如下步驟驗證本發明芳香族氨基酸化-m-酪氨酸和心酪氨酸的鑒別方法的 可行性。
[00對 （1)配制溶液 首先用98.3%的濃硫酸溶液配置1 mol/L的硫酸溶液，再用該硫酸溶液作為溶劑來配置 0.6mol/L的漠酸鋼溶液、2mol/L的蘋果酸溶液、2.21 X l0-2mol/L的[CuU (Cl04)2溶液。
[0076] 同時Wl mol/L硫酸為溶劑，分別配置0.15mol/L的化-m-酪氨酸和心酪氨酸的溶 液。
[0077] (2)振蕩圖譜 首先將磁力攬拌子置于50 ml燒杯中，用移液管按如下順序加入不同體積的W下各溶 液：lmol/L此S〇4溶液，28ml;0.6mol/L的漠酸鋼溶液，2ml; 2 mol/L的蘋果酸，5ml;然后插 入銷電極（工作電極）和甘隸電極（參比電極）。參比電極和銷電極與通過放大器 (Instrument Amplifier)連接到數據采集器(GO! LINK)然后再通過USB連接到電腦。調節 攬拌器的轉速為500 r/min。在室溫下進行測量。打開logger Iite程序，進行如下操作：點 擊實驗^數據采集^采集長度（時間）設為3000 S。最后加入2.21 X l(T2mol/L的催化劑 [CuL] (Cl化)2，5ml，使體系的總體積保持在40 ml。迅速點下開始鍵，電腦開始自動記錄體 系電位隨時間變化的實驗數據。觀察振蕩溶液的顏色可W發現溶液的顏色不斷的發生周期 性變化:紫色-棟黃色-紫色，且電位也呈現周期性的變化。
[0078] 圖15是在實例5中，未加入待測樣品時，鑒別溶液的振蕩譜圖。
[0079] 取一組鑒別溶液，當振蕩反應經過7個穩定的周期后，進入第8個振蕩周期電位最 低點時用移液槍加入40 Ul 0.15mol/L的化-m-酪氨酸，使得其在鑒別溶液中的濃度為1.5 X l(T4mol/L，可W看到體系出現一段抑制時間，振蕩響應圖譜如圖16所示。
[0080] 取另一組鑒別溶液，當振蕩反應經過7個穩定的周期后，進入第8個振蕩周期電位 最低點時用移液槍加入40 Ul 0.15mol/L的心酪氨酸，使得其在鑒別溶液中的濃度為1.5 X l(T4mol/L，可W看到體系出現一段抑制時間，振蕩響應圖譜如圖17所示。
[0081] (3)區分鑒別 作為芳香族氨基酸同分異構體化-m-酪氨酸和心酪氨酸因分子空間結構不同，其對振 蕩體系產生的影響也不相同。比較圖16圖17可知，在第八個振蕩電位最低點分別加入40 Ul 0.15mol/L化-m-酪氨酸或心酪氨酸，使得其在鑒別溶液中的濃度為1.5 X l〇-4mol/L，化-m- 酪氨酸對振蕩體系產生的抑制時間（tin)較長(45s)酪氨酸對振蕩體系產生的抑制時間 (tin)較短(29s)。
[0082] 取事先配置好的兩個0.15mol/L的待測液(其中一個為化-m-酪氨酸，另一個為k 酪氨酸，但兩者尚未區分），將其中一個標記為樣品1，另一個標為樣品2。配置兩組上述濃度 的振蕩溶液，分別采集其振蕩電位隨時間的變化圖譜，在振蕩電位第八個最低點分別加入 40 Ul 0.15mol/L的樣品1溶液或樣品2溶液，使得其在鑒別溶液中的濃度為1.5Xl(T4mol/ L。根據logger Iite程序記錄的振蕩電位圖譜分別記算其抑制時間。當加入待測液樣品1 時，其對體系產生的抑制時間較長(45.5s);當加入待測液樣品2時，其對體系產生的抑制時 間較短(31 S)。所W得出抑制時間較長(45.5s)的待測液樣品1的為化-m-酪氨酸，而相對抑 制時間較短(31s)的待測液樣品2則為L -酪氨酸。
[0083] 實施例6: 本實施例按如下步驟驗證本發明芳香族氨基酸化-m-酪氨酸和心酪氨酸的鑒別方法的 可行性。
[0084] (1)配制溶液 首先用98.3%的濃硫酸溶液配置1 mol/L的硫酸溶液，再用該硫酸溶液作為溶劑來配置 0.6mol/L的漠酸鋼溶液、2mol/L的蘋果酸溶液、2.21 X l〇-2mol/L的[CuU (Cl04)2溶液。
[0085] 同時Wl mol/L硫酸為溶劑，分別配置0.375mol/L的化-m-酪氨酸和心酪氨酸的 溶液。
[0086] (2)振蕩圖譜 首先將磁力攬拌子置于50 ml燒杯中，用移液管按如下順序加入不同體積的W下各溶 液：lmol/L此S〇4溶液，28ml;0.6mol/L的漠酸鋼溶液，2ml; 2 mol/L的蘋果酸，5ml;然后插 入銷電極（工作電極）和甘隸電極（參比電極）。參比電極和銷電極與通過放大器 (Instrument Amplifier)連接到數據采集器(GO! LINK)然后再通過USB連接到電腦。調節 攬拌器的轉速為500 r/min。在室溫下進行測量。打開logger Iite程序，進行如下操作：點 擊實驗^數據采集^采集長度（時間）設為3000 S。最后加入2.21 X l(T2mol/L的催化劑 [CuL] (Cl化)2，5ml，使體系的總體積保持在40 ml。迅速點下開始鍵，電腦開始自動記錄體 系電位隨時間變化的實驗數據。觀察振蕩溶液的顏色可W發現溶液的顏色不斷的發生周期 性變化:紫色-棟黃色-紫色，且電位也呈現周期性的變化。
[0087] 圖18是在實例6中，未加入待測樣品時，鑒別溶液的振蕩譜圖。
[0088] 取一組鑒別溶液，當振蕩反應經過7個穩定的周期后，進入第8個振蕩周期電位最 低點時用移液槍加入40 Ul 0.375mol/L的化-m-酪氨酸，使得其在鑒別溶液中的濃度為 3.75 X 1 (r4mo 1 /L，可W看到體系出現一段抑制時間，振蕩響應圖譜如圖19所示。
[0089] 取另一組鑒別溶液，當振蕩反應經過7個穩定的周期后，進入第8個振蕩周期電位 最低點時用移液槍加入40 Ul 0.375mol/L的レ酪氨酸，使得其在鑒別溶液中的濃度為 3.75 X 1 (r4mo 1 /L，可W看到體系出現一段抑制時間，振蕩響應圖譜如圖20所示。
[0090] 圖21是W實例5實例6為基礎的化-m-酪氨酸和心酪氨酸濃度與抑制時間的線性關 系圖。
[0091] (3)區分鑒別 作為芳香族氨基酸同分異構體化-m-酪氨酸和心酪氨酸因分子空間結構不同，其對振 蕩體系產生的影響也不相同。比較圖19圖20可知，在第八個振蕩電位最低點分別加入40 Ul 0.375mol/L化-m-酪氨酸或心酪氨酸，使得其在鑒別溶液中的濃度為3.75 X l〇-4mol/L，化- m-酪氨酸對振蕩體系產生的抑制時間（tin)較長(115.5s)，心酪氨酸對振蕩體系產生的抑制 時間（tin)較短(45s)。
[0092] 取事先配置好的兩個0.375mol/L的待測液(其中一個為化-m-酪氨酸，另一個為k 酪氨酸，但兩者尚未區分），將其中一個標記為樣品1，另一個標為樣品2。配置兩組上述濃度 的振蕩溶液，分別采集其振蕩電位隨時間的變化圖譜，在振蕩電位第八個最低點分別加入 40 Ul 0.375mol/L的樣品1溶液或樣品2溶液，使得其在鑒別溶液中的濃度為3.75 X 10- Vol/L。根據logger Iite程序記錄的振蕩電位圖譜分別記算其抑制時間。當加入待測液 樣品1時，其對體系產生的抑制時間較長(117s);當加入待測液樣品2時，其對體系產生的抑 制時間較短(43 S)。所W得出抑制時間較長（117s)的待測液樣品1的為化-m-酪氨酸，而相 對抑制時間較短(43s)的待測液樣品2則為L -酪氨酸。
[0093] 圖21是W實例5實例6為基礎的化-m-酪氨酸（化-m-Tyr)和心酪氨酸a-Tyr)濃 度(C(Tyr))與抑制時間（tin)的線性關系圖。
【主權項】
1. 一種酪氨酸同分異構體DL-m-酪氨酸（間羥基苯丙氨酸)和L-酪氨酸(對羥基苯丙氨 酸)的鑒別方法，其特征在于： 以硫酸為溶劑，配制待鑒別樣品的溶液； 應用uH2SO4 - NaBrO3- [CuL](C104)2-蘋果酸"非線性化學振蕩體系作為鑒別溶液， 記錄振蕩體系的電位隨時間的變化圖譜;在振蕩產生的任意一個穩定的電位最低點處，向 兩組鑒別溶液(非線性振蕩體系）中分別加入待鑒別樣品的溶液，根據待鑒別樣品對振蕩體 系所產生的抑制時間不同，實現對待鑒別樣品的鑒別； [CuL](C1〇4)2 中L為5,7,7，12，14，14-六甲基-1，4,8，11-四氮雜十四-4，11-二烯； 鑒別溶液中各組分的摩爾濃度為:硫酸〇. 75-1.35mol/L、溴酸鈉7.5 X 10_3-5.25 X 10- 2mol/L、[CuL] (Cl〇4)2 1 · 38 X 10-3-4 · 75 X 10-3mol/L、蘋果酸 0 · 10-0 · 30mol/L; 所述待鑒別樣品為DL-m-酪氨酸或L-酪氨酸。2. 根據權利要求1所述的區分鑒別方法，其特征在于： 向兩組鑒別溶液(非線性振蕩體系）中分別加入相同濃度的待鑒別樣品（DL-m-酪氨酸 或L-酪氨酸)后，若對振蕩體系產生的抑制時間較長，則所述待鑒別樣品為DL-m-酪氨酸;若 對振蕩體系產生的抑制時間較短，則所述待鑒別樣品為L-酪氨酸。3. 根據權利要求1或2所述的檢測方法，其特征在于:檢測溶液中各組分的摩爾濃度為 溴酸鈉 0·03mol/L、蘋果酸0·2mol/L、硫酸lmol/L、[CuL](CKk)2 2·76X 10-3mol/L。4. 根據權利要求1或2所述的區分鑒別方法，其特征在于:所述振蕩產生的任意一個穩 定的電位最低點是指振蕩產生的第2~30個電位最低點中的任意一個。5. 根據權利要求1或2所述的鑒別方法，其特征在于:待鑒別樣品在鑒別溶液中的可檢 測的濃度范圍為7.5 X 10-6-6.75 X 10-4mol/L。
【文檔編號】G01N27/26GK105954332SQ201610518839
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年7月4日
【發明人】胡剛, 孫璇璇, 宋繼梅, 胡林, 吳丁, 張望寧
【申請人】安徽大學