一種以壓敏涂料為信號讀出的便攜檢測atp含量方法【專利摘要】本發明公開了以壓敏涂料為信號讀出的便攜檢測ATP含量方法。將能構成ATP適配體的兩段DNA分別修飾上嵌有納米鉑顆粒的二氧化硅球和磁珠。在ATP存在的情況下，由于這兩段DNA與ATP的特異性識別并結合，能夠形成三明治夾心結構，從而將納米鉑固定在磁珠上，通過分離磁珠與溶液，并將清洗過的磁珠在密閉容器中與過氧化氫溶液反應，過氧化氫催化所產生的氧氣積累能夠提高氧分壓，利用不同氧分壓對壓敏涂料的熒光猝滅程度不同，間接檢測ATP的濃度。該技術成功地應用于人體血清中ATP濃度檢測。這種檢測使用熒光分光光度計做為檢測手段，也可直接用裸眼進行比色檢測，具有檢測成本低、操作簡單、定量結果準確，能即時檢測，便攜等優點。【專利說明】一種以壓敏涂料為信號讀出的便攜檢測ATP含量方法
技術領域：
[0001]本發明涉及一種以壓敏涂料為信號讀出的便攜檢測ATP含量方法，屬于分析化學領域。技術背景[0002]便攜式即時檢測器由于具有儀器小型、檢測成本低、操作簡單、定量結果準確、能即時檢測等特點，現已引起了廣泛的關注，并得以相應的發展應用。相比于傳統的分析檢測手段，便攜式即時檢測器在一定程度上擺脫檢測分析過程中在時間、空間、設備成本和操作技能上的制約，能夠完成低成本、及時、簡單、準確的分析檢測，是一種對實驗檢測條件及操作者沒有太高要求的分析技術。常見的便攜式即時檢測器有溫度計，濕度計，壓力計，紅外線二氧化碳測定儀以及可燃性氣體檢測儀等手持式即時檢測器，這些儀器一般都只對應某一種檢測對象，如:溫度，濕度，二氧化碳，和可燃性氣體，目標單一。如果能將便攜式即時檢測器和傳生物傳感技術相結合，則能拓展便攜即時檢測器的應用范圍，同時大大地降低分析檢測成本。在總多的便攜式檢測器中，最成功的例子之一就是血糖儀，這種血糖檢測器體積小、方便攜帶、檢測成本低、定量結果準確、操作簡便，病人自己根據說明書就可以隨時隨地地進行血糖的檢測。為彌補其僅能用于還原性糖類(如血糖)的檢測的缺點，LU課題組將其與生物傳感技術結合，使其能夠用于檢測乙型肝炎病毒(YuXiang；YiLu,UsingCommerciallyAvailablePersonalGlucoseMetersforPortableQuantificat1nofDNA.AnalyticalChemistry[J],2012,84(4):1975-1980)、鉛離子和鈾離子(YuXiang；YiLu,AninvasiveDNAapproachtowardageneralmethodforportablequantificat1nofmetal1nsusingapersonalglucosemeter[J].ChemicalCommun1-cat1ns，2013，49，585-587)。楊則通過過氧化氫在自制的條狀管道中分解引起氣體膨脹來對可卡因進行定量測定(ZhiZhu,ZhichaoGuan,ShashaJia,AuiPtNanoparticleEncapsulatedTarget-ResponsiveHydrogelwithVolumetricBar-ChartChipReadoutforQuantitativePoint-of-CareTesting[J].Angewandte-Chemie，2014,53，12503-12507)。[0003]壓敏涂料，一種起源于上世紀80年代的測壓技術，通常用于飛行器風洞試驗當中。由于是通過非接觸式測量，能真實測地反映檢測對象的表面壓力分布，且具有空間高分辨率以及節約時間和低廉的經濟成本等優勢，現已得到廣泛的應用。壓敏涂料的工作原理是基于易被氧猝滅的熒光劑在不同氣壓環境中，氧分壓的不同導致了熒光劑被猝滅的程度不同，通過檢查熒光強度即可得到相應的壓力。[0004]三磷酸腺苷(ATP)是體內組織細胞一切生命活動所需能量的直接來源和主要來源，它能夠儲存和傳遞化學能，參與合成蛋白質、脂肪、糖和核苷酸，而且能夠促使機體各種細胞的修復和再生，增強細胞代謝活性，對治療各種疾病均有較強的針對性。因此，定量檢測ATP的含量對于科學研究和臨床診斷具有重要的實際意義。目前檢測ATP的傳感器有比色傳感器(JoseD.A.,MishraS.，GhoshA.,etal.0rg.Lett.,2007,9:1979-1982.)，電化學適配體傳感器(DuY.，LiB.Y.，WeiH.，etal.Anal.Chem.,2008，80:5110-5117.;ZuoX.L.，XiaoΥ.，PlaxcoK.ff..J.Am.Chem.Soc.,2009,131:6944-6945.;YaoW.，WangL.，H.WangY.，etal..B1sens.B1electron.,2009，24:3269-3274.;LiuX.Q.，ShiL.H.，Niuff.X.，etal.Angew.Chem.，Int.Ed.，2007，46:421-424.;LinZ.Y.，LuoF.，etal.Chem.Commun.，2011，47，8064-8066.)等J旦是這些傳感器的一個普遍缺點是需要用到實驗室里的儀器設備，這類儀器設備操作復雜，而且不方便攜帶，無法實現現場檢測。【
發明內容】[0005]本發明目的在于開發了一種以壓敏涂料為信號讀出的便攜檢測ATP含量方法，使ATP的檢測能夠在低成本的條件下簡單快捷準確的完成。該方法的的靈敏度高、特異性好，檢測成本低。[0006]為實現上述目的，本發明采用如下技術方案:一種便攜式檢測ATP含量的方法包括以下步驟:(1)將200yL、0.05mg/mL壓敏涂料涂于2毫升的離心管內壁，并將該離心管作為信號讀出工具；(2)制備以硅球為納米鉑顆粒載體的催化劑:以正硅酸乙酯為硅源合成二氧化硅球，再用原位生長法在其表面嵌入納米鉑顆粒使其具有一定的催化性能;最后再修飾上氨基基團以便于該材料的后續使用；(3)以SuIfo-SMCC為交聯劑，將步驟(2)催化劑即嵌有納米鉑的二氧化硅球修飾到DNA鏈上；(4)將修飾有鏈霉親合素的磁珠分散于I3BS緩沖溶液中，加入100yL修飾有生物素的DNA，室溫振蕩30分鐘，制備修飾在磁珠上的DNA化合物；(5)將步驟(3)修飾有嵌有納米鉑的二氧化硅球的DNA化合物與步驟(4)修飾在磁珠上的DNA化合物混合，加入ATP的待測樣品，室溫培育1.5小時，形成磁珠一ATP—催化劑三明治結構型物質；(6)用磁鐵分離步驟(5)中的磁珠一ATP—催化劑與其他物質，用磷酸鹽緩沖溶液洗滌磁珠三次后，加入10UL磷酸鹽緩沖溶液，重新分散，得到與目標位濃度成相關關系的磁珠一ATP—催化劑混合液；(7)將上述所得全部液體加入到含有300口1^農度為2.0mol/L的過氧化氫的離心管中，并將該離心管置于(I)中的內壁涂有壓敏涂料的離心管中進行檢測;檢測方法用目視法直接比色，或用熒光分光光度計進行準確檢測；(8)以已知濃度的ATP溶液為橫坐標，以相對應的熒光強度作為縱坐標，繪制曲線，得到ATP濃度一熒光強度線性方程:AlFA+BlgC，然后根據線性方程和待測樣品的熒光值計算相對應的待測樣品中的目標位濃度，其中AIc為反應前后熒光強度變化值;C為其所對應的ATP濃度，單位為nmoI/L。[0007]具體步驟為:(I)將壓敏涂料(200yL，0.05mg/mL)涂于2毫升的離心管內壁，并將該離心管作為信號讀出工具。[0008](2)按照參考文獻(Hermanson，G.T.B1conjugateTechniques;Elsevier:London,2008,B.G.T.Cheng-YuLai,DusanM.Jeftinija,KsenijaJeftinija,ShuXu,anda.V.S.-Y.L.SrdijaJeftinija,J.Am.Chem.Soc,2002,125,4451和R.M.R.HyunjoonSong,JamesD.Hoefelmeyer,RussellKomor,andM.G.KrisztianNiesz,PeidongYang,andGaborA.Somorjai,J.Am.Chem.Soc,2005,128，3027.)制備嵌有納米鉑顆粒的二氧化硅球，并將其修飾與DNA鏈上，具體步驟如下:①、先將0.25g的CTAB溶于120mL的去離子水中，同時加入ImL的NaOH溶液(2.00mol/L)，加熱至353K，加入TEOS2.5mL和MPTMs245yL，攪拌2小時，即得到二氧化硅球；②、將0.5g的上述二氧化硅球與26.6mg的PVP和124.3yg的氯金酸同時加入到400mL體積分數為90%的甲醇溶液中回流3h，即得到嵌有納米鉑顆粒的二氧化硅球；(3)以Sulfo-SMCC為交聯劑，將上述嵌有納米鉑顆粒的二氧化硅球修飾于DNA鏈上制備修飾有催化劑的DNA化合物。[0009](4)取濃度為Img/mL修飾有鏈霉親合素的磁珠0.6mL用I3BS緩沖溶液洗滌并重新分散于0.6mLPBS緩沖液，加入100yL修飾有生物素的DNA，室溫振蕩30分鐘，制備修飾在磁珠上的DNA化合物。[0010](5)將步驟(3)上修飾有嵌有納米鉑的二氧化硅球的DNA化合物與步驟(4)修飾在磁珠上的DNA化合物混合，加入ATP的待測樣品，室溫培育1.5小時。[0011](6)用磁鐵分離步驟(5)中的磁珠與混合溶液，用磷酸鹽緩沖溶液洗滌磁珠三次后，加入10yL磷酸鹽緩沖溶液(0.01mol/LpH=7.3)。[0012](7)將步驟(6)所得液體加入到含有300口1^農度為2.0mol/L的過氧化氫的離心管(500yL)中，并將該離心管置于(I)中的內壁涂有壓敏涂料的離心管中進行檢測。檢測方法用目視法直接比色，或用熒光分光光度計進行準確檢測。[0013](8)以已知濃度的ATP溶液為橫坐標，以相對應的熒光強度作為縱坐標，繪制曲線，得到ATP濃度一熒光強度線性方程:△IC=A+BlgC，然后根據線性方程和待測樣品的熒光值可以計算相對應的待測樣品中的目標位濃度，其中AIc為反應前后熒光響應強度;C為其所對應的ATP濃度，單位為nmoI/L。[0014]步驟(3)中所述的修飾有轉化酶的DNA化合物序列為從左到右5’到3’:HS-(CH2)6_ACCTGGGGGAGTATo[0015]步驟(4)中所述的修飾有生物素的DNA序列為從左到右5’到3’:TGCGGAGGAAGGT-生物素。[0016]步驟(5)中所述的修飾有催化劑的DNA化合物與修飾在磁珠上的DNA化合物的摩爾比為1:1。[0017]步驟(5)中所述的含ATP的待測樣品的加入量為3yL。[0018]—種以壓敏涂料為信號讀出工具檢測ATP技術包括:所用的壓敏涂料為PtTFPP，是一種中心配位離子為鉑的卟啉衍生物，激發波長為415納米，吸收波長為645納米。[0019]本發明的顯著優點在于:(I)制備過程簡單，無需先進的檢測儀器。[0020](2)信號讀出工具能夠多次重復利用，大大減低了檢測成本。[0021](3)該方法定量結果準確、信號即可通過熒光檢測器獲得，也可直接通過裸眼目視對比。【附圖說明】[0022]圖1為利用本發明中的信號讀出工具檢測不同濃度的ATP熒光響應值及相關相片。【具體實施方式】[0023]—種便攜式檢測ATP含量的方法包括以下步驟:(1)將200yL、0.05mg/mL壓敏涂料涂于2毫升的離心管內壁，并將該離心管作為信號讀出工具；(2)制備以硅球為納米鉑顆粒載體的催化劑:以正硅酸乙酯為硅源合成二氧化硅球，再用原位生長法在其表面嵌入納米鉑顆粒使其具有一定的催化性能;最后再修飾上氨基基團以便于該材料的后續使用；(3)以SuIfo-SMCC為交聯劑，將步驟(2)催化劑即嵌有納米鉑的二氧化硅球修飾到DNA鏈上；(4)將修飾有鏈霉親合素的磁珠分散于I3BS緩沖溶液中，加入100yL修飾有生物素的DNA，室溫振蕩30分鐘，制備修飾在磁珠上的DNA化合物；(5)將步驟(3)修飾有嵌有納米鉑的二氧化硅球的DNA化合物與步驟(4)修飾在磁珠上的DNA化合物混合，加入ATP的待測樣品，室溫培育1.5小時，形成磁珠一ATP—催化劑三明治結構型物質；(6)用磁鐵分離步驟(5)中的磁珠一ATP—催化劑與其他物質，用磷酸鹽緩沖溶液洗滌磁珠三次后，加入10UL磷酸鹽緩沖溶液，重新分散，得到與目標位濃度成相關關系的磁珠一ATP—催化劑混合液；(7)將上述所得全部液體加入到含有300口1^農度為2.0mol/L的過氧化氫的離心管中，并將該離心管置于(I)中的內壁涂有壓敏涂料的離心管中進行檢測;檢測方法用目視法直接比色，或用熒光分光光度計進行準確檢測；(8)以已知濃度的ATP溶液為橫坐標，以相對應的熒光強度作為縱坐標，繪制曲線，得到ATP濃度一熒光強度線性方程:AlFA+BlgC，然后根據線性方程和待測樣品的熒光值計算相對應的待測樣品中的目標位濃度，其中AIc為反應前后熒光強度變化值;C為其所對應的ATP濃度，單位為nmoI/L。[0024]步驟(3)中所述的修飾有轉化酶的DNA化合物序列為從左到右5’到3’:HS-(CH2)6_ACCTGGGGGAGTATo[0025]步驟(4)中所述的修飾有生物素的DNA序列為從左到右5’到3’:TGCGGAGGAAGGT-生物素。[0026]步驟(5)中所述的修飾有催化劑的DNA化合物與修飾在磁珠上的DNA化合物的摩爾比為1:1。[0027]步驟(5)中所述的含ATP的待測樣品的加入量為3yL。[0028]實施例1以下實施例結合附圖來說明應用本發明所述方法應用于人血清樣品中ATP濃度的檢測的操作過程:1、將0.2mL濃度為0.05mg/mL的PtTFPP甲苯溶液涂于2mL的PE離心管內壁，烘干即可得到信號讀出工具。[0029]2、修飾有二氧化硅球的DNA化合物的合成。參考文獻(Hermanson,G.T.B1conjugateTechniques;Elsevier:London,2008)。具體步驟如下:A、將30ymol/L修飾有巰基的DNA與60ymol/LTCEP于磷酸鹽緩沖溶液中混合均勻，室溫培育I小時；B、將1.00mg嵌有納米鉑的二氧化硅球與0.5mgSulfo-SMCC于緩沖溶液(0.01mol/LPBS，PH=7.3，0.1mol/LNaCl)中混合5min，室溫下置于搖床上振動I小時，再將混合物離心分離，棄去清液，保留沉淀物；C、將A與B制備的物質混合，室溫下反應48小時。[0030]3、修飾有催化劑的磁珠的制備與ATP的檢測，具體步驟如下:(I)將修飾有鏈霉親和素的磁珠(0.6mL,Img/mL)溶于由0.1mol/LNaCl、0.01mol/L卩!1=7.3的1^3、0.05%吐溫_20組成的緩沖溶液中，加入100口口農度為100μΜ修的飾有生物素的DNA，室溫振蕩30分鐘。[0031](2)將步驟2中制備的20μΜ修飾有二氧化硅球的DNA化合物與步驟3(1)中20μΜ修飾在磁珠上的DNA化合物以摩爾比1:1混合均勻，加入含ATP的待測樣品(ATP濃度從低到高分別為IX10—14、3.16X10—14、1X10—13、3.16X10—13、1X10—12和3.16X10—12mol/L)，室溫培育1.5小時，發生適配體和ATP的特異性結合反應，生成三明治夾心結構物質。[0032](3)用磁鐵分離步驟(2)中的磁珠與混合溶液，用由0.1MNaCU0.01MPH=7.3的PBS,0.05%吐溫-20組成的緩沖溶液洗滌磁珠三次并向磁珠中加入該緩沖溶液，然后將該溶液與過氧化氫溶液同時加入到離心管(500yL)中，并將該離心管置于步驟I中的內壁涂有壓敏涂料的離心管中反應15分鐘后進行檢測。[0033](4)可以用熒光分光光度計進行準確測量，記錄讀數，并擬合相關線性方程。如圖1所示，隨著ATP濃度升高，相對應的熒光值下降，裸眼也可看出其亮度逐漸減弱。[0034]實施例21、人血清中ATP濃度的檢測，具體步驟如下:向修飾有二氧化硅球的DNA化合物與飾在磁珠上的DNA化合物的混合物中加入人血清，室溫培育I.5個小時后，用磁鐵分離混合物，然后用磷酸鹽緩沖溶液洗滌三次，并加入10yL該緩沖液。最后將該混合液與300口1^農度為2.0mol/L的過氧化氫溶液同時加入到離心管(500yL)中，并將該離心管置于步驟I中的內壁涂有壓敏涂料的離心管中反應15分鐘，最后將涂有壓敏涂料的離心管置于熒光分光光度計中進行檢測。記錄數據，算出該人血清樣品中ATP的含量。[0035]2、本發明所述方法對ATP檢測的特異性，具體步驟如下:為檢測本發明所述方法的特異性，將實施例1，步驟3中所使用的ATP換成其他干擾物質，分別為CTP、UTP、GTP和ATP，且濃度均為IX10—1(3mol/L。結果表明，本發明所述方法對ATP具有較好的特異性。[0036]以上所述僅為本發明的較佳實例，凡本發明專利范圍所做的變化、相關催化劑的使用以及壓敏涂料在生物傳感中的相關應用皆屬本發明的涵蓋范圍。【主權項】1.一種以壓敏涂料為信號讀出的便攜檢測ATP含量方法，其特征在于:包括以下步驟:(1)將200yL、0.05mg/mL壓敏涂料涂于2毫升的離心管內壁，并將該離心管作為信號讀出工具；(2)制備以硅球為納米鉑顆粒載體的催化劑:以正硅酸乙酯為硅源合成二氧化硅球，再用原位生長法在其表面嵌入納米鉑顆粒使其具有催化性能;最后再修飾上氨基基團以便于該材料的后續使用；(3)以Sulfo-SMCC為交聯劑，將ImL濃度為0.10mg/mL的催化劑，即步驟(2)中所制備的嵌有納米鉑的二氧化硅球修飾到100yL、100μΜDNA鏈上；(4)將修飾有鏈霉親合素的磁珠分散于PBS緩沖溶液中，加入100yL濃度為100μΜ修飾有生物素的DNA，室溫振蕩30分鐘，制備修飾在磁珠上的DNA化合物；(5)將步驟(3)修飾有嵌有納米鉑的二氧化硅球的DNA化合物與步驟(4)修飾在磁珠上的DNA化合物混合，加入ATP的待測樣品，室溫培育1.5小時，形成磁珠一ATP—催化劑三明治結構型物質；(6)用磁鐵分離步驟(5)中的磁珠一ATP—催化劑與其他物質，用磷酸鹽緩沖溶液洗滌磁珠三次后，加入10UL磷酸鹽緩沖溶液，重新分散，得到與目標位濃度成相關關系的磁珠一ATP—催化劑混合液；(7)將上述所得全部液體加入到含有300口1^農度為2.0mol/L的過氧化氫的離心管中，并將該離心管置于(I)中的內壁涂有壓敏涂料的離心管中進行檢測;檢測方法用目視法直接比色，或用熒光分光光度計進行準確檢測；(8)以已知濃度的ATP溶液為橫坐標，以相對應的熒光強度作為縱坐標，繪制曲線，得到ATP濃度一熒光強度線性方程:AlFA+BlgC，然后根據線性方程和待測樣品的熒光值計算相對應的待測樣品中的目標位濃度，其中AIc為反應前后熒光強度變化值;C為其所對應的ATP濃度，單位為nmoI/L。2.根據權利要求1所述的以壓敏涂料為信號讀出的便攜檢測ATP含量方法，其特征在于步驟(I)中所用的壓敏涂料為具有強熒光性且易被氧氣猝滅的PtTFPP，是一種中心配位離子為鉑的卟啉衍生物，激發波長為415納米，吸收波長為645納米。3.根據權利要求1所述的以壓敏涂料為信號讀出的便攜檢測ATP含量方法，其特征在于:步驟(3)中所述的修飾有催化劑的DNA化合物序列為從左到右5’到3’:HS-(CH2)6-ACCTGGGGGAGTATo4.根據權利要求1所述的以壓敏涂料為信號讀出的便攜檢測ATP含量方法，其特征在于:步驟(4)中所述的修飾有生物素的DNA序列為從左到右5，到3’:TGCGGAGGAAGGT-生物素。5.根據權利要求1所述的以壓敏涂料為信號讀出的便攜檢測ATP含量方法，其特征在于:步驟(5)中所述的修飾有催化劑的DNA化合物與修飾在磁珠上的DNA化合物的摩爾比為1:1;步驟(5)中所述的含ATP的待測樣品的加入量為3yLo6.根據權利要求1所述的以壓敏涂料為信號讀出的便攜檢測ATP含量方法，其特征在于:步驟(7)中每次只需更換反應器:500yL的離心管。7.根據權利要求1所述的以壓敏涂料為信號讀出的便攜檢測ATP含量方法，其特征在于:步驟(8)中，在實驗室檢測時，用熒光分光光度計進行準則檢測，在沒有熒光儀的條件下直接進行目視比色檢測。【文檔編號】G01N21/64GK105954210SQ201610326142【公開日】2016年9月21日【申請日】2016年5月17日【發明人】林振宇,李榮杰,楊偉強,郭隆華,邱彬【申請人】福州大學