一種用于食品中腸致病性大腸桿菌檢測的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種用于食品中腸致病性大腸桿菌檢測的試劑盒。腸致病性大腸桿菌EPEC作用部位在小腸，粘附在十二指腸、空腸和回腸上段粘膜、使微絨毛刷狀緣破壞。是嬰幼兒腹瀉的主要病原菌。現有技術的檢測方法耗時耗力，檢測不便，而本發明提供了特異性檢測腸致病性大腸桿菌的試劑盒，試劑盒中含有特異性結合腸致病性大腸桿菌的適配子，所述適配子為單鏈DNA。本發明試劑盒具有檢測時間短、研發周期短、質量穩定、操作簡單等優點，在食品與衛生安全檢測中得到廣泛應用。
【專利說明】一種用于食品中腸致病性大腸桿菌檢測的試劑盒 發明領域
[0001] 本發明屬于食品檢測技術領域，具體涉及一種用于食品中腸致病性大腸桿菌檢測 的試劑盒。
【背景技術】
[0002] 致病性大腸桿菌(EPEC)是一種以糞口途徑傳播的，能導致人類多系統感染的腸道 致病菌，尤其是引起嬰幼兒的腹瀉，成人的腸道及泌尿系統感染。自七十年代以來，EPEC已 成為醫院獲得性感染中一種活躍的病原微生物。致病性大腸桿菌是嬰兒腹瀉的主要病原 菌，不產生毒素，有高度傳染性，嚴重者可致死，成人少見。致病性大腸桿菌根據是否含有 EPEC黏附因子（EPEC adherence factor, EAF)的質粒而被分成典型致病性大腸桿菌 (typical EPEC)和非典型致病性大腸桿菌(atypical EPEC)。非典型致病性大腸桿菌既可 以感染人也可以感染牲畜;典型致病性大腸桿菌以人為唯一宿主，而且多見于發展中國家， 發達國家較少見。
[0003] 腸致病性大腸埃希菌是引起全球嬰幼兒腹瀉和成人散發性腹瀉的重要病原菌之 一，目前研究表明EPEC主要通過黏附和脫落損傷導致腸粘膜損傷。腸致病性大腸埃希菌 EPEC感染的特點是病原菌能本能性粘附到宿主細胞膜，破壞細胞微絨毛，并在粘附細菌下 誘導由細胞支架蛋白形成杯樣基底膜，運種現象稱之為"粘附與脫落損傷"。EPEC的粘附與 脫落效應特征是依賴Es地、EspD和EspA轉運蛋白構成了對宿主細胞的緊密粘附，并在粘附 細胞下清除細胞微絨毛，積累纖維肌動蛋白。Es地蛋白可與EspD蛋白相互作用而插入宿主 細胞膜形成微孔，使得EPEC毒力因子可通過細胞膜上形成的微孔直接進入宿主細胞，入侵 的毒力因子促使細菌粘附與抹平效應的形成。Es地缺失的突變EPEC不能介導臨近粘附細胞 微絨毛的延伸，也不能阻止巨隧細胞的吞隧作用。由于Es地蛋白是腸致病性大腸桿菌致病 的關鍵蛋白，若能找到能抑制EPEC的致病作用的物質，將為EPEC治療尋找新的策略，為未來 預防和治療EPEC做出重大貢獻。
[0004] 目前，國內外在食品中大腸桿菌檢測時常用的檢測方法因其檢測手段、識別對象 各有不同而各具優缺點。傳統檢測大腸桿菌的方法需要先分離再培養，然后用經典的方法 鑒定，耗時、不靈敏是這些方法普遍存在的問題。免疫學方法簡單、方便、迅速、特異性較好， 但是仍有交叉反應比較嚴重、假陽性多、靈敏度偏低等不足之處。聚合酶鏈式反應(PCR)技 術雖具有準確、靈敏、快速的特點，但其在檢測數目較多的樣品時操作比較繁雜，因此在聚 合酶鏈式反應(PCR)技術的基礎上又衍生出很多新型聚合酶鏈式反應(PCR)技術，如多重 PCR技術，然而多重PCR雖簡化了PCR實驗的操作，但是由于該技術需數對引物同時進行擴 增，很容易產生非特異性條帶或假陽性，影響檢測結果。
[0005] 通過指數富集配體的系統進化（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)技術篩選獲得的寡核苷酸序列稱為適配子(aptamer)。其 原理就是利用分子生物學技術，構建人工合成的單鏈隨機寡核苷酸文庫，其隨機序列長度 在20-100個堿基左右，將隨機寡核苷酸文庫與靶分子相互作用，保留結合的寡核苷酸配基， 經反復擴增、篩選數個循環，即可使與該靶子特異結合的寡核苷酸序列得到富集，最終獲得 靶分子的特異寡核苷酸配基。該技術具有庫容量大、靶分子范圍廣、親和力高、特異性強等 優點。在臨床檢測方面，特別是對一些未知的致病性細菌或病毒的研究，雖然不知道其內部 結構、功能以及這些物質的表位，但將其作為靶物質，通過SELEX技術篩選到其相應的適配 子，以檢測靶物質，已成為該領域的研究熱點。
[0006] 利用SELEX技術篩選獲得的適配子識別分子的模式與蛋白抗體類似，但與蛋白類 抗體相比，核酸類配基具有更多的優越性，如不受免疫條件和免疫源性限制，可體外人工合 成，變性與復性可逆，可修飾并有利于長期保存和室溫運輸等。更重要的是，適配子的靶分 子更為廣泛，包括金屬離子、有機染料、氨基酸、細胞因子、輔因子、氨基糖苷、抗生素、堿基 類似物、核苷酸和多肽等。其中蛋白質類靶分子最多，包括酶、生長因子、抗體、轉錄因子、細 胞粘附分子和選擇素等。完整的病毒顆粒和細菌病原體，甚至完整的細胞也可以通過復合 靶子SELEX技術或消減SELEX技術篩選出高親和力的寡核苷酸配基。適配子比抗體具有更高 的特異性和精確識別能力，甚至能識別單抗不能區分的蛋白質分子。這些特性使得適配子 在生物醫藥和食品衛生研究領域得到廣泛應用，成為不可缺少的有力工具。
【發明內容】
[0007] 本發明公開了一種高特異高敏感檢測腸致病性大腸桿菌EPEC的方法，提高了它的 檢測和診斷效率。
[0008] 為了解決現有大腸氏菌檢測中存在的檢測周期長、靈敏度低、假陽性多等問題，本 發明提供一種特異識別腸致病性大腸桿菌的試劑盒及其應用。
[0009] 上述試劑盒，適配子可以采用生物素標記。
[0010] 本發明中，所述的核酸適配體能夠特異結合腸致病性大腸桿菌。
[0011] 本發明另外提供一種腸致病性大腸桿菌適配子的篩選方法。
[0012] 隨機單鏈DNA文庫和引物由上海生物工程有限公司合成。
[0013] 隨機單鏈DNA文庫：5 ' -TTGGACAGTGGACGTGAAGC(N35)GACCAAGTGACAGTGACGAG-3 ' (注:n35代表35個A、T、C、G堿基中任意一種的35個集合）。
[0014] 引物1:5 ' -TTGGACAGTGGACGTGAAGC-3 '
[0015] 引物n :5'-CTCGTCACTGTCACTTGGTC-3'
[0016]
[0017]引物IV: 5 ' -生物素-CTCGTCACTGTCACTTGGTC-3 '。
[0018] 2. SELEX篩選獲得腸致病性大腸桿菌特異的寡核苷酸適配子
[0019] 1) SELEX 篩選過程：
[0020] a.首輪篩選，取合成的隨機單鏈DNA 10yg加入到400ul IX結合緩沖液，95度變性 5min，然后迅速置于冰上lOmin;
[0021 ] b.加入lmL腸致病性大腸桿菌菌懸液2.0 X 108，于37°C搖床lOOrpm結合1.2小時， 使單鏈DNA文庫與菌充分作用；
[0022] c.更換離心管，以去除與管壁結合的單鏈DNA，室溫下離心10 OOOrpm離心10min分 離未與菌結合的單鏈DNA文庫；
[0023] d.棄上清，加入600yL 1 X沖洗緩沖液，離心10 OOOrpm離心10min，重復此過程4 次，目的是洗去未與菌結合的核酸片段；
[0024] e ?接上步離心后去上清，加入lOOliL去離子水99°C加熱3min，高速離心18 OOOrpm 離心15min棄沉淀，換管留上清(核酸片段存于上清中），-20°C保存備用。
[0025] 2)PCR富集與腸致病性大腸桿菌特異結合的寡核苷酸適配子：
[0026] 每輪篩選后獲得的與腸致病性大腸桿菌特異結合的寡核苷酸適配子文庫通過PCR 擴增得到富集；
[0027] a.以上述上清為模板，通過引物I和引物IV擴增產生一端帶生物素標記的雙鏈 DNA；
[0028] b. PCR擴增條件:95 °C預變性3min，然后進行30循環95 °C變性35s，60 °C退火37s，72 °C延伸33s，最后72°C延伸10min;
[0029] c. PCR產物純化后，一端帶生物素標記的雙鏈DNA通過生物素-鏈親合素之間的作 用與鏈親合素交聯的磁珠結合，經過IX連接（the standard Binding and Washing Buffer，B&W)緩沖液洗滌3次，用lOOmM的新鮮NaOH 37°C變性30min，使不帶生物素的單鏈 DNA從鏈親合素交聯的磁珠上洗脫下來，測定其單鏈DNA的濃度，用作下一輪篩選的富集庫。
[0030] 3)重復篩選:重復上述SELEX篩選過程和PCR擴增富集過程，共進行12輪篩選，其中 第6、8輪分別用克雷伯菌、腸出血性大腸桿菌進行反篩。
[0031 ]特異識別腸致病性大腸桿菌的寡核苷酸適配子的核苷酸序列如下：
[0056] 本發明通過SELEX技術的篩選過程，獲得高親和性特異識別腸致病性大腸桿菌的 寡核苷酸適配子(適配體），用于快速、準確檢測腸致病性大腸桿菌。
[0057] 以上述核酸適配子篩選文庫為基礎，可對文庫兩端的固定序列的個別核苷酸進行 替換、顛倒、移位，或對其長度進行小幅延長或縮短，或對文庫中間的隨機序列進行延長或 縮短，或對擴增文庫的引物作相應的簡單改造，然后制備簡單改造后的文庫和引物進行核 酸適配子的篩選、PCR擴增和分析與應用。
[0058] 本發明的有益效果:本發明設計出了一個性能優秀的隨機單鏈寡核苷酸文庫。文 庫具有接近長度下限的短固定序列和較長的隨機序列，充分保證了文庫中單鏈寡核苷酸的 多樣性。文庫固定序列（引物序列）的獨特設計能使用高退火溫度進行PCR擴增，既能有效獲 得目的產物，又能有效抑制非特異性產物。本文庫及引物應用于腸致病性大腸桿菌的核酸 適配子篩選獲得成功，所述的適配子可以用于制備檢測試劑盒，從而用于食品中的腸致病 性大腸桿菌的檢測。本方法具有檢測時間短、研發周期短、質量穩定、操作簡單等優點，在食 品與衛生安全檢測中能夠得到廣泛應用。
【具體實施方式】
[0059] 實施例1腸致病性大腸桿菌菌液的制備
[0060] 將購買的保藏編號為編號ATCC43887的EPEC菌株，在LB液體培養基試管中，37攝氏 度，180r/min搖動過夜，備用。
[0061] 實施例2適配子的獲得
[0062] 1、隨機單鏈DNA文庫和引物由上海生物工程有限公司合成。
[0063] 隨機單鏈DNA文庫：5'_
[0064] TTGGACAGTGGACGTGAAGC(N35)GACCAAGTGACAGTGACGAG-3'（注：n35代表35個A、T、C、 G堿基中任意一種的35個集合）。
[0065] 引物 1:5 ' - TTGGACAGTGGACGTGAAGC-3 '
[0066] 引物 n : 5 ' -CTCGTCACTGTCACTTGGTC-3 '
[0067] 引物 m : 5 地高辛-TTGGACAGTGGACGTGAAGC-3 '
[0068] 引物IV: 5 ' -生物素-CTCGTCACTGTCACTTGGTC-3 '。
[0069] 2. SELEX篩選獲得腸致病性大腸桿菌特異的寡核苷酸適配子
[0070] 1)SELEX 篩選過程：
[0071] a.首輪篩選，取合成的隨機單鏈DNA 10yg加入到400ul IX結合緩沖液，95度變性 5min，然后迅速置于冰上lOmin;
[OO72] b.加入lmL腸致病性大腸桿菌菌懸液2.0 X 108,于37°C搖床lOOrpm結合1.2小時， 使單鏈DNA文庫與菌充分作用；
[0073] c.更換離心管，以去除與管壁結合的單鏈DNA，室溫下離心10 OOOrpm離心10min分 離未與菌結合的單鏈DNA文庫；
[0074] d.棄上清，加入600yL 1 X沖洗緩沖液，離心10 OOOrpm離心10min，重復此過程4 次，目的是洗去未與菌結合的核酸片段；
[0075] e ?接上步離心后去上清，加入lOOliL去離子水99°C加熱3min，高速離心18 OOOrpm 離心15min棄沉淀，換管留上清(核酸片段存于上清中），-20°C保存備用。
[0076] 2)PCR富集與腸致病性大腸桿菌特異結合的寡核苷酸適配子：
[0077] 每輪篩選后獲得的與腸致病性大腸桿菌特異結合的寡核苷酸適配子文庫通過PCR 擴增得到富集；
[0078] a.以上述上清為模板，通過引物I和引物IV擴增產生一端帶生物素標記的雙鏈 DNA；
[0079] b. PCR擴增條件:95 °C預變性3min，然后進行30循環95 °C變性35s，60 °C退火37s，72 °C延伸33s，最后72 °C延伸lOmin;
[0080] c. PCR產物純化后，一端帶生物素標記的雙鏈DNA通過生物素-鏈親合素之間的作 用與鏈親合素交聯的磁珠結合，經過IX連接（the standard Binding and Washing Buffer，B&W)緩沖液洗滌3次，用lOOmM的新鮮NaOH 37°C變性30min，使不帶生物素的單鏈 DNA從鏈親合素交聯的磁珠上洗脫下來，測定其單鏈DNA的濃度，用作下一輪篩選的富集庫。 [0081 ] 3)重復篩選:重復上述SELEX篩選過程和PCR擴增富集過程，共進行12輪篩選，其中 第6、8輪分別用克雷伯菌、腸出血性大腸桿菌進行反篩。
[0082] 4)富集寡核苷酸適配子與菌結合率的測定：
[0083]第7、9、11、12輪SELEX篩選的產物，以標記地高辛的引物m和標記生物素的引物IV 進行PCR擴增，純化的PCR產物與鏈親和素標記的磁珠充分反應并用NaOH解鏈，地高辛標記 的單鏈DNA游離在上清中；
[0084] 5)富集寡核苷酸適配子文庫的測序結果與分析：
[0085] a.將最后的富集文庫擴增為雙鏈，連接pEGM-T載體，轉化E. coli DH5a，隨機挑取 70個陽性克隆進行DNA序列測定，其中24個為可用序列，見SEQ ID NO: 1-24所示；
[0086] 實施例3結合特性驗證
[0087] 將適配子分別取1.5iig，用牛小腸堿性磷酸酶(CIP)37°C消化lh，純化回收去磷酸 化的DNA;通過T4多核苷酸激酶標記[y-32P]ATP于去磷酸化的DNA分子末端。lOnmol放射性 標記的DNA適配子分別與不同濃度的菌體37°C孵育30min，各組反應液經硝酸纖維素膜濾 過，洗滌濾膜，干燥濾膜，液閃計數儀測定濾膜上殘留的放射量，同一樣品平行做兩次測定。 計算各個適配子與菌體的解離常數。結果如下：
[0090] 從以上結果可以看出，本發明的24個適配子具有非常強的結合特性，現有技術中 也沒有所述結合特性的適配子能夠結合所述的菌體。
[0091] 實施例5菌體的鑒定
[0092]寡核苷酸適配子SEQ ID NO: 1-24的序列送上海生物工程有限公司合成并在5'端 標記羥基熒光素(FAM)。
[0093] 取5'FAM熒光標記的寡核苷酸適配子SEQ ID N0:l-24(100nM)各300此，分別與腸 致病性大腸桿菌EPEC，腸出血性大腸桿菌、化膿性鏈球菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌（1.5 X108)于37°C孵育lh，用lXBB(50mM Tris-HCl(pH7.4)，5mM KCl，I00mM NaCl，ImMMgCl2)洗 滌2次后，將菌體重懸于500yLlX B B，用BD FACSC alibur流式細胞分析儀檢測結合上FAM 標記的適配子的菌體百分率(測三次取平均值），結果顯示腸致病性大腸桿菌寡核苷酸適配 子競爭結合腸致病性大腸桿菌的能力為99.1 %，而針對腸侵襲性大腸桿菌，腸出血性大腸 桿菌、化膿性鏈球菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌菌沒有結合率。
[0094]這充分說明，本發明的適配子具有較好的特異性和穩定性。
[0095]以上僅為本發明的優選實施例而已，并不用于限制本發明，對于本領域的技術人 員來說，凡在本發明的精神和原則之內所做的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本 發明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 一種用于食品中腸致病性大腸桿菌檢測的試劑盒，其含有能特異性結合的核酸適 體。2. 如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述核酸適體序列如SEQ ID No: 1-24任一 所示。3. -種檢測食品中腸致病性大腸桿菌的方法，其特征在于利用權利要求1-2任一項所 述的試劑盒。
【文檔編號】C12N15/115GK105929158SQ201610483757
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年6月27日
【發明人】楊國林
【申請人】楊國林