一種抗雙鏈DNA抗體IgG的磁微粒化學發光定量測定試劑盒及制備和檢測方法

            文檔序號:10568765閱讀:1007來源:國知局
            一種抗雙鏈DNA抗體IgG的磁微粒化學發光定量測定試劑盒及制備和檢測方法
            【專利摘要】本發明公開一種抗雙鏈DNA抗體IgG的磁微粒化學發光定量測定試劑盒,該試劑盒包括:抗雙鏈DNA抗體IgG校準品;抗雙鏈DNA抗體IgG質控品;含生物素標記的雙鏈DNA抗原和牛血清白蛋白的Tris緩沖液;含堿性磷酸酶標記的羊抗人多克隆抗體和牛血清白蛋白的Tris緩沖液;含有鏈霉親和素標記的磁微粒和牛血清白蛋白的Tris緩沖液;清洗液。該試劑盒的檢測方法在傳統的膜條免疫法和酶聯免疫吸附法的基礎上,將靈敏度和線性范圍再提高3?5個數量級、實現真正意義的定量檢測,反應迅速,結果可靠,并能夠配合全自動化學發光免疫分析儀實現全自動使用,對于臨床診斷具有無可替代的重要價值。
            【專利說明】
            一種抗雙鏈DNA抗體I gG的磁微粒化學發光定量測定試劑盒及 制備和檢測方法
            技術領域
            [0001 ]本發明涉及生物檢測技術領域。更具體地,涉及一種抗雙鏈DNA抗體IgG的磁微粒 化學發光定量測定試劑盒及制備和檢測方法。
            【背景技術】
            [0002] 系統性紅斑狼瘡(SLE)是臨床上較為常見的一種自身免疫性疾病,患者突出表現 是存在多種自身抗體,其中最重要的是抗雙鏈DNA抗體,其為一種能夠與天然DNA結合的自 身抗體,幾乎僅在SLE患者中可檢測到該抗體。抗雙鏈DNA抗體滴度的消長與SLE患者的病情 變化相關。SLE的診斷基11項ARA標準(ARA,美國風濕病協會),也稱為1988年ACR標準(ACR, 美國風濕病學會),該標準于19 9 7年修訂。若11項標準中出現4項,診斷S L E的可能性達到 80 %到90 %之間。
            [0003] 目前臨床上抗雙鏈DNA抗體IgG的檢測有膜條免疫法和酶聯免疫吸附法。膜條免疫 法應用的是膜條顯色技術,其特點為固定幾個項目在同一膜條測定,一般通過手工或者半 自動膜條儀進行實驗操作,最終通過肉眼進行定性判定,該技術靈敏度低,反應時間長,檢 測項目只能固定搭配組合,靈活性差。酶聯免疫吸附法的靈敏度在膜條免疫法基礎上有所 提升,但仍然較低,并且線性范圍窄,重復性差,反應時間也較長,仍然不能很好滿足臨床的 應用。
            [0004] 磁微粒化學發光免疫分析法,較以前的膜條免疫法和酶聯免疫吸附法,在檢測靈 敏度、檢測范圍、檢測時間及自動化操作上有了大大提高,且沒有污染,臨床應用廣。目前, 使用磁微粒化學發光分析法在抗雙鏈DNA抗體IgG免疫分析產品的應用仍未見。

            【發明內容】

            [0005] 本發明的一個目的在于提供一種抗雙鏈DNA抗體IgG的磁微粒化學發光定量測定 試劑盒,本發明提供的試劑盒將化學發光分析技術與磁微粒分離技術相結合,采用生物素 和堿性磷酸酶(ALP)分別標記抗原和抗體,以直徑l-3wii的包被鏈霉親和素的超順磁微粒作 為分離試劑。ALP催化底物發光后,通過儀器測量發光強度計算出待測物濃度。該檢測方法 在傳統的膜條免疫法和酶聯免疫吸附法的基礎上,將靈敏度和線性范圍再提高3-5個數量 級、實現真正意義的定量檢測,反應迅速,結果可靠,并能夠配合全自動化學發光免疫分析 儀實現全自動使用,對于臨床診斷具有無可替代的重要價值。
            [0006] 本發明的另一個目的在于提供一種上述試劑盒的制備方法及檢測方法。
            [0007] 為達到上述目的,本發明采用下述技術方案:
            [0008] -種抗雙鏈DNA抗體IgG的磁微粒化學發光定量測定試劑盒,所述試劑盒包括:1) 抗雙鏈DNA抗體IgG校準品,含抗雙鏈DNA抗體IgG和牛血清白蛋白的Tris緩沖液,所述抗雙 鏈DNA抗體I gG校準品包含6個水平的液體校準品,所述6個水平的液體校準品中抗雙鏈DNA 抗體 IgG 的濃度分別為0,10,100,200,400,800IU/mL;
            [0009] 2)抗雙鏈DNA抗體IgG質控品,含抗雙鏈DNA抗體IgG和牛血清白蛋白的Tris緩沖 液,所述抗雙鏈DNA抗體IgG質控品包含2個水平的液體質控品,所述2個水平的液體質控品 中抗雙鏈DNA抗體I gG的靶值濃度范圍分別為(100 ± 20) IU/mL和(400 ± 80) IU/mL。
            [0010] 3)試劑1號,含生物素標記的雙鏈DNA抗原和牛血清白蛋白的Tris緩沖液;
            [0011 ] 4)試劑2號,含堿性磷酸酶標記的羊抗人多克隆抗體和牛血清白蛋白的Tris緩沖 液;
            [0012] 5)磁分離試劑,含有鏈霉親和素標記的磁微粒和牛血清白蛋白的Tris緩沖液;
            [0013] 6)清洗液;
            [0014]所述試劑盒中試劑1號,試劑2號和磁分離試劑的含量比為1:3:1,所述含量比為體 積比。
            [0015]進一步的,所述磁微粒的材質為Fe2〇3;所述磁微粒表面包被有羧基基團,包被物中 羧基基團含量大于20wt%,所述磁微粒的大小為1-3M1。
            [0016] -種制備所述抗雙鏈DNA抗體IgG的磁微粒化學發光定量測定試劑盒的方法,該方 法包括如下步驟:
            [0017] (1)配制抗雙鏈DNA抗體IgG校準品:
            [0018] a.配制抗雙鏈DNA抗體IgG校準品稀釋液:
            [0019] 將純化水、Tris、氯化鈉和Proclin300加入容器中,充分攪拌至完全溶解,Tris濃 度為lwt%,氯化鈉濃度為lwt%,Proclin300濃度為0.2v% ;用4M的HCL將溶液的pH值調為 7.0- 7.5 ;將牛血清白蛋白加入容器中,充分攪拌至完全溶解,牛血清白蛋白的濃度為 4wt % ;再用4M的HCL將溶液的pH值調為7.0-7.5;用孔徑為0.2mi的濾器過濾得抗雙鏈DNA抗 體IgG校準品稀釋液,2-8°C保存待用;
            [0020] b ?配制抗雙鏈DNA抗體IgG校準品:
            [0021] 將抗雙鏈DNA抗體IgG用抗雙鏈DNA抗體IgG校準品稀釋液稀釋至各濃度點為0,10, 100,200,400,800IU/mL;
            [0022] (2)配制抗雙鏈DNA抗體IgG質控品:
            [0023] 將抗雙鏈DNA抗體I gG用上述抗雙鏈DNA抗體I gG校準品稀釋液稀釋至各濃度點為 100,400IU/mL;
            [0024] (3)配制試劑1號:
            [0025] a.配制試劑1號稀釋液:
            [0026] 將純化水、Tris、氯化鈉和Proclin300加入容器中,充分攪拌至完全溶解,Tris的 濃度為lwt %,氯化鈉濃度為0.5wt %,Proclin300的濃度為0.2v% ;將牛血清白蛋白加入容 器中,充分攪拌至完全溶解,牛血清白蛋白的濃度為〇. 5wt % ;用4M的HCL將溶液的pH值調為 7.0- 7.5;用孔徑為0.2mi的濾器過濾得試劑1號稀釋液,2-8°C保存待用;
            [0027] b.配制試劑1號:
            [0028] 將雙鏈DNA抗原用純化水溶解,2-8°C條件下用濃度為0.2M,pH為9.0的碳酸鹽緩沖 液透析2h,然后濃縮至濃度為2-4mg/mL的抗原溶液,用濃度為0.2M,pH為8.5-9的碳酸鹽緩 沖液配制濃度為0.5-1. Omg/ml的生物素溶液;按照雙鏈DNA抗原與生物素質量比為10 :1的 比例在雙鏈DNA抗原溶液中加入生物素溶液,混合均勻,室溫靜置12-18h,反應生成雙鏈DNA 抗原-生物素連接物;將含有雙鏈DNA抗原-生物素連接物的反應液在2-8°C條件下用濃度為 0.2M,pH為9.0的碳酸鹽緩沖液透析2天,期間進行4次換液,從而除去未反應的生物素,得到 含有雙鏈DNA抗原-生物素連接物的溶液;用試劑1號稀釋液將含有雙鏈DNA抗原-生物素連 接物的溶液稀釋到〇. 1-0.3yg/mL,制得試劑1號;
            [0029] 本步驟配制的試劑1號可降低實驗成本,而且能有效分離游離生物素和連接物,得 到的連接物較純,減少了反應的非特異;
            [0030] (4)配制試劑2號:
            [0031] a.配制試劑2號稀釋液:
            [0032] 將純化水、4-羥乙基哌嗪乙磺酸、氯化鈉、牛血清白蛋白、ZnCl2和Proclin300加入 容器中,充分攪拌至完全溶解,4 -羥乙基哌嗪乙磺酸的濃度為0.6 w t %,氯化鈉濃度為 0 ? 8wt %,牛血清白蛋白的濃度為0 ? 5wt%,ZnCl2的濃度為0 ? lwt%。,Proclin300的濃度為 0 ? 2v%。,MgCl2的濃度為0 ? 1%。;用4M的HCL將溶液的pH值調為7 ? 5-8 ? 0;用孔徑為0 ? 2_的濾 器過濾得試劑2號稀釋液,2-8°C保存待用;
            [0033] b.配制試劑2號:
            [0034]將lmg羊抗人多克隆抗體加入到2-4yL濃度為10mg/mL的2-亞氨基硫烷鹽酸鹽溶液 中,室溫靜置20min,再加入0 . lm〇L/L的甘氨酸溶液10此,室溫靜置5min,用G-25凝膠柱除 鹽,收集活化后的羊抗人多克隆抗體,2-8°C保存備用;將1.5mg的堿性磷酸酶加入到10-20y L的濃度為5mg/mL的4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯溶液中,室溫靜 置30min,用G-25凝膠柱除鹽,收集活化后的堿性磷酸酶,2-8°C保存備用;將活化的羊抗人 多克隆抗體與活化的堿性磷酸酶混合,2-8°C條件下靜置12-24h,用S UpperdeX200凝膠純化 柱純化偶聯物,獲得羊抗人多克隆抗體-堿性磷酸酶連接物濃溶液,2-8 °C保存備用;將羊抗 人多克隆抗體-堿性磷酸酶連接物濃溶液用試劑2號稀釋液稀釋到0.02-0. lyg/mL,制得試 劑2號;
            [0035] (5)配制磁分離試劑:
            [0036] a.配制磁微粒緩沖液:
            [0037] 將純化水、Tris和氯化鈉加入容器中,充分攪拌至完全溶解,Tris的濃度為lwt%, 氯化鈉的濃度為〇.8wt% ;再將牛血清白蛋白、新生牛血清和Proclin300加入容器中,充分 攪拌至完全溶解,牛血清白蛋白的濃度為〇.5wt%,新生牛血清濃度為5v%,Pr 〇clin300濃 度為0.2v%。;用4M的HCL將溶液的pH值調為7.9-8.1;用孔徑為0.2mi的濾器過濾得磁微粒緩 沖液,2-8 °C保存待用;
            [0038] b.配制磁分離試劑:
            [0039]取100mg磁微粒,使用磁力架吸附,靜止2min后吸去上清,向磁微粒中加入濃度為 0.025mol/L,pH為4.5-5的2-0-嗎啡啉)乙磺酸緩沖液1〇11^,充分混勻;再加入〇.5-11^新配 制的濃度均為10mg/mL的1-(3_二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺水溶 液,室溫混勻30-60min得磁珠混懸體系;使用2-(N-嗎啡啉)乙磺酸緩沖液配制濃度為5mg/ mL的鏈霉親和素溶液,然后向磁珠混懸體系中直接加入所述濃度的0.8-1.6mL的鏈霉親和 素,4°C條件下混懸16-20h;再使用磁力架吸附,靜止2min后吸去上清,向磁微粒中加入10mL 濃度為1M,pH為8.5的乙醇胺溶液,室溫反應1-2h,再使用磁力架吸附,靜止2min后吸去上 清,向磁微粒中加入適量磁微粒緩沖液稀釋使終濃度為0.5mg/mL,制得磁分離試劑;
            [0040] 本步驟中,加入N-羥基琥珀酰亞胺能夠對偶聯劑1-(3_二甲氨基丙基)-3_乙基碳 二亞胺起到穩定作用;加入鏈霉親和素后在4度條件下混懸,能夠更好的保留蛋白質活性, 同時減少室溫變化對偶聯效果的影響,使批次之間偶聯結果更加穩定;加入乙醇胺,可使乙 醇胺分子中的氨基與磁珠活化后未結合蛋白的活性位點反應,起到終止反應和封閉作用, 能夠產生更低的本底值;
            [00411 (6)配制清洗液:
            [0042]將純化水、Tris和氯化鈉加入容器中,充分攪拌至完全溶解,Tris的濃度為lwt%, 氯化鈉的濃度為〇.8wt%;再將Tween-20和TritonlOO加入容器中,充分攪拌至完全混勻, Tween-20的濃度為0 ? 5wt %,Triton100 的濃度為0 ? 5wt % ;用4M的HCL將溶液的pH值調為 7.5-8.0,用0.2mi濾器過濾得清洗液,2-8 °C保存。
            [0043]抗雙鏈DNA抗體IgG的磁微粒化學發光定量測定試劑盒檢測抗雙鏈DNA抗體IgG的 檢測方法,該方法包括如下步驟:
            [0044] 1)將抗雙鏈DNA抗體IgG校準品放到全自動化學發光免疫分析儀測試位置,得到由 全自動化學發光免疫分析儀輸出的擬合曲線;
            [0045] 2)將抗雙鏈DNA抗體IgG質控品放到上述分析儀測試位置,得到由全自動化學發光 免疫分析儀輸出的所述質控品的測試發光值和通過步驟1得到的擬合曲線擬合得到抗雙鏈 DNA抗體IgG質控品的濃度值;
            [0046] 3)將待測樣本放到上述分析儀測試位置,由所述分析儀自動按1: 20將樣本稀釋, 得到由全自動化學發光免疫分析儀輸出的待測樣本的濃度值。
            [0047]進一步的,該檢測方法具體包括如下步驟:
            [0048] 1)加20yL抗雙鏈DNA抗體IgG校準品或質控品或1: 20稀釋后的待測標本至檢測管 中;
            [0049] 2)加50yL的試劑1號至步驟1)所述檢測管中,混勻后,37 ±0.5°C溫1 Omin;
            [0050] 3)加50此的磁分離試劑至步驟2)所述檢測管中,混勻后,37±0.5°C溫育5min,進 行磁分離,去上清;
            [0051] 4)加300iiL的清洗液至步驟3)所述檢測管中,混勻,進行磁分離,去上清;
            [0052] 5)重復步驟4)兩遍;
            [0053] 6)加150此試劑2號至步驟5)所述檢測管中,混勻后,37 ±0.5°C溫育lOmin,進行磁 分離,去上清;
            [0054] 7)加300iiL的清洗液至步驟6)所述檢測管中,混勻,進行磁分離,去上清;
            [0055] 8)重復步驟7)兩遍;
            [0056] 9)加200iiL的化學發光底物至步驟8)所述檢測管中,混勻,檢測發光強度。
            [0057]所述步驟1)、步驟2)和步驟3)均包括全自動化學發光免疫分析儀的全自動檢測步 驟。
            [0058]本發明的有益效果如下:
            [0059]本發明公開了一種測定抗雙鏈DNA抗體IgG的新技術,使得反應過程更加快速可 靠,提高了靈敏度和線性范圍,實現真正意義的定量測定,并可搭配全自動化學發光免疫分 析儀實現全自動的使用,大大提高工作效率;試劑盒中的校準品、生物素標記試劑、酶標記 試劑、磁分離試劑和清洗液等均是該反應體系下的最優配方,給該試劑盒的使用效期及檢 測性能提供了有力保障。
            【附圖說明】
            [0060] 圖la為實施例7空白限評價中零濃度校準品與相鄰校準品之間的濃度值與發光值 結果進行兩點回歸擬合得出的一次方程;
            [0061] 圖lb為對比例1空白限評價中零濃度校準品與相鄰校準品之間的濃度值與發光值 結果進行兩點回歸擬合得出的一次方程;
            [0062] 圖2為實施例7線性范圍評價中樣本濃度平均值和稀釋比例用最小二乘法進行直 線擬合方程;
            [0063] 圖3為實施例7同已有的商品化的試劑盒臨床樣本測值相關性散點圖。
            【具體實施方式】
            [0064] 為了更清楚地說明本發明,下面結合優選實施例和附圖對本發明做進一步的說 明。
            [0065] 實施例1
            [0066]抗雙鏈DNA抗體IgG校準品的制備:
            [0067] a.配制抗雙鏈DNA抗體IgG校準品稀釋液:
            [0068] 將800ml的純化水、11.2g的Tris、8.6g氯化鈉和2ml Proclin300加入容器中,充分 攪拌至完全溶解;用4M的HCL將溶液的pH值調為7.0-7.5;將40g牛血清白蛋白加入容器中, 充分攪拌至完全溶解;再用4M的HCL將溶液的pH值調為7.0-7.5;用純化水將溶液定容至1L, 用0.2mi濾器過濾得抗雙鏈DNA抗體IgG校準品稀釋液,2-8°C保存待用;
            [0069] b ?配制抗雙鏈DNA抗體IgG校準品:
            [0070] 將抗雙鏈DNA抗體IgG用抗雙鏈DNA抗體IgG校準品稀釋液稀釋至各濃度點為0,10, 100,200,400,800IU/mL。
            [0071] 實施例2
            [0072]抗雙鏈DNA抗體I gG質控品的制備:
            [0073] 將抗雙鏈DNA抗體I gG用上述抗雙鏈DNA抗體I gG校準品稀釋液稀釋至各濃度點為 100,400IU/mL。
            [0074] 實施例3 [0075]試劑1號的制備:
            [0076] a.配制試劑1號稀釋液:
            [0077] 將800ml純化水、12.1g的Tris、5.8g氯化鈉和2ml Proclin300加入容器中,充分攪 拌至完全溶解;將5g牛血清白蛋白加入容器中,充分攪拌至完全溶解;用4M的HCL將溶液的 pH值調為7.0-7.5;用純化水將溶液定容至1L,用0.2mi濾器過濾得試劑1號稀釋液,2-8°C保 存待用;
            [0078] b.配制試劑1號:
            [0079] 將雙鏈DNA抗原用純化水溶解,2-8°C條件下用濃度為0.2M,pH為9.0的碳酸鹽緩沖 液透析2h,然后濃縮至濃度為2-4mg/mL的抗原溶液,用濃度為0.2M,pH為8.5-9的碳酸鹽緩 沖液配制濃度為0.5-1. Omg/ml的生物素溶液;按照雙鏈DNA抗原與生物素質量比為10 :1的 比例在雙鏈DNA抗原溶液中加入生物素溶液,混合均勻,室溫靜置12-18h,反應生成雙鏈DNA 抗原-生物素連接物;將含有雙鏈DNA抗原-生物素連接物的反應液在2-8°C條件下用濃度為 0.2M,pH為9.0的碳酸鹽緩沖液透析2天,期間進行4次換液,從而除去未反應的生物素,得到 含有雙鏈DNA抗原-生物素連接物的溶液;用試劑1號稀釋液將含有雙鏈DNA抗原-生物素連 接物的溶液稀釋到〇. 1-0.3yg/mL,制得試劑1號;
            [0080]本步驟配制的試劑1號與原方法相比可降低實驗成本,而且能有效分離游離生物 素和連接物,得到的連接物較純,減少了后續反應的非特異。
            [0081 ] 實施例4 [0082]試劑2號的制備:
            [0083] a.配制試劑2號稀釋液:
            [0084] 將800ml純化水、6.06g的4-羥乙基哌嗪乙磺酸、8.5g氯化鈉、5g牛血清白蛋白、 0.1gZnCl2、0.2ml Proclin300和O.lg MgCl2加入容器中,充分攪拌至完全溶解;用4M的HCL 將溶液的pH值調為7.5-8.0;用純化水將溶液定容至1L,用0.2mi濾器過濾得試劑2號稀釋 液,2-8 °C保存待用;
            [0085] b.配制試劑2號:
            [0086]將lmg羊抗人多克隆抗體加入到2-4yL濃度為10mg/mL的2-亞氨基硫烷鹽酸鹽溶液 中,室溫靜置20min,再加入0 . lm〇L/L的甘氨酸溶液10此,室溫靜置5min,用G-25凝膠柱除 鹽,收集活化后的羊抗人多克隆抗體,2-8°C保存備用;將1.5mg的堿性磷酸酶加入到10-20y L的濃度為5mg/mL的4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯溶液中,室溫靜 置30min,用G-25凝膠柱除鹽,收集活化后的堿性磷酸酶,2-8°C保存備用;將活化的羊抗人 多克隆抗體與活化的堿性磷酸酶混合,2-8°C條件下靜置12-24h,用S UpperdeX200凝膠純化 柱純化偶聯物,獲得羊抗人多克隆抗體-堿性磷酸酶連接物濃溶液,2-8 °C保存備用;將羊抗 人多克隆抗體-堿性磷酸酶連接物濃溶液用試劑2號稀釋液稀釋到0.02-0. lyg/mL,制得試 劑2號。
            [0087] 實施例5
            [0088]磁分離試劑的制備:
            [0089] a.配制磁微粒緩沖液:
            [0090] 將800mL純化水、12.1g Tris和8.5g氯化鈉加入容器中,充分攪拌至完全溶解;再 將5g牛血清白蛋白、50mL新生牛血清和0.2mL Proclin300加入容器中,充分攪拌至完全溶 解;用4M的HCL將溶液的pH值調為7.9-8.1;用純化水將溶液定容至1L,用0.2圓濾器過濾得 磁微粒緩沖液,2-8 °C保存待用;
            [0091] b.配制磁分離試劑:
            [0092]取100mg磁微粒,使用磁力架吸附,靜止2min后吸去上清,向磁微粒中加入濃度為 0.025mol/L,pH為4.5-5的2-0-嗎啡啉)乙磺酸緩沖液1〇11^,充分混勻;再加入〇.5-11^新配 制的濃度均為10mg/mL的1-(3_二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺水溶 液,室溫混勻30-60min得磁珠混懸體系;使磁微粒充分活化,使用2-(N-嗎啡啉)乙磺酸緩沖 液配制濃度為5mg/mL的鏈霉親和素溶液,然后向磁珠混懸體系中直接加入所述濃度的0.8-1.6mL的鏈霉親和素,4°C條件下混懸16-20h;再使用磁力架吸附,靜止2min后吸去上清,向 磁微粒中加入10mL濃度為1M,pH為8.5的乙醇胺溶液,室溫反應1-2h,再使用磁力架吸附,靜 止2min后吸去上清,向磁微粒中加入適量磁微粒緩沖液稀釋使終濃度為0.5mg/mL,制得磁 分咼試劑;
            [0093] 本步驟中,加入N-羥基琥珀酰亞胺能夠對偶聯劑1-(3_二甲氨基丙基)_3_乙基碳 二亞胺起到穩定作用;加入鏈霉親和素后在4度條件下混懸,能夠更好的保留蛋白質活性, 同時減少室溫變化對偶聯效果的影響,使批次之間偶聯結果更加穩定;加入乙醇胺,可使乙 醇胺分子中的氨基與磁珠活化后未結合蛋白的活性位點反應,起到終止反應和封閉作用, 能夠產生更低的本底值。
            [0094] 實施例6
            [0095] 清洗液的制備:
            [0096] 將800mL純化水、12.1g Tris和8.5g氯化鈉加入容器中,充分攪拌至完全溶解;再 將5g Tween-20和5g TritonlOO加入容器中,充分攪拌至完全混勻;用4M的HCL將溶液的pH 值調為7.5-8.0用純化水將溶液定容至1L,用0.2mi濾器過濾得清洗液,2-8°C保存。
            [0097] 實施例7
            [0098]抗雙鏈DNA抗體IgG的磁微粒化學發光定量測定試劑盒:
            [0099]該試劑盒包括:
            [0100]按照實施例1方法制備的抗雙鏈DNA抗體IgG校準品,每個水平的校準品用量為 0.5ml;
            [0101] 按照實施例2方法制備的抗雙鏈DNA抗體IgG質控品,質控品用量為lmL;
            [0102]按照實施例3方法制備的試劑1號,試劑1號的用量為5ml;
            [0103]按照實施例4方法制備的試劑2號,試劑2號的用量為15ml;
            [0104] 按照實施例5方法制備的磁分離試劑,磁分離試劑的用量為5ml;
            [0105] 按照實施例6方法制備的清洗液,清洗液用量為1L。
            [0106] 實施例8
            [0107]采用實施例7的試劑盒對抗雙鏈DNA抗體IgG進行定量檢測
            [0108] 檢測方法包括如下步驟:
            [0109] 1)加20yL抗雙鏈DNA抗體IgG校準品或質控品或1:20稀釋后的待測標本至檢測管 中;
            [0110] 2)加50yL的試劑1號至步驟1)所述檢測管中,混勻后,37 ±0.5°C溫育lOmin;
            [0111] 3)加50此的磁分離試劑至步驟2)所述檢測管中,混勻后,37±0.5°C溫育5min,進 行磁分離,去上清;
            [0112] 4)加300iiL的清洗液至步驟3)所述檢測管中,混勻,進行磁分離,去上清;
            [0113] 5)重復步驟4)兩遍;
            [0114] 6)加150yL試劑2號至步驟5)所述檢測管中,混勻后,37 ±0.5°C溫育lOmin,進行磁 分離,去上清;
            [0115] 7)加300iiL的清洗液至步驟6)所述檢測管中,混勻,進行磁分離,去上清;
            [0116] 8)重復步驟7)兩遍;
            [0117] 9)加200iiL的化學發光底物至步驟8)所述檢測管中,混勻,檢測發光強度。
            [0118] 對比例1
            [0119] 與實施例7制備的試劑盒不同的是試劑盒中的試劑1號和磁分離試劑,其余成分相 同。
            [0120] 試劑1號的制備如下:
            [0121] a.配制試劑1號稀釋液:
            [0122] 將800ml純化水、12.1g的Tris、5.8g氯化鈉和2ml Proclin300加入容器中,充分攪 拌至完全溶解;將5g牛血清白蛋白加入容器中,充分攪拌至完全溶解;用4M的HCL將溶液的 pH值調為7.0-7.5;用純化水將溶液定容至1L,用0.2mi濾器過濾得試劑1號稀釋液,2-8°C保 存待用;
            [0123] b.配制試劑1號:
            [0124] 用濃度0.2M,pH為9的碳酸鹽緩沖液配制0.5mg/ml的生物素溶液;按照雙鏈DNA抗 原與生物素質量比為10:1的比例在雙鏈DNA抗原溶液中加入生物素溶液,混合均勻,室溫靜 置18h,反應生成雙鏈DNA抗原-生物素連接物;將含有雙鏈DNA抗原-生物素連接物的反應液 通過G-25凝膠柱進行分離,除去未反應的生物素,得到含有雙鏈DNA抗原-生物素連接物的 溶液;用試劑1號稀釋液將含有雙鏈DNA抗原-生物素連接物的溶液稀釋到0.1-0.3yg/mL,制 得試劑1號;
            [0125] 磁分離試劑的制備如下:
            [0126] a.配制磁微粒緩沖液:
            [0127] 將800mL純化水、12. lg Tris和8.5g氯化鈉加入容器中,充分攪拌至完全溶解;再 將5g牛血清白蛋白、50mL新生牛血清和0.2mL Proclin300加入容器中,充分攪拌至完全溶 解;用4M的HCL將溶液的pH值調為7.9-8.1;用純化水將溶液定容至1L,用0.2圓濾器過濾得 磁微粒緩沖液,2-8 °C保存待用;
            [0128] b.配制磁分離試劑:
            [0129] 取100mg磁微粒,磁分離去上清,用濃度為0.025mol/L,pH為4.5-5的2-0-嗎啡啉) 乙磺酸緩沖液10mL重懸;加入0.5-lmL新配制的濃度為10mg/mL的EDC水溶液,室溫混懸30-60min;使磁珠充分活化,磁分離,去上清,用濃度為0.025mol/L,pH為4.5-5 2-(N-嗎啡啉) 乙磺酸緩沖液10mL重懸;加入4-8mg的鏈霉親和素,室溫混懸16-20h;再進行磁分離,去上 清,用磁微粒緩沖液稀釋重懸到0.5mg/mL,制得磁分離試劑。
            [0130] 實施例9
            [0131 ]對實施例7和對比例1的試劑盒進行性能評價:
            [0132] 1.實施例7的準確度評價
            [0133] 將濃度約為200RU/mL(允許其濃度偏差為±20%)的抗雙鏈0嫩抗體以6樣品六加入 到血清或其他相應基質的樣品B中,所加入A的體積不超過總體積(A+B)的10%,根據公式 (1)計算回收率R,本方法的回收率要求在85-115 %范圍內,數據參見表1,評價結果符合要 求。
            [0135] R:回收率;
            [0136] V:加入標準溶液的體積;
            [0137] Vo:人源樣品的體積;
            [0138] C:人源樣品加入標準溶液后的檢測濃度;
            [0139] Co:人源樣品的檢測濃度;
            [0140] Cs:標準溶液的濃度。
            [0141] 表1準確度評價
            [0143] 2.實施例7和對比例1的空白限評價
            [0144] 用零濃度校準品作為樣本進行檢測,重復測定20次,得出20次測量結果的RLU值 (相對發光值),計算其平均值(M)和標準差(SD),得出M+2SD所對應的RLU值,根據零濃度校 準品與相鄰校準品之間的濃度-RLU值結果進行兩點回歸擬合得出一次方程,將M+2SD所對 應的RLU值帶入上述方程中,求出對應的濃度值,即為空白限,本方法的空白限要求不大于 IRU/mL,數據參見表2,A、B點連點擬合曲線及擬合方程見圖la,對比例1制備的試劑盒測得 的空白限數據見表2-1,A、B點連點擬合曲線及擬合方程見圖lb,由數據可見,實施例7與對 比例1相比,得到的本底值更低,從而得到的空白限更低,代表試劑盒的靈敏度更好。
            [0145] 表2空白限評價
            [0148]表2-1空白限評價
            [0150] 3.實施例7的線性范圍評價
            [0151] 將接近線性范圍上限(800IU/mL)的高值樣本按一定比例稀釋為至少5種濃度,其 中低值濃度的樣本須接近線性范圍的下限。按試劑盒說明書進行操作,對每一濃度的樣本 均重復檢測2次,計算其平均值,將結果平均值和稀釋比例用最小二乘法進行直線擬合,并 計算線性相關系數r,本方法的測量范圍為[2,800]IU/mL,要求在此范圍內,相關系數r應多 0.9900。數據參見表3,擬合曲線及相關系數見圖2,評價結果符合要求。
            [0152] 表3線性范圍評價
            [0155] 4.實施例7和對比例1的重復性評價
            [0156] 取實施例7中的試劑盒重復檢測濃度為(100 ± 20) IU/mL和(400 ± 80) IU/mL的樣本 各10次,計算10次測量結果的平均值M和標準差SD,根據公式CV=SD/MX 100%得出變異系 數CV,本方法變異系數(CV)要求不大于8%,數據參見表4,對比例1制備的試劑盒測得的重 復性數據見表4-1,由數據可見,實施例7與對比例1相比,得到的CV值更低,代表試劑盒的重 復性更好,
            [0157] CV = SD/MX100%......................................(2)
            [0158] 式中:CV-變異系數;SD -10次測量結果的標準差;M -10次測量結果的平均值。
            [0159] 表4重復性評價
            [0161] 表4-1重復性評價
            [0163] 5.實施例7和對比例1的批間差評價
            [0164] 將實施例7的試劑盒取三批,每批試劑盒均測定濃度在(100±20)IU/mL和(400 土 80)IU/mL范圍內的樣本,每批重復測定10次,計算30次測定結果的平均值(M)和標準差 (SD),根據公式(3)計算變異系數(CV),本方法變異系數(CV)要求不大于15%,數據參見表 5,對比例1制備的試劑盒測得的批間差數據見表5-1,由數據可見,實施例7與對比例1相比, 得到的CV值更低,代表試劑盒的批間差更好,
            [0165] CV = SD/MX100%......................................(3)
            [0166] 式中:CV-變異系數;SD-30次測定結果的標準差;M-30次測定結果的平均值。
            [0167] 表5批間差評價
            [0171] 6.實施例7的特異性評價
            [0172] 取1份Anti-雙鏈DNA IgG含量為0的樣本,加入人血清白蛋白,使樣本中人血清白 蛋白濃度為5000ng/mL,使用該試劑盒對該樣本進行檢測,測定樣本中的Anti-雙鏈DNA IgG 含量。結果見表6,本方法與人血清白蛋白無交叉反應。數據參見表6,評價結果符合要求。
            [0173] 表6特異性實驗
            [0175] 7.實施例7的相關性評價
            [0176]用實施例7的試劑盒和商品化的抗雙鏈DNA抗體IgG檢測試劑盒(酶聯免疫吸附法) 對240份人血清樣品同時進行檢測。其檢測結果參見附圖3,以抗雙鏈DNA抗體IgG檢測試劑 盒(酶聯免疫吸附法)測定的結果為橫坐標,以本發明方法的測定的結果為縱坐標作回歸分 析,相關方程為:y = 〇. 9023x+7.3892,相關系數為R2:0.9582。經統計學處理結果表明,本方 法同其他方法的試劑盒臨床樣本測值相關性良好。
            [0177] 8.實施例7的穩定性評價
            [0178] 對試劑盒分別進行4°C12個月和37°C7天的加速穩定性實驗,結果表明試劑盒標準 品發光強度的變化、批內和批間精密度、準確度等指標均在正常范圍之內,試劑盒有效期可 達12個月。
            [0179]顯然,本發明的上述實施例僅僅是為清楚地說明本發明所作的舉例,而并非是對 本發明的實施方式的限定,對于所屬領域的普通技術人員來說,在上述說明的基礎上還能 夠做出其它不同形式的變化或變動,這里無法對所有的實施方式予以窮舉,凡是屬于本發 明的技術方案所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發明的保護范圍之列。
            【主權項】
            1. 一種抗雙鏈DNA抗體IgG的磁微粒化學發光定量測定試劑盒,其特征在于,所述試劑 盒包括: 1) 抗雙鏈DNA抗體IgG校準品,含抗雙鏈DNA抗體IgG和牛血清白蛋白的Tris緩沖液,所 述抗雙鏈DNA抗體IgG校準品包含6個水平的液體校準品,所述6個水平的液體校準品中抗雙 鏈 DNA 抗體 IgG 的濃度分別為O,10,100,200,400,800IU/mL; 2) 抗雙鏈DNA抗體I gG質控品,含抗雙鏈DNA抗體IgG和牛血清白蛋白的Tr i s緩沖液,所 述抗雙鏈DNA抗體IgG質控品包含2個水平的液體質控品,所述2個水平的液體質控品中抗雙 鏈DNA抗體IgG的靶值濃度范圍分別為(100 ± 20) IU/mL和(400 ± 80) IU/mL; 3) 試劑1號,含生物素標記的雙鏈DNA抗原和牛血清白蛋白的Tr i s緩沖液; 4) 試劑2號,含堿性磷酸酶標記的羊抗人多克隆抗體和牛血清白蛋白的Tris緩沖液; 5) 磁分離試劑,含有鏈霉親和素標記的磁微粒和牛血清白蛋白的Tris緩沖液; 6) 清洗液; 所述試劑盒中試劑1號,試劑2號和磁分離試劑的含量比為1:3:1,所述含量比為體積 比。2. 根據權利要求1所述的試劑盒,其特征在于:所述磁微粒的材質為Fe2O3;所述磁微粒 表面包被有羧基基團,包被物中羧基基團含量大于20wt%,所述磁微粒的大小為1-3μπι。3. -種制備如權利要求1-2任一項所述試劑盒的方法,其特征在于,該方法包括如下步 驟: (1) 配制抗雙鏈DNA抗體IgG校準品: a. 配制抗雙鏈DNA抗體IgG校準品稀釋液: 將純化水、Tris、氯化鈉和Pr〇clin300加入容器中,充分攪拌至完全溶解,Tris濃度為 lwt%,氯化鈉濃度為lwt%,Proclin300濃度為0.2v% ;用4M的HCL將溶液的pH值調為7.0-7.5;將牛血清白蛋白加入容器中,充分攪拌至完全溶解,牛血清白蛋白的濃度為4wt % ;再 用4M的HCL將溶液的pH值調為7.0-7.5;用孔徑為0.2μπι的濾器過濾得抗雙鏈DNA抗體IgG校 準品稀釋液,2-8°C保存待用; b. 配制抗雙鏈DNA抗體I gG校準品: 將抗雙鏈DNA抗體IgG用抗雙鏈DNA抗體IgG校準品稀釋液稀釋至各濃度點為0,10,100, 200,400,800IU/mL; (2) 配制抗雙鏈DNA抗體IgG質控品: 將抗雙鏈DNA抗體I gG用上述抗雙鏈DNA抗體I gG校準品稀釋液稀釋至各濃度點為100, 400IU/mL; (3) 配制試劑1號: a. 配制試劑1號稀釋液: 將純化水、Tris、氯化鈉和ProcI in300加入容器中,充分攪拌至完全溶解,Tris的濃度 為Iwt %,氯化鈉濃度為0.5wt %,Procl in300的濃度為0.2v % ;將牛血清白蛋白加入容器 中,充分攪拌至完全溶解,牛血清白蛋白的濃度為〇 . 5wt% ;用4M的HCL將溶液的pH值調為 7.0-7.5;用孔徑為0.2μπι的濾器過濾得試劑1號稀釋液,2-8°C保存待用; b. 配制試劑1號: 將雙鏈DNA抗原用純化水溶解,2-8°C條件下用濃度為0.2M,pH為9.0的碳酸鹽緩沖液透 析2h,然后濃縮至濃度為2-4mg/mL的抗原溶液,用濃度為O . 2M,pH為8.5-9的碳酸鹽緩沖液 配制濃度為〇. 5-1. Omg/ml的生物素溶液;按照雙鏈DNA抗原與生物素質量比為10:1的比例 在雙鏈DNA抗原溶液中加入生物素溶液,混合均勻,室溫靜置12-18h,反應生成雙鏈DNA抗 原-生物素連接物;將含有雙鏈DNA抗原-生物素連接物的反應液在2-8°C條件下用濃度為 0.2M pH為9.0的碳酸鹽緩沖液透析2天,期間進行4次換液,從而除去未反應的生物素,得到 含有雙鏈DNA抗原-生物素連接物的溶液;用試劑1號稀釋液將含有雙鏈DNA抗原-生物素連 接物的溶液稀釋到〇. 1-0.3yg/mL,制得試劑1號; (4) 配制試劑2號: a. 配制試劑2號稀釋液: 將純化水、4-羥乙基哌嗪乙磺酸、氯化鈉、牛血清白蛋白、ZnCl2和Proclin300加入容器 中,充分攪拌至完全溶解,4-羥乙基哌嗪乙磺酸的濃度為0.6wt %,氯化鈉濃度為0. Swt %, 牛血清白蛋白的濃度為0.5wt %,ZnCl2的濃度為0 . lwt%。,Proclin300的濃度為0.2v%〇, MgCl2的濃度為0.1%。;用4M的HCL將溶液的pH值調為7.5-8.0;用孔徑為0.2μπι的濾器過濾得 試劑2號稀釋液,2-8°C保存待用; b. 配制試劑2號: 將Img羊抗人多克隆抗體加入到2-4yL濃度為10mg/mL的2-亞氨基硫烷鹽酸鹽溶液中, 室溫靜置20min,再加入0. lm〇L/L的甘氨酸溶液IOyL,室溫靜置5min,用G-25凝膠柱除鹽,收 集活化后的羊抗人多克隆抗體,2-8°C保存備用;將1.5mg的堿性磷酸酶加入到10-20yL的濃 度為5mg/mL的4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯溶液中,室溫靜置 30min,用G-25凝膠柱除鹽,收集活化后的堿性磷酸酶,2-8°C保存備用;將活化的羊抗人多 克隆抗體與活化的堿性磷酸酶混合,2-8°C條件下靜置12-24h,用SupperdeUOO凝膠純化柱 純化偶聯物,獲得羊抗人多克隆抗體-堿性磷酸酶連接物濃溶液,2-8 °C保存備用;將羊抗人 多克隆抗體-堿性磷酸酶連接物濃溶液用試劑2號稀釋液稀釋到0.02-0. lyg/mL,制得試劑2 號; (5) 配制磁分離試劑: a. 配制磁微粒緩沖液: 將純化水、Tris和氯化鈉加入容器中,充分攪拌至完全溶解,Tris的濃度為lwt%,氯化 鈉的濃度為〇. 8wt % ;再將牛血清白蛋白、新生牛血清和Proclin300加入容器中,充分攪拌 至完全溶解,牛血清白蛋白的濃度為0.5wt %,新生牛血清濃度為5v%,Procl in300濃度為 0.2v%。;用4M的HCL將溶液的pH值調為7.9-8.1;用孔徑為0.2μπι的濾器過濾得磁微粒緩沖 液,2-8 °C保存待用; b. 配制磁分離試劑: 取IOOmg磁微粒,使用磁力架吸附,靜止2min后吸去上清,向磁微粒中加入濃度為 0.025mol/L,pH為4.5-5的2-0-嗎啡啉)乙磺酸緩沖液1〇11^,充分混勻;再加入〇.5-11^新配 制的濃度均為10mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺水溶 液,室溫混勻30-60min得磁珠混懸體系;使用2-(N-嗎啡啉)乙磺酸緩沖液配制濃度為5mg/ mL的鏈霉親和素溶液,然后向磁珠混懸體系中直接加入所述濃度的0.8-1.6mL的鏈霉親和 素,4°C條件下混懸16-20h;再使用磁力架吸附,靜止2min后吸去上清,向磁微粒中加入IOmL 濃度為1M,pH為8.5的乙醇胺溶液,室溫反應1-2h,再使用磁力架吸附,靜止2min后吸去上 清,向磁微粒中加入適量磁微粒緩沖液稀釋使終濃度為0.5mg/mL,制得磁分離試劑; (6)配制清洗液: 將純化水、Tris和氯化鈉加入容器中,充分攪拌至完全溶解,Tris的濃度為lwt%,氯化 鈉的濃度為〇 · 8wt% ;再將Tween-20和TritonlOO加入容器中,充分攪拌至完全混勻,Tween-20的濃度為0.5wt % ,TritonlOO的濃度為0.5wt % ;用4M的HCL將溶液的pH值調為7.5-8.0, 用孔徑為〇. 2μπι的濾器過濾得清洗液,2-8°C保存。4. 使用如權利要求1所述的試劑盒檢測抗雙鏈DNA抗體IgG含量的檢測方法,其特征在 于,該方法包括如下步驟: 1) 將抗雙鏈DNA抗體IgG校準品放到全自動化學發光免疫分析儀測試位置,得到由全自 動化學發光免疫分析儀輸出的擬合曲線; 2) 將抗雙鏈DNA抗體IgG質控品放到上述分析儀測試位置,得到由全自動化學發光免疫 分析儀輸出的所述質控品的測試發光值和通過步驟1得到的擬合曲線擬合得到抗雙鏈DNA 抗體IgG質控品的濃度值; 3) 將待測樣本放到上述分析儀測試位置,由所述分析儀自動按1:20將樣本稀釋,得到 由全自動化學發光免疫分析儀輸出的待測樣本的濃度值。5. 根據權利要求4所述的檢測方法,其特征在于,該方法具體包括如下步驟: 1) 加20yL抗雙鏈DNA抗體IgG校準品或質控品或1:20稀釋后的待測標本至檢測管中; 2) 加50yL的試劑1號至步驟1)所述檢測管中,混勻后,37 ±0.5°C溫育IOmin; 3) 加50yL的磁分離試劑至步驟2)所述檢測管中,混勻后,37±0.5°C溫育5min,進行磁 分離,去上清; 4) 加300yL的清洗液至步驟3)所述檢測管中,混勻,進行磁分離,去上清; 5) 重復步驟4)兩遍; 6) 加150yL試劑2號至步驟5)所述檢測管中,混勻后,37±0.5°C溫育lOmin,進行磁分 離,去上清; 7) 加300yL的清洗液至步驟6)所述檢測管中,混勻,進行磁分離,去上清; 8) 重復步驟7)兩遍; 9) 加200yL的化學發光底物至步驟8)所述檢測管中,混勻,檢測發光強度; 所述步驟1)、步驟2)和步驟3)均包括全自動化學發光免疫分析儀的全自動檢測步驟。
            【文檔編號】G01N21/76GK105929156SQ201610249121
            【公開日】2016年9月7日
            【申請日】2016年4月20日
            【發明人】不公告發明人
            【申請人】北京中航賽維生物科技有限公司
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