免疫層析試紙及其檢測方法

免疫層析試紙及其檢測方法
【專利摘要】本發明公開一種免疫層析試紙，包括結合物墊、測試線和質控線；所述結合物墊上設有已標記檢測抗體或檢測抗原的長余輝發光納米粒子。所述測試線包被有針對待檢測樣品中目標物的捕獲抗體或捕獲抗原；所述質控線包被有用于識別已標記在長余輝發光納米粒子上的檢測抗體的抗體或檢測抗原的抗體。本發明的優點是利用長余輝發光材料獨特的長余輝發光性能，用余輝光信號作為準確的定量讀數檢測結果；有效消除了干擾信號，極大提升了對待檢測物的檢測靈敏度和定量準確性。
【專利說明】
免疫層析試紙及其檢測方法
技術領域
[0001]本發明涉及免疫層析試紙的技術領域，具體涉及一種免疫層析試紙及其檢測方法。
【背景技術】
[0002]對生物樣品中待檢測物的現場、快速、靈敏和定量檢測是目前體外診斷(invitrodiagn0SiS，IVD)所追求的要素。近些年來，基于免疫層析試紙條的生物醫學檢測，因其具有快速、簡便、成本低等優勢越來越受到研究者和醫療工作者的青睞。免疫層析試紙技術是基于抗原-抗體特異性識別結合原理，在具有一定孔徑的硝酸纖維素膜與毛細管作用下，標記了抗體的指示劑會特異性識別與結合如尿樣、血樣或是唾液等生物樣本中的特定待測物，且在試紙條檢測區域滯留與顯色，并可結合讀數儀進行定量檢測。
[0003]近些年來由于醫療事業的不斷革新與進步，對所涉及到的免疫層析試紙條的定量檢測要求也有所增加。基于膠體金作為指示劑的免疫層析試紙最早應用在早孕檢測領域，目前已擴展到多個領域，如生物醫學、食品安全、環境、農藥殘留等，取得了巨大的成功。但其在定量檢測和超靈敏檢測上早也無能為力，其充其量只能定義為半定量常規檢測。因此，基于社會的快速發展，急需一種或多種能快速靈敏定量檢測的免疫層析試紙方法。
[0004]近幾年發展起來的基于熒光納米粒子(如摻雜稀土發光化合物或有機熒光染料分子的聚苯乙烯納米粒子和熒光量子點)作為指示劑的免疫層析試紙雖然在定量和靈敏檢測上有所進步，但由于在定量讀數檢測過程中，必須保證激發光一直照射在試紙條區域上，由于在激發光照射過程中，試紙條上的硝酸纖維素膜和生物樣品本身也會受激發出熒光，導致定量讀數檢測得到的發光量，不僅包含了作為檢測目標的熒光納米粒子的受激發光量，還包含了作為干擾信號的硝酸纖維素膜和生物樣品本身的受激發光量，降低了熒光納米粒子指示劑與背景信號的信噪比，從而削弱了對待檢測物的檢測靈敏度和定量準確性。尤其是對于檢測靈敏度和準確性有較高要求的檢測項目，如傳染性疾病、心肌損傷、感染類等疾病，一般傳統的免疫層析試紙很難滿足檢測要求。
[0005]因此，市場上急需一種檢測靈敏度高、定量準確的發光指示劑免疫層析試紙及定量檢測方法。這是本申請需要著重改善的地方。

【發明內容】

[0006]本發明所要解決的技術問題是要提供一種有效消除干擾發光信號，能夠提升定量檢測靈敏度和準確度的免疫層析試紙。
[0007]本發明所要解決的另一技術問題是要提供能夠提升定量檢測靈敏度和準確度的免疫層析試紙的定量檢測方法。
[0008]為了解決本發明的第一個技術問題所采用的技術方案是:一種免疫層析試紙，包括結合物墊、測試線和質控線;所述結合物墊上設有已標記檢測抗體或檢測抗原的長余輝發光納米粒子。
[0009]上述方案中，所述測試線包被有針對待檢測樣品中目標物的捕獲抗體或捕獲抗原;所述質控線包被有用于識別已標記在長余輝發光納米粒子上的檢測抗體的抗體或檢測抗原的抗體。
[0010]上述方案中，所述免疫層析試紙還包括底板、樣品墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，所述底板上依次搭接樣品墊、結合物墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，所述測試線和質控線設在所述硝酸纖維素膜上。
[0011]上述方案中，所述樣品墊為玻璃纖維膜或聚酯纖維膜;所述結合物墊為玻璃纖維膜;所述底板為聚氯乙烯膠板。
[0012]上述方案中，所述免疫層析試紙還包括設置在外面的卡殼，所述卡殼上設有用于滴加檢測樣品的加樣區和用于觀察或讀取信號的顯色區;所述檢測樣品為血清、全血、尿液和組織液中的一種或多種。
[0013]上述方案中，所述長余輝發光納米粒子的尺寸小于等于300納米，且大于等于5納米。
[0014]所述長余輝發光納米粒子的余輝時間不少于30秒，優選是大于I分鐘。
[0015]所述長余輝發光納米粒子優選采用以下幾類:
[0016](I)硫化物型長余輝材料，如 ZnS: Cu2+、CaS: Eu2+、SrGa2S4: Eu2+或 Y2O2S: Eu3+。
[0017](2)鋁酸鹽長余輝材料，尤其是Eu2+激活的稀土鋁酸鹽系列長余輝材料，其中發綠光性能較好的有SrAlO4: Eu2+，Dy3+，發藍光性能較好的有CaAlO4: Eu2+，Nd3+。
[0018](3)硅酸鹽長余輝材料，如 Ba5Si8O21: Eu2+，Dy3+。
[0019](4)鈦酸鹽長余輝材料，如CaTi03:Pr3+，以及添加輔助摻雜元素或者電荷補償劑的CaT13: Pr3+。
[0020](5)鎵酸鹽長余輝材料，如ZnGa204:Cr3+，以及添加輔助摻雜元素或者電荷補償劑的 ZnGa204:Cr3+。
[0021]本發明利用長余輝發光納米粒子作為指示劑，提供一種檢測靈敏度和檢測準確度高的免疫層析試紙。具體方案是將檢測目標物的抗體或抗原通過化學偶聯的方法標記到長余輝發光納米粒子上，然后將標記好抗體或抗原的長余輝發光納米粒子設在結合物墊上，用于檢測待測樣品中的目標物;硝酸纖維素膜上設立的測試線事先包被有針對目標物的捕獲抗體或抗原;硝酸纖維素膜上設立的質控線事先包被有針對標記在長余輝發光納米粒子上的抗體，或抗原的抗體。上述結合物墊和包被有測試線和質控線的硝酸纖維素膜同其他樣品墊、吸水墊、卡殼和底板按照傳統試紙制作方法組裝形成本發明的免疫層析試紙。
[0022]為了解決本發明的第二個技術問題所采用的技術方案是:所述免疫層析試紙的檢測方法，步驟如下:
[0023](I)向樣品墊上滴入待檢測樣品；
[0024](2)用激發光照射測試線和質控線；
[0025](3)停止激發光照射后，再用發光讀數儀讀取測試線和質控線的發光信號。
[0026]上述方案中，所用激發光的波長是254nm至488nm，照射功率是50mW/cm2至300mW/cm2，照射時間是5秒至I分鐘。
[0027]本發明的優越功效在于:本發明采用長余輝發光納米粒子代替傳統的熒光納米粒子用于標記抗體或抗原，由于長余輝發光材料具有獨特的長余輝發光性能，其事先吸收激發光照射的能量后，關閉激發光照射仍可長時間發射光子信號，發射時間可長達數小時;但是試紙條上的硝酸纖維素膜和生物樣品本身不具有余輝性能，當激發光不再照射時將不再發光，即不會產生干擾的光信號;所以在激發光照射并關閉后，再利用光子讀數儀讀取長余輝發光納米粒子的余輝光信號，得到的余輝光信號作為準確的定量讀數檢測結果；因此，本發明有效消除了硝酸纖維素膜和生物樣品本身的受激產生的干擾信號，極大提升了對待檢測物的檢測靈敏度和定量準確性。
【附圖說明】
[0028]構成本申請的一部分的說明書附圖用來提供對本發明的進一步理解，本發明的示意性實施例及其說明用于解釋本發明，并不構成對本發明的不當限定。在附圖中:
[0029]圖1為本發明的結構示意圖；
[0030]圖中標號說明
[0031]!—pvc底板；2 一樣品墊；
[0032]3 一結合物墊；4 一硝酸纖維素膜；
[0033]5一吸水塾；6—測試線；
[0034]7—質控線。
【具體實施方式】
[0035]以下結合附圖對本發明的實施例進行詳細說明，但是本發明可以由權利要求限定和覆蓋的多種不同方式實施。
[0036]下面結合圖1詳細說明本發明的實施例。圖1示出了本發明實施例的結構示意圖。
[0037]實施例1
[0038]本實施例是一種用于定量檢測甲胎蛋白(AFP)的免疫層析試紙，如圖1所示，本發明提供一種免疫層析試紙，包括PVC底板1，底板I上依次設有樣品墊2、結合物墊3、硝酸纖維素膜4和吸水墊5;硝酸纖維素膜4上沿著從樣品墊2到吸水墊5的方向，還依次設有測試線6和質控線7。層析方向如圖1中箭頭的指示方向。
[0039]結合物墊3上設有已標記有檢測抗體的長余輝發光納米粒子。該檢測抗體是能特異性檢測甲胎蛋白(AFP)的抗體(ant1-AFP antibody)；
[0040]測試線6上包被有能特異性捕獲甲胎蛋白(AFP)的另一抗體；
[0041]質控線7上包被有能特異性捕獲長余輝發光納米粒子上標記的抗體的抗體(二抗)。
[0042]所用的長余輝發光納米粒子的分子結構式是ZnGa204:Cr3+，其粒子尺寸為15納米。該長余輝發光納米粒子的制備方法如下:配置1.0M硝酸鋅(Zn(NO3)2)水溶液，1.0M硝酸鎵(Ga(NO3)3)水溶液和0.00IM硝酸鉻(Cr (NO3) 3)水溶液。按照上述濃度計算并量取Immo I硝酸鋅，ImmoI硝酸嫁，0.002mmoI硝酸絡，并用去離子水將體系溶液體積增加至16mL，攪拌混勾后，在攪拌過程中向上述體系溶液中快速加入氨水(28%，wt)使體系溶液pH為9.5，室溫下繼續攪拌半小時后轉入容量為40mL的聚四氟乙烯內襯中，再將內襯放入到水熱反應釜中，200°C進行水熱反應12小時，自然冷卻至室溫，離心(12000g，15min)得到白色沉淀物，該沉淀物用0.02M鹽酸水溶液分散，得到光學透明的溶液，再向該溶液中加入等體積的異丙醇，離心(12000g，20min)得到的沉淀物真空干燥后即為長余輝發光納米粒子。利用透射電子顯微鏡觀察該長余輝發光納米粒子的尺寸為15nm，所獲得的長余輝發光納米粒子經過405納米LED光源激發照射30秒后(照射功率為lOOmW/cm2)，停止照射，經光譜儀檢測其長余輝發射時間可達15分鐘，發射波長為696納米，完全滿足免疫層析試紙條讀數儀的定量檢測。
[0043]為后續生物標記抗體(或抗原)應用，該長余輝發光納米粒子還需表面引入可供化學偶聯的官能團。具體實施如下:將上述獲得的尺寸15納米的長余輝發光納米粒子(1.0g)借助水浴超聲波分散(功率80w，超聲時間5min)分散于20mL無水乙醇中，再加入0.025g 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，于室溫攪拌反應48小時。離心分離(1000g，15min)留取沉淀物，利用無水乙醇分散后再次離心(10000g，15min)，得到的沉淀物即是氨基化的長余輝發光納米粒子，簡要分子結構式為ZnGa2O4: Cr3+-NH2，-NH2為長余輝發光納米粒子表面上引入的氨基官能團，可用于抗體標記。
[0044]氨基化長余輝發光納米粒子的抗體標記。該抗體標記方法為常用方法。本發明選取甲胎蛋白(AFP)作為一種疾病模型加以闡述。標記方法如下:稱取以上制備好的1mg尺寸15納米的氨基化長余輝發光納米粒子，分散在1.0mL含有5%戊二醛的磷酸鹽緩沖溶液(I3BS)中(0.01M，pH7.2)，室溫反應2小時;得到的醛基化長余輝發光納米粒子通過離心沉淀洗滌后(10000g，15min)，再分散在1.0mL PBS(0.01M,pH7.2)溶液中，加入0.05mg抗AFP抗體(ant1-AFP antibody)，室溫反應2小時;通過離心洗滌(10000g，15min)，除去未反應的游離抗體后，離心得到的沉淀物即是長余輝發光納米粒子抗體復合物，該復合物的簡要分子結構式為ZnGa204:Cr3+-anti_AFP antibody。
[0045]本發明所涉及到的免疫層析試紙按照傳統試紙制作方法，本發明中將傳統免疫層析試紙中所用到的膠體金抗體復合物，或熒光納米乳膠抗體復合物替換為本發明所制備的長余輝發光納米粒子抗體復合物，目的是通過消除背景熒光信號，增強信噪比，極大地提高待檢測物的檢測靈敏度和檢測準確性。基于長余輝發光納米粒子抗體復合物的免疫層析試紙制作簡要敘述如下:將上述制備好的5.0mg長余輝發光納米粒子抗體復合物溶解分散在1mL特定稀釋液(如硼酸鹽緩沖液(50mM，pH8.2))中，然后均勻涂覆于玻璃纖維素膜上，SP可用作結合物墊3;將待檢測物的另一抗體與二抗分別包被于硝酸纖維素膜4上形成測試線6(T線)和質控線7(C線)；上述所涉及到的另一抗體和二抗劃線濃度、T線與C線的寬度以及二者的間隔距離、烘干固定工藝參數均參考現有成熟技術。最后將上述劃有另一抗體與二抗的硝酸纖維素膜、涂覆了長余輝發光納米粒子抗體復合物的玻璃纖維素膜(結合物墊)、玻璃纖維或聚酯膜樣品墊2、吸水墊5按照圖1的示意圖粘貼組裝在PVC底板I上，得到完整的基于長余輝發光納米粒子抗體復合物的免疫層析試紙。
[0046]本實施例的定量檢測方法如下:
[0047](I)向結合物墊上滴入待檢測樣品；
[0048](2)用激發光照射測試線6和質控線7;具體是用405納米的LED光源照射C線與T線區域30秒，照射功率為10mW/cm2，對C線與T線上結合的長余輝發光納米粒子抗體復合物進行能量供給；
[0049](3)停止激發光照射后，再用發光讀數儀讀取測試線6和質控線7的發光信號。具體是利用發光讀數儀，檢測長余輝發光納米粒子抗體復合物的余輝光信號。
[0050]最后將測得的光信號數據代入事先已標定的“AFP已知濃度-光信號”的公式，得出本次所檢測AFP的濃度。
[0051]本實施例利用抗原-抗體特異性識別原理，結合所制備的長余輝納米材料的獨特發光優勢，僅需要在讀數前使用激發光激發，而在后續的讀數過程中無需再次激發;該方法消除了背景熒光信號的干擾，可實現待測物的高靈敏定量檢測。
[0052]通過與傳統熒光免疫層析試紙對AFP的檢測對比，發現基于本發明的長余輝發光納米粒子抗體復合物的免疫層析試紙在檢測靈敏度上提高了 12倍;但對檢測樣品處理要求和檢測用時上沒有明顯變化。
[0053]實施例2
[0054]本實施例是一種用于定量檢測結核(TB)抗體的免疫層析試紙，如圖1所示，本發明提供一種免疫層析試紙，包括PVC底板I，PVC底板I上依次設有樣品墊2、結合物墊3、硝酸纖維素膜4和吸水墊5;硝酸纖維素膜4上沿著從樣品墊2到吸水墊5的方向，還依次設有測試線6和質控線7。
[0055]所述結合物墊3上設有已標記有檢測抗原和兔IgG的長余輝發光納米粒子。該檢測抗原是能特異性檢測結核抗體的TB重組抗原(CTK公司TB融合抗原，TB antigen)；
[0056]所述測試線6上包被有能特異性捕獲結核抗體的抗原；
[0057]所述質控線7上包被有能特異性捕獲長余輝發光納米粒子上標記的兔IgG的抗體。
[0058]所用的長余輝發光納米粒子同實施例1。
[0059]為后續生物標記抗原應用，該長余輝發光納米粒子還需表面引入可供化學偶聯的官能團。具體實施如下:將上述獲得的尺寸15納米的長余輝發光納米粒子(1.0g)借助水浴超聲波分散(功率80w，超聲時間5min)分散于I OmL牛血清白蛋白(BSA)水溶液(2.0 %，wt)中，室溫攪拌6小時后離心分離(10000g，25min)，得到的沉淀物即是BSA表面修飾后的長余輝發光納米粒子，簡要分子結構式為ZnGa2O4: Cr3+-BSA,-BSA為長余輝發光納米粒子表面上引入的牛血清白蛋白，帶有羧基官能團，可用于抗原和兔IgG標記。
[0060]BSA修飾的長余輝發光納米粒子的抗原和兔IgG標記。該標記方法為常用方法。本實例選取結核抗體作為一種疾病模型加以闡述。標記方法如下:稱取以上制備好的1mg尺寸15納米的BSA修飾的長余輝發光納米粒子分散在1.0mL PBS(0.01M,pH7.2)溶液中，再加入0.05mg TB重組抗原和0.05mg兔IgG，混勾后向上述體系加入新鮮配置的8.0mg/mL碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCl)水溶液20yL，室溫反應2小時后，通過離心洗滌(10000g，25min)，除去未反應的游離蛋白后，離心得到的沉淀物即是長余輝發光納米粒子抗原復合物。
[0061 ]所述免疫層析試紙的制作方法同實施例1。
[0062]本實施例的定量檢測方法如下:
[0063](I)向結合物墊3上滴入待檢測樣品；
[0064](2)用激發光照射測試線6和質控線7;具體是用405納米的LED光源照射C線與T線區域25秒，照射功率為100mW/cm2，對C線與T線上結合的長余輝發光納米粒子抗原復合物進行能量供給；
[0065](3)停止激發光照射后，再用發光讀數儀讀取測試線6和質控線7的發光信號。具體是利用發光讀數儀，檢測長余輝發光納米粒子抗體復合物的余輝光信號。
[0066]最后將測得的光信號數據代入事先已標定的“TB抗體已知濃度-光信號”的公式，得出本次所檢測TB抗體的濃度。
[0067]本實施例利用抗原-抗體特異性識別原理，結合所制備的長余輝納米材料的獨特發光優勢，僅需要在讀數前使用激發光激發，而在后續的讀數過程中無需再次激發;該方法消除了背景熒光信號的干擾，實現待測物的高靈敏定量檢測。
[0068]通過與傳統熒光免疫層析試紙對TB抗體的檢測對比，發現基于本發明的長余輝發光納米粒子抗原復合物的免疫層析試紙在檢測靈敏度上提高了 8倍;但對檢測樣品處理要求和檢測用時上沒有明顯變化。
[0069]實施例3
[0070]本實施例是一種用于定量檢測肌鈣蛋I(cTnl)的免疫層析試紙，如圖1所示，本發明提供一種免疫層析試紙，包括PVC底板I，PVC底板I上依次設有樣品墊2、結合物墊3、硝酸纖維素膜4和吸水墊5;硝酸纖維素膜4上沿著從樣品墊2到吸水墊5的方向，還依次設有測試線6和質控線7。
[0071]所述結合物墊3上設有已標記有檢測抗體的長余輝發光納米粒子。該檢測抗體是能特異性檢測肌1丐蛋I的抗體(ant1-cTnl antibody)；
[0072]所述測試線6上包被有能特異性捕獲肌鈣蛋I(cTnl)的另一抗體；
[0073]所述質控線7上包被有能特異性捕獲長余輝發光納米粒子上標記的抗體的抗體(二抗)。
[0074]所用的長余輝發光納米粒子的分子結構式是CaTi03:Pr3+@lpSi02，其粒子尺寸為250納米。lpSi02為大孔二氧化娃納米粒子。該長余輝發光納米粒子的制備方法如下:(I)稱取0.1克聚苯乙烯-13-聚丙烯酸雙親性嵌段共聚物?5(20000)-13-?44(900)，涉及到的分子量為數均分子量，作為致孔劑溶解在30mL的四氫呋喃中，攪拌至充分溶解后加入60mL去離子水，繼續攪拌2小時后利用加入氨水將上述體系溶液pH調節至11.5，再加入0.2克TEOS，室溫反應24小時，離心分離(8000g，15min)后留取沉淀物，用無水乙醇分散，再次離心分離(8000g，15min)后留取沉淀物，80攝氏度干燥，600攝氏度下煅燒除去致孔劑，利用高分辨投射電子顯微鏡得知所獲得尺寸為250納米的大孔二氧化硅納米粒子，利用BET比表面分析和N2吸附-脫吸附方法得知產品的比表面積達到450m2/g，孔道容積為3.2cm3/g，大孔孔道尺寸約22.2nm，利用小角x射線散射(SAXS)表征和小角x射線衍射表征得知所獲得的大孔二氧化硅納米粒子的大孔具有六方的孔道結構，與投射電子顯微鏡所觀測的結果一致。所獲得大孔通道作為微反應器用于長余輝材料的合成。(2)稱取1.18g四水合硝酸鈣(Ca(NO3)2.4H20)，0.008g硝酸鐠(Pr (NO3)3)，I.05g檸檬酸，0.5g聚乙二醇PEG(分子量為一萬)和2.2mL鈦酸四丁酯，將上述稱取物溶入30mL去離子水中，攪拌至完全溶解狀態，用0.5M的硝酸溶液將上述混合溶液的PH調節至4.0后，再加入2.0g上述制備好的大孔二氧化硅納米粒子，借助水浴超聲波分散(功率80w，超聲時間5min)，于室溫攪拌6小時，以致大孔二氧化娃納米粒子吸附金屬離子，然后離心分離(8000g，15min)獲得填充了金屬離子的大孔納米級別二氧化硅粒子。離心得到的沉淀物80攝氏度干燥2小時后置于含有I %?12 %還原性氫氣的氬氣氣氛中，于650°C煅燒2小時，即得到250nm左右單分散性的長余輝二氧化硅納米粒子。所獲得納米粒子經過405nm LED光源激發照射60s后(照射功率為10mW/cm2)，停止照射，經光譜儀檢測其長余輝發射時間可達1.5小時，發射波長為615nm，完全滿足讀數儀定量檢測。其簡要分子結構式為CaTi03: Pr3+ilpSi02，其中Ip為大孔(large pore)的首字母縮寫。
[0075]為后續生物標記抗體應用，該長余輝發光納米粒子還需表面引入可供化學偶聯的官能團。具體實施如下:將上述獲得的尺寸250納米的長余輝發光納米粒子(1.0g)借助水浴超聲波分散(功率80w，超聲時間5min)分散于20mL無水乙醇中，再加入0.05g 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，于室溫攪拌反應48小時。離心分離(1000g，15min)留取沉淀物，利用無水乙醇分散后再次離心(10000g，15min)，得到的沉淀物即是氨基化的長余輝發光納米粒子，簡要分子結構式為CaT13: Pr3+OlpS12-NH2，-NH2為長余輝發光納米粒子表面上引入的氨基官能團，可用于抗體標記。
[0076]氨基化長余輝發光納米粒子的抗體標記。該抗體標記方法為常用方法。本發明選取心肌損傷標志物中的肌鈣蛋白I來作為一種疾病模型加以闡述。標記方法如下:稱取以上制備好的20mg尺寸250納米的氨基化長余輝發光納米粒子分散在2.0mL含有5%戊二醛的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中(0.01M，pH7.2)，室溫反應2小時;得到的醛基化長余輝發光納米粒子通過離心沉淀洗滌后(80008，151^11)，再分散在1.011^ PBS(0.01M，pH7.2)溶液中，加入0.2mg抗肌|丐蛋白I抗體(ant1-cTnl antibody)，室溫反應2小時；通過離心洗滌(8000g，15min)，除去未反應的游離抗體后，離心得到的沉淀物即是長余輝發光納米粒子抗體復合物，該復合物的簡要分子結構式為CaTi03:Pr3+@lpSi02-ant1-cTnI antibody。
[0077]所述免疫層析試紙的制作同實施例1。
[0078]本實施例的定量檢測方法如下:
[0079](I)向結合物墊3上滴入待檢測樣品；
[0080](2)用激發光照射測試線6和質控線7;具體是用405納米的LED光源照射C線與T線區域30秒，照射功率為10mW/cm2，對C線與T線上結合的長余輝發光納米粒子抗體復合物進行能量供給；
[0081](3)停止激發光照射后，再用發光讀數儀讀取測試線和質控線的發光信號。具體是利用發光讀數儀，檢測長余輝發光納米粒子抗體復合物的余輝光信號。
[0082]最后將測得的光信號數據代入事先已標定的“cTnl已知濃度-光信號”的公式，得出本次所檢測cTn I的濃度。
[0083]本實施例利用抗原-抗體特異性識別原理，結合所制備的長余輝納米材料的獨特發光優勢，僅需要在讀數前使用激發光激發，而在后續的讀數過程中無需再次激發;該方法消除了背景熒光信號的干擾，實現待測物的高靈敏定量檢測。
[0084]通過與傳統熒光免疫層析試紙條對AFP的檢測對比，發現基于本發明的長余輝發光納米粒子抗體復合物的免疫層析試紙在檢測靈敏度上提高了 16倍;但對檢測樣品處理要求和檢測用時上沒有明顯變化。
[0085]實施例4
[0086]本實施例是一種用于定量檢測血液中梅毒(TP)抗體的免疫層析試紙，如圖1所示，本發明提供一種免疫層析試紙，包括PVC底板I，PVC底板I上依次設有樣品墊2、結合物墊3、硝酸纖維素膜4和吸水墊5;硝酸纖維素膜4上沿著從樣品墊2到吸水墊5的方向，還依次設有測試線6和質控線7。
[0087]所述結合物墊3上設有已標記有檢測抗原和兔IgG的長余輝發光納米粒子。該檢測抗體是能特異性檢測血液中梅毒(TP)抗體的重組抗原；
[0088]所述測試線6上包被有能特異性捕獲血液中梅毒(TP)抗體的抗原；
[0089]所述質控線7上包被有能特異性捕獲長余輝發光納米粒子上標記的兔IgG的抗體。
[0090]所用的長余輝發光納米粒子和表面官能團化方法同實施例3。
[0091]氨基化長余輝發光納米粒子的抗原標記。該抗體標記方法為常用方法。本發明選取血液中梅毒抗體作為一種疾病模型加以闡述。標記方法如下:稱取以上制備好的1mg尺寸250納米的氨基化長余輝發光納米粒子分散在1.5mL含有5%戊二醛的磷酸鹽緩沖溶液(I3BS)中(0.01M，pH7.2)，室溫反應2小時;得到的醛基化長余輝發光納米粒子通過離心沉淀洗滌后(800(^，1511^11)，再分散在1.01^卩83(0.0謂，？!17.2)溶液中，加入0.1511^ TP重組抗原和0.15mg兔IgG,室溫反應2小時;通過離心洗滌(8000g，15min)，除去未反應的游離抗原后，離心得到的沉淀物即是長余輝發光納米粒子抗原復合物。
[0092]所述免疫層析試紙的制作同實施例1。
[0093]本實施例的定量檢測方法如下:
[0094](I)向結合物墊3上滴入待檢測樣品；
[0095](2)用激發光照射測試線6和質控線7;具體是用405納米的LED光源照射C線與T線區域40秒，照射功率為100mW/cm2，對C線與T線上結合的長余輝發光納米粒子抗原復合物進行能量供給；
[0096](3)停止激發光照射后，再用發光讀數儀讀取測試線和質控線的發光信號。具體是利用發光讀數儀，檢測長余輝發光納米粒子抗體復合物的余輝光信號。
[0097]最后將測得的光信號數據代入事先已標定的“TP抗體已知濃度-光信號”的公式，得出本次所檢測TP抗體的濃度。
[0098]本實施例利用抗原-抗體特異性識別原理，結合所制備的長余輝發光納米材料的獨特發光優勢，僅需要在讀數前使用激發光激發，而在后續的讀數過程中無需再次激發;該方法消除了背景熒光信號的干擾，實現待測物的高靈敏定量檢測。
[0099]通過與傳統熒光免疫層析試紙對TP的檢測對比，發現基于本發明的長余輝發光納米粒子抗原復合物的免疫層析試紙在檢測靈敏度上提高了 12倍;但對檢測樣品處理要求和檢測用時上沒有明顯變化。
[0100]實施例5
[0101]本實施例是一種用于定量檢測血液中C反應蛋白(CRP)的免疫層析試紙，如圖1所示，本發明提供一種免疫層析試紙，包括PVC底板1，PVC底板I上依次設有樣品墊2、結合物墊
3、硝酸纖維素膜4和吸水墊5;硝酸纖維素膜4上沿著從樣品墊2到吸水墊5的方向，還依次設有測試線6和質控線7。
[0102]所述結合物墊3上設有已標記有檢測抗體的長余輝發光納米粒子。該檢測抗體是能特異性檢測血液中C反應蛋白(CRP)的抗體(ant1-CRP antibody)；
[0103]所述測試線6上包被有能特異性捕獲C反應蛋白(CRP)的另一抗體；
[0104]所述質控線7上包被有能特異性捕獲長余輝發光納米粒子上標記的抗體的抗體(二抗)。
[0?05] 所用的長余輝發光納米粒子的分子結構式是ZnGaGe204: Cr3+，其粒子尺寸為25納米。該長余輝發光納米粒子的制備方法如下:配置1.0M硝酸鋅(Zn(NO3)2)水溶液，1.0M硝酸鎵(Ga (NO3) 3)水溶液，1.0M硝酸鍺(Ge (NO3) 2)水溶液，0.00IM硝酸鉻(Cr (NO3) 3)水溶液。按照上述濃度計算并量取2mmol硝酸鋅，3mmol硝酸嫁，0.8mmol硝酸鍺，0.002mmol硝酸絡，并用去離子水將體系溶液體積增加至20mL，攪拌混勻后，在攪拌過程中向上述體系溶液中快速加入氨水(28%，wt)使體系溶液pH為9.0，室溫下繼續攪拌半小時后轉入容量為40mL的聚四氟乙烯內襯中，再將內襯放入到水熱反應釜中，220 °C進行水熱反應1小時，自然冷卻至室溫，離心(1000(^，15!^11)得到白色沉淀物，該沉淀物用0.0謂鹽酸水溶液分散，得到光學透明的溶液，再向該溶液中加入等體積的異丙醇，離心(1000g，20min)得到的沉淀物真空干燥后即為長余輝發光納米粒子。利用透射電子顯微鏡觀察該長余輝發光納米粒子的尺寸為25納米，所獲得的長余輝發光納米粒子經過405nm LED光源激發照射40s后(照射功率為10mff/cm2)，停止照射，經光譜儀檢測其長余輝發射時間可達I小時，發射波長為697nm，完全滿足免疫層析試紙讀數儀定量檢測。其簡要分子結構式為ZnGaGe2O4: Cr3+。
[0106]該長余輝發光納米粒子的表面官能團化方法同實施例2。
[0107]BSA修飾的長余輝發光納米粒子的抗體標記。該標記方法為常用方法。本實例選取血液中C反應蛋白作為一種疾病模型加以闡述。標記方法如下:稱取以上制備好的15mg尺寸25納米的BSA修飾的長余輝發光納米粒子分散在1.0mL PBS(0.01M，pH7.2)溶液中，再加入0.08mg抗CRP抗體，混勾后向上述體系加入新鮮配置的8.0mg/mL碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCl)水溶液20yL，室溫反應2小時后，通過離心洗滌(10000g，25min)，除去未反應的游離抗體后，離心得到的沉淀物即是長余輝發光納米粒子抗體復合物。
[0108]所述免疫層析試紙的制作同實施例1。
[0109]本實施例的定量檢測方法如下:
[0110](I)向結合物墊3上滴入待檢測樣品；
[0111](2)用激發光照射測試線6和質控線7;具體是用405納米的LED光源照射C線與T線區域30秒，照射功率為10mW/cm2，對C線與T線上結合的長余輝發光納米粒子抗體復合物進行能量供給；
[0112](3)停止激發光照射后，再用發光讀數儀讀取測試線和質控線的發光信號。具體是利用發光讀數儀，檢測長余輝發光納米粒子抗體復合物的余輝光信號。
[0113]最后將測得的光信號數據代入事先已標定的“CRP已知濃度-光信號”的公式，得出本次所檢測CRP的濃度。
[0114]本實施例利用抗原-抗體特異性識別原理，結合所制備的長余輝發光納米材料的獨特發光優勢，僅需要在讀數前使用激發光激發，而在后續的讀數過程中無需再次激發;該方法消除了背景熒光信號的干擾，實現待測物的高靈敏定量檢測。
[0115]通過與傳統熒光免疫層析試紙對CRP的檢測對比，發現基于本發明的長余輝發光納米粒子抗體復合物的免疫層析試紙在檢測靈敏度上提高了 15倍;但對檢測樣品處理要求和檢測用時上沒有明顯變化。
[0116]實施例6
[0117]本實施例是一種用于定量檢測人血液中HSP70抗體的免疫層析試紙，如圖1所示，本發明提供一種免疫層析試紙，包括PVC底板I，PVC底板I上依次設有樣品墊2、結合物墊3、硝酸纖維素膜4和吸水墊5;硝酸纖維素膜4上沿著從樣品墊2到吸水墊5的方向，還依次設有測試線6和質控線7。
[0118]所述結合物墊3上設有已標記有檢測抗原和兔IgG的長余輝發光納米粒子。該檢測抗原是能特異性檢測血液中HSP70抗體的抗原；
[0119]所述測試線6上包被有能特異性捕獲HSP70抗體的抗原；
[0120]所述質控線7上包被有能特異性捕獲長余輝發光納米粒子上標記的兔IgG的抗體。
[0121]所用的長余輝發光納米粒子及其表面官能團化方法同實施例5。
[0122]BSA修飾的長余輝發光納米粒子的抗原標記。該標記方法為常用方法。本實例選取血液中HSP70抗體作為一種疾病模型加以闡述。標記方法如下:稱取以上制備好的25mg尺寸25納米的BSA修飾的長余輝發光納米粒子分散在3.0mL PBS(0.01M，pH7.2)溶液中，再加入0.05mg HSP70抗原和0.04mg兔IgG,混勾后向上述體系加入新鮮配置的8.0mg/mL碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCl)水溶液25yL，室溫反應2小時后，通過離心洗滌(1000g，25min)，除去未反應的游離抗原后，離心得到的沉淀物即是長余輝發光納米粒子抗原復合物。
[0123]所述免疫層析試紙的制作同實施例1。
[0124]本實施例的定量檢測方法如下:
[0125](I)向結合物墊3上滴入待檢測樣品；
[0126](2)用激發光照射測試線6和質控線7;具體是用405納米的LED光源照射C線與T線區域45秒，照射功率為100mW/cm2，對C線與T線上結合的長余輝發光納米粒子抗原復合物進行能量供給；
[0127](3)停止激發光照射后，再用發光讀數儀讀取測試線和質控線的發光信號。具體是利用發光讀數儀，檢測長余輝發光納米粒子抗體復合物的余輝光信號。
[0128]最后將測得的光信號數據代入事先已標定的“HSP70抗體已知濃度-光信號”的公式，得出本次所檢測HSP70抗體的濃度。
[0129]本實施例利用抗原-抗體特異性識別原理，結合所制備的長余輝發光納米材料的獨特發光優勢，僅需要在讀數前使用激發光激發，而在后續的讀數過程中無需再次激發;該方法消除了背景熒光信號的干擾，實現待測物的高靈敏定量檢測。
[0130]通過與傳統熒光免疫層析試紙對HSP70抗體的檢測對比，發現基于本發明的長余輝發光納米粒子抗原復合物的免疫層析試紙在檢測靈敏度上提高了 9倍;但對檢測樣品處理要求和檢測用時上沒有明顯變化。
[0131]以上所述僅為本發明的優先實施例而已，并不用于限制本發明，對于本領域的技術人員來說，本發明可以有各種更改和變化。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1.一種免疫層析試紙，包括結合物墊、測試線和質控線；其特征在于:所述結合物墊上設有已標記檢測抗體或檢測抗原的長余輝發光納米粒子。2.根據權利要求1所述的免疫層析試紙，其特征在于:所述測試線包被有針對待檢測樣品中目標物的捕獲抗體或捕獲抗原;所述質控線包被有用于識別已標記在長余輝發光納米粒子上的檢測抗體的抗體或檢測抗原的抗體。3.根據權利要求1所述的免疫層析試紙，其特征在于:所述免疫層析試紙還包括底板、樣品墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，所述底板上依次搭接樣品墊、結合物墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，所述測試線和質控線設在所述硝酸纖維素膜上。4.根據權利要求3所述的免疫層析試紙，其特征在于:所述樣品墊為玻璃纖維膜或聚酯纖維膜;所述結合物墊為玻璃纖維膜;所述底板為聚氯乙烯膠板。5.根據權利要求3所述的免疫層析試紙，其特征在于:所述免疫層析試紙還包括設置在外面的卡殼，所述卡殼上設有用于滴加檢測樣品的加樣區和用于觀察或讀取信號的顯色區;所述檢測樣品為血清、全血、尿液和組織液中的一種或多種。6.根據權利要求1所述的免疫層析試紙，其特征在于:所述長余輝發光納米粒子的尺寸小于等于300納米，且大于等于5納米。7.根據權利要求1所述的免疫層析試紙，其特征在于:所述長余輝發光納米粒子的余輝時間不少于30秒。8.如權利要求1所述的免疫層析試紙的檢測方法，步驟如下: (1)向樣品墊上滴入待檢測樣品； (2)用激發光照射測試線和質控線； (3)停止激發光照射后，再用發光讀數儀讀取測試線和質控線的發光信號。9.根據權利要求8所述的免疫層析試紙的檢測方法，其特征在于:所用激發光的波長是254nm至488nm，照射功率是50mW/cm2至300mW/cm2，照射時間是5秒至I分鐘。
【文檔編號】G01N33/558GK105929155SQ201610537749
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年7月8日
【發明人】張兵波
【申請人】同濟大學