一種黃曲霉毒素b1金納米井陣列免疫電極的制備方法
【專利摘要】本發明涉及一種黃曲霉毒素B1金納米井陣列免疫電極的制備方法，其采用化學沉積法在模孔直徑為400?800nm的聚碳酸酯濾膜上沉積金，得到金納米管陣列主體，在模孔直徑為80?200nm的聚碳酸酯濾膜上沉積金，得到金納米柱陣列底片，組裝制成金納米井陣列電極；在金納米管陣列電極表面滴加蛋白A溶液形成蛋白A/金納米井陣列電極；而后放入無標記AFB1抗體溶液中，制成AFB1抗體/蛋白A/金納米井陣列電極；進而封閉得到AFB1免疫反應電極。本發明制作簡單，具有三維結構，表面積大，有效避免不同材質導致的電化學響應信號的干擾；抗體固定牢固有效，性能穩定可靠，可實現AFB1的靈敏快速測定。
【專利說明】
一種黃曲霉毒素BI金納米井陣列免疫電極的制備方法
技術領域
[0001]本發明涉及一種電極的制備方法，具體地說是一種黃曲霉毒素BI金納米井陣列免疫電極的制備方法。
【背景技術】
[0002]黃曲霉毒素BI(AFBl)是迄今發現的毒性最強的一類生物毒素，具有誘導突變、抑制免疫和致癌作用。快速、靈敏、準確分析是避免和減小AFBl危害的有效手段。目前AFBl分析檢測方法如高效液相色譜法、酶聯免疫測定法、放射免疫測定法、金標法，免疫親和柱凈化-熒光快速檢測技術等，雖然取得了較大進展，但仍然存在操作要求高、步驟過于繁瑣、靈敏度較差、誤檢率高、儀器昂貴等不同缺陷。
[0003]電化學生物免疫電極基于抗原和抗體的識別與結合，具有快速、靈敏、儀器設備簡單等特殊優勢。金電極具有導電性好、化學性質穩定高、與生物大分子兼容性好等特點，因此是生物電化學中最常使用的電極材料之一。金納米材料比表面積大，可負載更多抗體及標記物，可對信號進行有效放大，且具有良好的生物相容性，因而可有效提高電化學免疫傳感器的靈敏度。Liu等[Liu Y, Qin Z, Wu X，Jiang H.B1chem.Eng.J., 2006, 32:211-217]在以2-氨基乙硫醇修飾的二維金叉指電極上自組裝一層納米金膠粒，將AFBl抗體直接固定在金膠粒上，構建了電導型免疫傳感器，檢測下限達到0.1 ng/mLC3Zhou等[Zhou LT, Li R Y, Li Z J, Xia Q F， Fang Y J, Liu J K.Sensor.Actuat.B-Chem.， 2012,174: 359-365]將納米金顆粒嵌入到導電聚合物中，提高了修飾電極的機械性能。Sharma等[Sharma A, Matharu Z, Sumana G, Solanki P R, Kim C G, Malhotra B D.ThinSolid Films, 2010，519: 1213-1218]利用N-羥基琥珀酰亞胺與乙基二甲基胺丙基碳化二亞胺(EDC)活化AFBl抗體(ant1-AFBl)上的羧基并與半胱胺修飾的金納米顆粒共價連接，隨后將金納米顆粒共價固定到巰基苯甲酸(MBA)自組裝膜(SAM)修飾的金電極上，構建了電流型免疫傳感器，檢測下限達0.179 ng/mLacao等[Hu H F，Cao LX, Li Q C，et al.RSC Advances.2015, 5: 55209-55217.]人在金三維柱狀納米陣列電極表面修飾聚鄰苯二胺，通過戊二醛交聯固定AFBl抗體，構建了阻抗型免疫傳感器，檢測下線為0.019 ng/mLo
[0004]然而，目前已有的AFBl金納米免疫傳感器還存在一定缺陷，限制了其在實際檢測中的應用。如制備過程復雜，成本高；納米金粒在電極上的分布和尺寸難以控制;抗體固定效果差，抗體與抗原結合的空間阻力高;檢測限高，定量測定線性范圍窄，穩定性差等。提高AFBl免疫傳感器性能最有效的二個途徑是:(I)改善基體電極的性能；(2)保證抗原或抗體在電極上有效固定，構建性能優越的分子識別膜。
[0005]納米陣列電極是多個納米電極的集合體。其不僅具有單個電極高傳質速率、低雙電層充電電流、小時間常數、小IR降及高信噪比等優，而且由于成千上萬個單個納米電極集中在一個基體上，克服了單個納米電極響應信號過小、易受干擾和難以操作等缺點，能極大地提高測量的靈敏度和可靠性，降低操作難度和測量成本。目前人們制備出多種形式的金納米陣列電極。如一維粒狀金納米陣列電極、二維帶狀盤狀金納米陣列電極、三維柱狀納米陣列電極及金納米管陣列電極。其中納米管陣列電極與其他陣列電極相比具有更大的活性面積，更優異的電催化性能，近年來，引起了研究者的特殊關注。
[0006]目前金納米管陣列電極(或修飾電極)制備方法的報道主要有以下二類:一類是在聚碳酸酯濾膜模孔中化學沉積金管或者在背面噴金的氧化鋁模板(聚碳酸酯濾膜模板)孔中電沉積金管，再用膠黏劑將其固定在基體電極上，然后溶去模板，制成納米管陣列(修飾)電極。另一類是采用納米金對碳納米管進行修飾，再將其用膠黏劑固定在基體電極上。然而，以上方法制備出的免疫電極存在不同程度上的不足。(I)電沉積法制備的電極，制備過程復雜，難以保證納米管長度、管壁厚度和均勻性;(2)由于是納米尺寸，裸露出來的納米管容易折斷；(3)無論電沉積法還是化學沉積法制備的金納米管陣列電極，其納米管的底部是敞口的，與基體電極表面連接部位是基體電極表面，或者是膠黏劑，其材質與金納米管壁是不同的(即使基體電極表面材料是金，由于制備工藝與金管壁不同，二者的表面狀態也是不同的)。因而電極放入溶液中，溶液不僅會與金納米管壁接觸還會與基體電極表面或者膠黏劑接觸，電極功能化和免疫修飾表面狀態不一致，會導致電化學響應信號受到一定干擾，因而影響到AFBl免疫檢測的準確性。
【發明內容】
[0007]本發明所要解決的技術問題是克服上述現有技術的不足，提供一種制作簡捷、成本低，具有三維結構，表面積大，抗體固定牢固有效，性能穩定可靠，能有效避免不同材質導致的電化學響應信號干擾的AFBI金納米井陣列免疫電極的制備方法。
[0008]本發明解決上述技術問題采用的技術方案是:一種AFBl金納米井陣列免疫電極的制備方法，其特征在于:其包括以下步驟:
(1)金納米管陣列主體的制備:首先采用化學沉積法在模孔直徑為400-800nm的聚碳酸酯濾膜模板上沉積金，模孔中沉積有金納米管，通過控制沉積時間，使模孔中沉積金納米管的壁厚為50-200nm;而后去除該聚碳酸酯濾膜上表面的鍍金層，得到金納米管陣列主體；
(2)金納米柱陣列底片的制備:采用化學沉積法在模孔直徑為80-200nm的聚碳酸酯濾膜模板上沉積金，通過控制沉積時間，使模孔中充滿實心的金納米柱，得到金納米柱陣列底片;
(3)金納米井陣列陣列電極的組裝:而后將得到的金納米柱陣列底片下表面通過導電膠粘結固定在集電體上，金納米管陣列主體平鋪覆蓋在金納米柱陣列底片上，周邊用絕緣膠帶密封固定在集電體上，制成金納米井陣列電極；
(4)定向蛋白A自組裝修飾金納米井陣列電極的制備:在金納米管陣列電極表面滴加50yL 0.2mg/mL的蛋白A溶液，恒溫25-30 °C，反應時間為50_60min，得到蛋白A/金納米井陣列電極；
(5 )抗體的固定:將步驟(4)得到的蛋白A/金納米井陣列電極放入1.2 mg/mL的無標記AFBl抗體溶液中，恒溫25-30 °C，反應時間為50_60min，制成AFBl抗體/蛋白A/金納米井陣列電極；
(6)封閉:將步驟(5)得到的電極浸入到3%小牛血清溶液中，封閉非活性位點，恒溫25-30 °C，時間為50-60min，得到AFBl免疫電極。
[0009]本發明制備的基礎電極一金納米井陣列電極具有三維納米結構，表面積大。由于管壁包埋在聚碳酸酯濾膜中，結構穩定，強度好;井壁和井底材質相同，能有效避免不同材質所導致的電化學響應信號的干擾。直接在其井壁和井底表面通過自組裝固定蛋白A，使抗體的抗原結合位點Fab段得到充分的暴露，并有效降低抗體與抗原結合的空間阻力，較好地保持其空間構象，提高固相抗體的特異性和利用率，提高了傳感器的靈敏度。制備的無標記免疫反應電極不需要對抗原或抗體進行標記，簡化了制備和操作過程，有效地提高了分析速度，降低了分析成本。進行測量時，將免疫電極放至一系列不同濃度的得出抗原的定量關系溶液中，在25°C下進行免疫反應60 min后，在2 mmol/L K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)e+PBS(pH=7.00)中進行電化學阻抗譜測量，采用阻抗譜擬合軟件ZsimpWin對傳感器與不同濃度抗原免疫反應后的阻抗譜進行擬合計算，得到在一定濃度下的工作曲線。該方法的檢測限可達至IJl.0X 10—1Q g/mL。遠低于歐盟的檢出限量2ng/g。本發明制作簡單、成本低，具有三維結構，表面積大，抗體固定牢固有效，性能穩定可靠，抗體的特異性和利用率大大提高，能夠實現檢測體系的微型化和集成化，有效避免不同材質導致的電化學響應信號的干擾，可實現AFBl的快速靈敏檢測。
【具體實施方式】
[0010]下面結合對本發明進行具體描述。
[0011]—種黃曲霉毒素BI金納米井陣列免疫電極的制備方法，其包括以下步驟:
(1)金納米管陣列主體的制備:首先采用化學沉積法在模孔直徑為400-800nm的聚碳酸酯濾膜模板上沉積金，模孔中沉積有金納米管，通過控制沉積時間，使模孔中沉積金納米管的壁厚為50-200nm;而后去除該聚碳酸酯濾膜上表面的鍍金層，得到金納米管陣列主體；
(2)金納米柱陣列底片的制備:采用化學沉積法在模孔直徑為80-200nm的聚碳酸酯濾膜模板上沉積金，通過控制沉積時間，使模孔中充滿實心的金納米柱，得到金納米柱陣列底片;
(3)金納米井陣列陣列電極的組裝:而后將得到的金納米柱陣列底片下表面通過導電膠粘結固定在集電體上，金納米管陣列主體平鋪覆蓋在金納米柱陣列底片上，周邊用絕緣膠帶密封固定在集電體上，制成金納米井陣列電極；
(4)定向蛋白A自組裝修飾金納米井陣列電極的制備:在金納米管陣列電極表面滴加50yL 0.2mg/mL的蛋白A溶液，恒溫25-30 °C，反應時間為50_60min，得到蛋白A/金納米井陣列電極；
(5 )抗體的固定:將步驟(4)得到的蛋白A/金納米井陣列電極放入1.2 mg/mL的無標記AFBl抗體溶液中，恒溫25-30 °C，反應時間為50_60min，制成AFBl抗體/蛋白A/金納米井陣列電極；
(6)封閉:將步驟(5)得到的電極浸入到3%小牛血清溶液中，封閉非活性位點，恒溫25-30 °C，時間為50-60min，得到AFBl免疫反應電極。
[0012]本發明上述黃曲霉毒素BI金納米井陣列免疫電極的制備方法，具體步驟是:
(I)納米管陣列主體的制備:
a.首先將模孔直徑為400-800nm的聚碳酸酯濾膜固定在非金屬片或非金屬夾板上，放入甲醇中浸泡清洗5分鐘，輔以超聲波處理；
b.將甲醇浸泡清洗后的聚碳酸酯濾膜放入含有SnCl2XF3COOH的甲醇和水混合液中進行敏化前處理，所述敏化混合液為SnCl2 0.026M，CF3COOH 0.051，體積比1:1 (v/v)的甲醇和水混合液，溫度為常溫，時間為40-60 min；
c.將敏化并清洗后的聚碳酸酯濾膜放入銀的含量為0.04M的銀氨溶液中進行預鍍銀；
d.將預鍍銀并清洗后的聚碳酸酯濾膜放入鍍金溶液中進行化學鍍，所述鍍金溶液的主要組成和鍍金工藝為:Na3Au(S03)2 0.006M ；Na2SO3 0.08M;甲醛 0.04Μ;ρΗ值 9.50-10.50；溫度:2-5°C;時間:16-26 h；
e.將化學鍍后的聚碳酸酯濾膜在20-25%HNO3水溶液中浸泡12小時，再用水清洗；
f.去除上述處理后的聚碳酸酯濾膜一面的鍍金膜，露出金納米管端口，在150°C的烘箱中加熱20分鐘，消除濾孔模孔中金納米管和聚碳酸酯濾膜之間的空隙，金納米管的壁厚為50-200nm ；得到金納米管陣列。
[0013](2)金納米柱陣列底片的制備:
a.將模孔直徑為80-200nm的聚碳酸酯濾膜固定在非金屬片或非金屬夾板上，放入甲醇中浸泡清洗5分鐘，輔以超聲波處理；
b.將甲醇浸泡清洗后的聚碳酸酯濾膜放入含有SnCl2XF3COOH的甲醇和水混合液中進行敏化前處理，所述敏化混合液為SnC12 0.026M，CF3C00H 0.05M，體積比1:1 (v/v)的甲醇和水混合液，溫度為常溫，時間為40-60 min ；
c.將敏化并清洗后的聚碳酸酯濾膜放入銀的含量為0.04M的銀氨溶液中進行預鍍銀；
d.將預鍍銀并清洗后的聚碳酸酯濾膜放入鍍金溶液中進行化學鍍，所述鍍金溶液的主要組成和鍍金工藝為:Na3Au(SO3)2 0.005-0.05M；Na2SO3 0.01-0.1M;甲醛 0.3_0.8M;pH值9.50?10.50;溫度:2-8 °C;時間:12-24 h；
e.將化學鍍后的聚碳酸酯濾膜在20-25%HNO3水溶液中浸泡12小時，再用水清洗；
f.在150°C的烘箱中加熱20分鐘，消除濾孔中金納米線和聚碳酸酯濾膜之間的空隙，得到金納米柱陣列。
[0014](3)電極的組裝:
將上述制備得到的金納米柱陣列底片下表面粘在導電鋁雙面膠帶上，導電鋁雙面膠帶的另一面粘在作集電體的金屬銅片上，金納米管陣列主體平鋪覆蓋在金納米柱陣列底片上，可根據測量需要，金納米管陣列主體的上表面留出一定的面積后，其余部分用絕緣膠帶密封并固定在集電體上，制成金納米井陣列電極。這樣可以保證將電極放入溶液中時，只有未密封的那部分金納米管陣列產生電化學響應信號。
[0015](4)定向蛋白A自組裝修飾金納米井陣列電極的制備:在金納米管陣列電極表面滴加50yL 0.2mg/mL的蛋白A溶液，恒溫25-30 °C，反應時間為50_60min，得到蛋白A/金納米井陣列電極。
[0016](5)抗體的固定:將步驟(4)得到的蛋白A/金納米井陣列電極放入1.2 mg/mL的無標記AFBl抗體溶液中，恒溫25-30 °C，反應時間為50_60min，制成AFBl抗體/蛋白A/金納米井陣列電極。
[0017](6)封閉:將步驟(5)得到的電極浸入到3%小牛血清溶液中，封閉非活性位點，恒溫25-30 °C，時間為50-60min，得到AFBl免疫反應電極。
[0018]本發明所述金納米管陣列主體通過金納米柱陣列底片連接固定在集電體上，在金納米管陣列主體底部形成同材質的井底。本發明基礎電極金納米井陣列電極的優點和效果是:(I)具有三維結構，表面積更大，其中金納米管內表面不僅具有納米材料的表面效應、體積效應、量子尺寸效應等納米材料的特質，還可以通過自組裝及化學等修飾方法進行功能化設計，構建納米組裝電極體系，實現檢測體系的微型化和集成化。該電極在電化學生物傳感器領域具有特殊的優勢。(2)制作簡單，穩定性高，成本低。金納米管陣列的管壁厚度和內徑大小可通過化學沉積時間控制，而且，由于管壁包埋在聚碳酸酯濾膜中，結構穩定，強度好，有效地保證了產品的穩定性。(3)金納米柱陣列底片形成的井底與金納米管陣列形成的井壁為同材質，金納米管陣列主體和金納米柱陣列底片二者之間可以無縫疊加，接觸面都為金，接觸良好。能有效避免不同材質所導致的電化學響應信號的干擾。
[0019]本發明直接在其井壁和井底表面通過自組裝固定蛋白A，使抗體的抗原結合位點Fab段得到充分的暴露，并有效降低抗體與抗原結合的空間阻力，較好地保持其空間構象，提高固相抗體的特異性和利用率，提高了傳感器的靈敏度。制備的無標記免疫反應電極不需要對抗原或抗體進行標記，能直接測定抗原抗體復合物形成時氧化還原化學反應的變化，簡化制備和操作過程，有效地提高分析速度，降低分析成本。進行測量時，將免疫電極放至一系列不同濃度的得出抗原的定量關系溶液中，在25°C下進行免疫反應60 min后，在2mmol/L K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6+PBS(pH=7.00)中進行電化學阻抗譜測量，采用阻抗譜擬合軟件ZsimpWin對傳感器與不同濃度抗原免疫反應后的阻抗譜進行擬合計算，得到在一定濃度下的工作曲線。該方法的檢測限可達到1.0X 10—1(3 g/mL。遠低于歐盟的檢出限量2ng/g。
[0020]本發明制作簡單、成本低，具有三維結構，表面積大，抗體固定牢固有效，抗體的特異性和利用率大大提高，性能穩定可靠，有效避免不同材質導致的電化學響應信號的干擾，可實現AFBl的快速靈敏檢測。
【主權項】
1.一種黃曲霉毒素BI金納米井陣列免疫電極的制備方法，其特征在于:其包括以下步驟: (1)金納米管陣列主體的制備:首先采用化學沉積法在模孔直徑為400-800nm的聚碳酸酯濾膜模板上沉積金，模孔中沉積有金納米管，通過控制沉積時間，使模孔中沉積金納米管的壁厚為50-200nm;而后去除該聚碳酸酯濾膜上表面的鍍金層，得到金納米管陣列主體； (2)金納米柱陣列底片的制備:采用化學沉積法在模孔直徑為80-200nm的聚碳酸酯濾膜模板上沉積金，通過控制沉積時間，使模孔中充滿實心的金納米柱，得到金納米柱陣列底片; (3)金納米井陣列陣列電極的組裝:而后將得到的金納米柱陣列底片下表面通過導電膠粘結固定在集電體上，金納米管陣列主體平鋪覆蓋在金納米柱陣列底片上，周邊用絕緣膠帶密封固定在集電體上，制成金納米井陣列電極； (4)定向蛋白A自組裝修飾金納米井陣列電極的制備:在金納米管陣列電極表面滴加50yL 0.2mg/mL的蛋白A溶液，恒溫25-30 °C，反應時間為50_60min，得到蛋白A/金納米井陣列電極； (5 )抗體的固定:將步驟(4)得到的蛋白A/金納米井陣列電極放入1.2 mg/mL的無標記AFBl抗體溶液中，恒溫25-30 °C，反應時間為50_60min，制成AFBl抗體/蛋白A/金納米井陣列電極； (6)封閉:將步驟(5)得到的電極浸入到3%小牛血清溶液中，封閉非活性位點，恒溫25-.30 °C，時間為50-60min，得到AFBl免疫反應電極。
【文檔編號】G01N33/531GK105929153SQ201610263224
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年4月26日
【發明人】曹立新, 李小龍, 梁晨希, 王凱, 劉海萍
【申請人】哈爾濱工業大學（威海）